細(xì)胞器的分離純化實(shí)驗(yàn)學(xué)習(xí)教案

1、會(huì)計(jì)學(xué)1第一頁(yè)，共17頁(yè)。應(yīng)用范圍：應(yīng)用范圍： 1.病毒病毒(bngd)及亞細(xì)胞及亞細(xì)胞 組份組份分離分離 2.蛋白梯度分離蛋白梯度分離 3.脂蛋白分離脂蛋白分離 4.RNA梯度沉淀梯度沉淀 5.質(zhì)粒質(zhì)粒DNA提純提純 Back第1頁(yè)/共17頁(yè)第二頁(yè)，共17頁(yè)。Back第2頁(yè)/共17頁(yè)第三頁(yè)，共17頁(yè)。第3頁(yè)/共17頁(yè)第四頁(yè)，共17頁(yè)。相對(duì)(xingdu)離心力（RCF）由于轉(zhuǎn)頭有不同的制造商制造，半徑不同，故用相對(duì)(xingdu)離心力來(lái)表示離心力的大小。RCF (g) = Fc/F重力 = mG/mg = r2/g = 1.11910-5N2r =11.2r(N/1000)2也有：根據(jù)這個(gè)

2、公式，相對(duì)(xingdu)離心力（RCF）和每分鐘轉(zhuǎn)數(shù)（N）之間便可以互換，這種互換關(guān)系是很有實(shí)用價(jià)值的。Back為了為了(wi le)簡(jiǎn)便簡(jiǎn)便第4頁(yè)/共17頁(yè)第五頁(yè)，共17頁(yè)。Back勻漿勻漿(yn jin)介質(zhì)，一般為一定濃度的蔗糖溶液加介質(zhì)，一般為一定濃度的蔗糖溶液加入其它離子成分，可以維持亞細(xì)胞組分的滲透壓。入其它離子成分，可以維持亞細(xì)胞組分的滲透壓。第5頁(yè)/共17頁(yè)第六頁(yè)，共17頁(yè)。臺(tái)式高、臺(tái)式高、超速離心超速離心機(jī)機(jī)0.6-10萬(wàn)萬(wàn)rpm離心機(jī)離心機(jī)制備制備(zhbi)性性分析分析(fnx)性性分析分析(fnx)性超速離心性超速離心機(jī)機(jī)普通離心機(jī)普通離心機(jī)冰凍離心機(jī)冰凍離心機(jī)臺(tái)式（

3、或臺(tái)式（或地面式）地面式）普通離心普通離心機(jī)機(jī)大容量冰凍大容量冰凍離心機(jī)離心機(jī)小于小于0.6萬(wàn)萬(wàn)rpm高速冰凍高速冰凍離心機(jī)離心機(jī)0.6-2.5萬(wàn)萬(wàn)超速冰凍超速冰凍離心機(jī)離心機(jī)2.5-8萬(wàn)或萬(wàn)或更高更高( (分析性超速離心主要用于檢測(cè)分析性超速離心主要用于檢測(cè)大分子物質(zhì)的沉降特征和結(jié)構(gòu)等大分子物質(zhì)的沉降特征和結(jié)構(gòu)等) )概述概述Back ！第6頁(yè)/共17頁(yè)第七頁(yè)，共17頁(yè)。離心機(jī)一般由離心機(jī)主機(jī)，轉(zhuǎn)頭離心機(jī)一般由離心機(jī)主機(jī)，轉(zhuǎn)頭(zhun tu)，離心管三部，離心管三部分組成。分組成。Back第7頁(yè)/共17頁(yè)第八頁(yè)，共17頁(yè)。一般一般(ybn)制備離制備離心心 一般制備離心是指在分離、濃縮、提

4、純樣品中，不必制備密度梯度的一次完成的離心操作，實(shí)驗(yàn)室用低、高速離心機(jī)可應(yīng)用(yngyng)于此項(xiàng)技術(shù)。臺(tái)式或地面臺(tái)式或地面(dmin)式普通式普通離心機(jī)離心機(jī)Back第8頁(yè)/共17頁(yè)第九頁(yè)，共17頁(yè)。高速(o s)冰凍離心機(jī)Back第9頁(yè)/共17頁(yè)第十頁(yè)，共17頁(yè)。缺點(diǎn)是：分離效果差，不能一次缺點(diǎn)是：分離效果差，不能一次得到純顆粒；壁效應(yīng)嚴(yán)重，特得到純顆粒；壁效應(yīng)嚴(yán)重，特別是當(dāng)顆粒很大或濃度很高時(shí)，別是當(dāng)顆粒很大或濃度很高時(shí)，在離心管一側(cè)會(huì)出現(xiàn)沉淀；顆在離心管一側(cè)會(huì)出現(xiàn)沉淀；顆粒被擠壓，離心力過(guò)大、離心時(shí)粒被擠壓，離心力過(guò)大、離心時(shí)間過(guò)長(zhǎng)會(huì)使顆粒變形、聚集而失間過(guò)長(zhǎng)會(huì)使顆粒變形、聚集而失活。

5、活。細(xì)胞器沉降順序(shnx)依次為：核、線粒體、溶酶體與過(guò)氧化物酶體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)與高基體、核蛋白體。差速離心法：差速離心法：第10頁(yè)/共17頁(yè)第十一頁(yè)，共17頁(yè)。Low speedHigh speed差數(shù)(ch sh)離心法Back第11頁(yè)/共17頁(yè)第十二頁(yè)，共17頁(yè)。密度梯度離心法： 用具有梯度的介質(zhì)來(lái)替換離心管中密度均一的介質(zhì)，使介質(zhì)分為不同的層次，濃度低的在上層，高的在底層。細(xì)胞勻漿加在最上層，隨后離心。這樣，不同大小、形態(tài)、密度的顆粒，就會(huì)以不同的速度向下移動(dòng)，擊中到不同的區(qū)域，可以分別收集。該法的優(yōu)點(diǎn)是：分離效果好，可一次獲得較純顆粒；適應(yīng)范圍廣，既能分離具有沉淀系數(shù)差的顆粒，又能分離

6、有一定浮力密度的顆粒；顆粒不會(huì)積壓變形，能保持顆?；钚?，并防止已形成的區(qū)帶由于對(duì)流(duli)而引起混合。缺點(diǎn)： 離心時(shí)間較長(zhǎng)；需要制備梯度；操作嚴(yán)格，不宜掌握。 Back第12頁(yè)/共17頁(yè)第十三頁(yè)，共17頁(yè)。 將離心機(jī)轉(zhuǎn)數(shù)換算為相對(duì)離心力時(shí)，首 先 ， 在 r 標(biāo) 尺(bioch)上取已知的半徑 和 在 N 標(biāo) 尺(bioch)上取已知的離心機(jī)轉(zhuǎn)數(shù)。然后，將這兩點(diǎn)間劃一條直線，在圖中間 RCF標(biāo)尺(bioch)上的交叉點(diǎn)即為相應(yīng)的相對(duì)離心力數(shù)值。注意，若已知的轉(zhuǎn)數(shù)值處于 N 標(biāo)尺(bioch)的右邊，則應(yīng)讀取 RCF 標(biāo)尺(bioch)右邊的數(shù)值；同樣，轉(zhuǎn)數(shù)值處于 N 標(biāo)尺(bioch)左邊

7、，則讀取 RCF標(biāo)尺(bioch)左邊的數(shù)值。半徑半徑(bnjng)相對(duì)相對(duì)(xingdu)離心力離心力轉(zhuǎn)速轉(zhuǎn)速方法：方法：兩點(diǎn)一兩點(diǎn)一線法線法Back第13頁(yè)/共17頁(yè)第十四頁(yè)，共17頁(yè)。c）樣品應(yīng)預(yù)先平衡，使用離心機(jī)微）樣品應(yīng)預(yù)先平衡，使用離心機(jī)微量離心時(shí)離心套管與樣品應(yīng)同時(shí)平量離心時(shí)離心套管與樣品應(yīng)同時(shí)平衡。衡。d）揮發(fā)性或腐蝕性液體離心時(shí)，應(yīng)）揮發(fā)性或腐蝕性液體離心時(shí)，應(yīng)使用帶蓋的離心管，并確保液體不使用帶蓋的離心管，并確保液體不外漏以免侵蝕機(jī)腔或造成事故。外漏以免侵蝕機(jī)腔或造成事故。e）每次操作完畢，應(yīng)做好使用情況）每次操作完畢，應(yīng)做好使用情況記錄，應(yīng)定期對(duì)機(jī)器各項(xiàng)性能進(jìn)行記錄，應(yīng)定期對(duì)機(jī)器各項(xiàng)性能進(jìn)行檢修。檢修。f）離心過(guò)程中若發(fā)現(xiàn)異?，F(xiàn)象，應(yīng)）離心過(guò)程中若發(fā)現(xiàn)異常現(xiàn)象，應(yīng)立即關(guān)閉電源，報(bào)請(qǐng)有關(guān)技術(shù)人員立即關(guān)閉電源，報(bào)請(qǐng)有關(guān)技術(shù)人員檢修。檢修。Back第14頁(yè)/共17頁(yè)第十五頁(yè)，共17頁(yè)。度度第15頁(yè)/共17頁(yè)第十六頁(yè)，共17頁(yè)。3000rpm離心離心5min，所得的沉淀，所得的沉淀是葉綠體是葉綠體4用用0.35mol/L NaC