實(shí)驗(yàn)6植物體內(nèi)硝酸還原酶活力的測定

1、實(shí)驗(yàn) 6 植物體內(nèi)硝酸還原酶活力的測定   硝酸還原酶（ nitrate reductase,NR ），是植物氮素同化的關(guān)鍵酶，它催化植物體內(nèi)的硝酸鹽還原為亞硝酸鹽（ NO 3 +NADH+H NO 2 +NAD +H 2 O ）。產(chǎn)生的亞硝酸鹽與對氨基苯磺酸（或?qū)?氨基苯磺酰胺）及 - 萘胺（或萘基乙烯二胺）在酸性條件下定量生成紅色偶氮化合物。其反應(yīng)如下：       生成的紅色偶氮化合物在 540 nm 有最大吸收峰，可用分光光度法測定。硝酸還原酶活性可由產(chǎn)生的亞硝態(tài)氮的量表示。一般單位鮮重以 N g （ g · h ）為單位。 NR 的測

2、定可分為活體法和離體法。活體法步驟簡單，適合快速、多組測定。離體法復(fù)雜，但重復(fù)性較好。 離體法 二、實(shí)驗(yàn)材料、試劑與儀器設(shè)備 （一）實(shí)驗(yàn)材料 水稻、小麥葉片、幼穗等。 （二）試劑 1 亞硝酸鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液：準(zhǔn)確稱取分析純 NaNO 2 0.9857 g 溶于無離子水后定容至 1000 mL ，然后再吸取 5 mL 定容至 1000 mL ，即為含亞硝態(tài)氮的 1 g mL 的標(biāo)準(zhǔn)液。 2 0.1 mol/L pH 7.5 的磷酸緩沖液： Na 2 HPO 4 · 12H 2 O 30.0905 g 與 NaH 2 PO 4 · 2H 2 O 2.4965 g 加無離子水溶解后定容

3、至 1000 mL 。 3 1 磺胺溶液： 1.0 g 磺胺溶于 100 mL 3mol/L HCl 中（ 25 mL 濃鹽酸加水定容至 100 mL 即為 3 mol/L HCl ）。 4 0.02 萘基乙烯胺溶液： 0.0200 g 萘基乙烯胺溶于 100 mL 無離子水中，貯于棕色瓶中。 5 0.1 mol/L KNO 3 溶液： 2.5275 g KNO 3 溶于 250 mL 0.1 mol/L pH7.5 的磷酸緩沖液。 6 0.025 mol/L pH8.7 的磷酸緩沖液： 8.8640 g Na 2 HPO 4 · 12H 2 O ， 0.0570 g K 2 HPO

4、 4 · 3H 2 O 溶于 1000 mL 無離子水中。 7 提取緩沖液： 0.1211 g 半胱氨酸、 0.0372 g EDTA 溶于 100 mL 0.025 mol L pH 8.7 的磷酸緩沖液中。 8 2 mg/mL NADH 溶液： 2 mg NADH 溶于 1 mL 0.1 mol/L pH 7.5 磷酸緩沖液中（臨用前配制）。 （三）儀器設(shè)備 冷凍離心機(jī)，分光光度計(jì)，天平（感量 0.1 mg ），冰箱，恒溫水浴，研缽，剪刀，離心管，具塞試管，移液管，洗耳球。 三、實(shí)驗(yàn)步驟 1. 標(biāo)準(zhǔn)曲線制作 取 7 支潔凈烘干的 15 mL 刻度試管按表 11 1 順序加入試劑，

5、配成 0 2.0 g 的系列標(biāo)準(zhǔn)亞硝態(tài)氮溶液。搖勻后在 25 下保溫 30 min ，然后在 540 nm 下比色測定。以亞硝態(tài)氮（ g ）為橫坐標(biāo)（ x ），吸光度值為縱坐標(biāo)（ y ）建立回歸方程。   表 11-1 制作標(biāo)準(zhǔn)曲線時各溶液加入量 試 劑 管 號 1 2 3 4 5 6 7 亞硝酸鈉標(biāo)準(zhǔn)液（ mL ） 0.0 0.2 0.4 0.8 1.2 1.6 2.0 蒸餾水（ mL ） 2.0 1.8 1.6 1.2 0.8 0.4 0.0 1 磺胺（ mL ） 4 4 4 4 4 4 4 0.02 萘基乙烯胺（ mL ） 4 4 4 4 4 4 4 每管含亞硝態(tài)氮（ g ）

6、0 0.2 0.4 0.8 1.2 1.6 2.0   2. 樣品中硝酸還原酶活力測定 （ 1 ）酶的提取 稱取 0.5g 鮮樣，剪碎于研缽中置于低溫冰箱冰凍 30 min ，取出置冰浴中加少量石英砂及 4 mL 提取緩沖液，研磨勻漿，轉(zhuǎn)移于離心管中在 4 、 4000 r/min 下離心 15 min ，上清液即為粗酶提取液。 （ 2 ）酶的反應(yīng) 取粗酶液 0.4 mL 于 10 mL 試管中，加入 1.2 mL 0.1 mol/L KNO 3 磷酸緩沖液和 0.4 mL NADH 溶液，混勻，在 25 水浴中保溫 30 min ，對照不加 NADH 溶液，而以 0.4 mL 0.

7、1 mol/L pH 7.5 磷酸緩沖液代替。 3 終止反應(yīng)和比色測定 保溫結(jié)束后立即加入 1 mL 磺胺溶液終止酶反應(yīng)，再加 1 mL 萘基乙烯胺溶液，顯色 15 min 后于 4000 r/min 下離心 5 min ，取上清液在 540 nm 下比色測定吸光度。根據(jù)回歸方程計(jì)算出反應(yīng)液中所產(chǎn)生的亞硝態(tài)氮總量（ g ）。 四、結(jié)果計(jì)算 單位鮮重樣品中硝酸還原酶活性 = g （ g · h ） 式中： X 反應(yīng)液酶催化產(chǎn)生的亞硝態(tài)氮總量， g 。 V l 提取酶時加入的緩沖液體積， mL 。 V 2 酶反應(yīng)時加入的粗酶液體積， mL 。 W 樣品鮮重， g 。 t 反應(yīng)時間， h

8、。 活 體 法 一、實(shí)驗(yàn)材料、試劑與儀器設(shè)備 （一）實(shí)驗(yàn)材料 植物的新鮮葉片（豌豆、王米、小麥、大豆等）。 （二）試劑 1. 1% 磺胺試劑： 1.0 g 磺胺溶于 100 mL 3mol/L HCl 中（ 25 mL 濃鹽酸加水定容至 100 mL 即為 3 mol/L HCl ）。 2. - 萘胺試劑：稱取 - 萘胺 0.2 g ，用含 1 mL 濃鹽酸的蒸餾水溶解，再用蒸餾水稀釋至 100 mL 。 3. NaNO 2 標(biāo)準(zhǔn)液：稱取 0.1 g NaNO 2 ，用蒸餾水溶解，定容至 100 mL 。之后，再吸出 5mL ，用蒸餾水稀釋至 1000 mL 。此液每毫升含有 5 g NaNO

9、 2 ，用時再稀釋。 4. 0.2 mol/L KNO 3 ：稱取 KNO 3 2.002 g ，用蒸餾水溶解，移入 100 mL 容量瓶中，用水定容至刻度，搖勻。 5. 0.1 mol/L 磷酸緩沖液， pH7.5 。 （三）儀器設(shè)備 三角瓶 50mL ，打孔器（直徑 0.5 cm ），真空泵，溫箱，分光光度計(jì)，移液管 5mL 3 個， 1 mL 2 個， 2 mL 2 個，臺天平 1 臺。 二、實(shí)驗(yàn)步驟 1. 繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線 （ 1 ）把每毫升含有 5 g 的 NaNO 2 標(biāo)準(zhǔn)液稀釋成每毫升含有 0.5 ， 1.0 ， 2.0 、 3.0 、 4.0 g NaNO 2 溶液。 （ 2 ）取

10、 6 支試管， 1 支裝入蒸餾水 1 mL ，另 5 支分別裝入上述不同濃度的 NaNO 2 溶液 1 mL ，然后向每支試管里加入磺胺試劑 2 mL 及 - 萘胺試劑 2 mL ，搖勻，在 25 30 條件下保溫 1 h ，冷卻后于分光光度計(jì)在 540 nm 波長下比色，讀出光密度。以光密度為縱坐標(biāo)， NaNO 2 濃度為橫坐標(biāo)，繪制出標(biāo)準(zhǔn)曲線。 2. 樣品的測定 （ 1 ）從田間取回新鮮葉片（豌豆取苗期葉片，高梁取籽粒灌漿期葉片，或取其它葉片均可），用水洗凈，吸干水份，用打孔器打出直徑 0.5 cm 的葉圓片，用蒸餾水沖洗葉圓片 1 2 次，用吸水紙把水吸干后，于臺天平上稱取等重葉圓片兩份

11、，每份重 0.5 g 。 （ 2 ）取 2 個 50 mL 三角瓶，分別裝入下列溶液： 0.1 mol/L 磷酸緩沖液（ pH 7.5 ） 5mL, 再加蒸餾水 5 mL ， 0.1 mol/L 磷酸緩沖液（ pH7.5 ） 5 mL, 加 0.2 mol/L KNO 3 溶液 5mL, 然后把三角瓶放在真空干燥器內(nèi)，接上真空泵抽氣，以排除組織間隙的氣體，使葉圓片沉于溶液中 , 以便底物溶液進(jìn)入組織（如果沒有真空泵，也可用注射器來代替，把反應(yīng)液與葉圓片一起倒入 20 mL 注射器中，用手指堵住注射器出口的小孔，然后用力拉注射器使之成為真空，如此抽氣、放氣、反復(fù)多次，也可抽掉葉圓片中的空氣，使之

12、沉于溶液中）。放氣后，把三角瓶放入 30 溫箱中，保溫 30 min 。 （ 3 ）保溫結(jié)束后，從三角瓶中，各吸取反應(yīng)液 1mL ，分別放入 2 支試管中，然后各加磺胺試劑 2 mL 及 - 萘胺試劑 2 mL ，混勻，置于 25 30 條件下反應(yīng) 1 h ，冷卻后，用分光光度計(jì)在 540 nm 波長下比色，讀出光密度，在標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出 NO 2 含量（ g/mL ）。 三、結(jié)果計(jì)算 酶活性（ g NO 2 g · h ） 式中： C 1 從標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出的 1 號三角瓶里 NO 2 含量， g/mL 。 C 2 從標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出的 2 號三角瓶里 NO 2 含量， g/mL 。 V 反應(yīng)液的總體積， mL 。 t 反應(yīng)時間， h 。 W 植物鮮重， g 。   注意事項(xiàng) 1. 硝酸還原酶容易失活，離體法測定時，操作應(yīng)迅速，并且在 4 下進(jìn)行。 2. 取樣宜在晴天進(jìn)行，讓植株充分