實(shí)驗(yàn)一、骨髓瘤細(xì)胞的培養(yǎng)

1、實(shí)驗(yàn)一、骨髓瘤細(xì)胞的培養(yǎng)骨髓瘤細(xì)胞系應(yīng)和免疫動物屬于同一品系， 這樣雜交融合率高， 也便于接種雜交瘤細(xì)胞 在同一品系小鼠腹腔內(nèi)產(chǎn)生大量 McAb。常用骨髓瘤細(xì)胞系有： NS1、SP20、 X63 等。骨髓瘤細(xì)胞的培養(yǎng)適合于一般的培養(yǎng)液，如RPMI1640， DMEM培養(yǎng)基。小牛血清的濃度一般在 1020，細(xì)胞的最大密度不得超 106ml，一般擴(kuò)大培養(yǎng)以 12稀釋傳代，每 2 3 天傳代一次。細(xì)胞的倍增時間為16 20 小時，上述三株骨髓瘤細(xì)胞系均為懸浮或輕微貼壁生長，只用彎頭滴管輕輕吹打即可懸起細(xì)胞。二 材料：1. 試劑：（ 1 ）培養(yǎng)基 雜交瘤技術(shù)中使用的細(xì)胞培養(yǎng)基主要有 RPMI-1640

2、 或 DMEM（ Dulberco Modified Eagles Medium）兩種基礎(chǔ)培養(yǎng)基，具體配置方法按廠家規(guī)定的程序，配好后過濾 除菌（濾膜），分裝， 4保存。不完全 RPMI-1640培養(yǎng)基：RPMI-1640培養(yǎng)基原液 96ml,100 × .溶液 1ml，雙抗溶液 1ml，% NaHCO3溶液 1-2ml ，HEPES溶液 1ml。不完全 DMEM培養(yǎng)基： DMEM 13.37g,超純水或四蒸水 980ml ，NaHCO3 3.7g ，100×. 溶液 10ml，雙抗溶液 10ml，% NaHCO3溶液 1-2ml ，用 1N HCl 調(diào)試 pH至，過濾除菌

3、，分裝 4保 存。完全 RPMI-1640 或 DMEM培養(yǎng)基：不完全 RPMI-1640 或 DMEM培養(yǎng)基 80ml，滅活小牛血 清 15-20ml ，用于骨髓瘤細(xì)胞 SP2/0 和建株后雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)。（ 2）小牛血清滅活：從 -20 冰箱取出小牛血清，室溫自然融化，56 30min 即可充分滅活，分裝小瓶（ 5ml/ 瓶），-20 凍存?zhèn)溆?，盡量避免反復(fù)凍融。（ 3）青、鏈霉素（雙抗）溶液（ 100 ×）取青霉素 G（鈉鹽） 100 萬單位和鏈霉素（硫酸 鹽） 1g或100萬單位，溶于 100ml滅菌超純水或四蒸水中，分裝小瓶（ 4-5ml/ 瓶）， -20 凍存。2. 器材

4、 ：超凈工作臺、 CO2 恒溫培養(yǎng)箱、普通冰箱、電子天平，藥物天平、巴氏吸管、10ml 吸管、100ml 細(xì)胞培養(yǎng)瓶、滴管、滅菌小瓶等三 方法 ：細(xì)胞凍存及復(fù)蘇先用 24 孔細(xì)胞培養(yǎng)板擴(kuò)大骨髓瘤細(xì)胞或單克隆抗體細(xì)胞株， 當(dāng)長滿時， 再擴(kuò)大到 100ml 細(xì)胞瓶。當(dāng)其處于對數(shù)生長期時，將細(xì)胞洗下，用細(xì)胞凍存液（含10 DMS，O 40FCS的DMEM培養(yǎng)基）將細(xì)胞懸浮，調(diào)配成 1-3 ×106 個/ml, 每個細(xì)胞凍存管分裝 1ml，移至液氮罐 口懸吊 2 小時或 -70 冰箱過夜，然后沉入液氮中。復(fù)蘇時，從液氮中取出凍存管后迅速置 入 40水浴中，在 1min 內(nèi)融化， 1500rp

5、m 離心 5min ，棄上清，用少量完全培養(yǎng)基輕輕懸浮 細(xì)胞，移入 24 孔板中培養(yǎng) 。四、細(xì)胞培養(yǎng)應(yīng)注意事項1. 細(xì)胞培養(yǎng)瓶、吸管：使用前要嚴(yán)格消毒，對于新購置或已經(jīng)使用的玻璃器皿，一般先用 先用%新潔而滅浸泡 24小時，再用自來水清洗，晾干，然后放置酸缸浸泡 24 小時，帶膠手 套，撈起，用自來水將酸液沖洗干凈（一般沖洗 8-10 次），用去離子水浸泡 12 小時，再用 超純水浸泡 12 小時， 撈起烘干， 細(xì)胞瓶用錫鉑紙包扎瓶口，吸管塞上綿花， 裝入吸管桶內(nèi)， 165.5 干熱滅菌 2-3 小時，待冷卻后，轉(zhuǎn)入消毒柜里備用。2. 培養(yǎng)基：大多數(shù)實(shí)驗(yàn)室采用的基礎(chǔ)培養(yǎng)基是DMEM或 RPMI

6、-1640，按廠家規(guī)定的方法配制一般不會出問題。 但是配制培養(yǎng)基的水的質(zhì)量和血清添加成分是影響融合最重要的培養(yǎng)基素 因各地水質(zhì)差異很大， 所以至少應(yīng)用三蒸水或四蒸水， 并定期檢查制成的純水質(zhì)量。 國內(nèi)實(shí) 驗(yàn)室大多采用新生犢牛血清配制培養(yǎng)基， 不同來源和不同批次的血清支持雜交瘤生長的差異 很大，應(yīng)篩選出好的血清供作配制融合后選擇性培養(yǎng)的HAT培養(yǎng)基。準(zhǔn)備重組藥物的實(shí)驗(yàn)：1、配制 AMP+ LB固體培養(yǎng)基 600ml，倒 AMP+ LB平皿 20 個2、AMP+ LB 液體培養(yǎng)基 400ml 3、空的試管 20 支4、EP 管 1 盒將以上滅菌。附： LB 培養(yǎng)基配方：胰蛋白胨 (Tryptone) 10g/L酵母提取物 (Yeast extract) 5g/L氯化鈉 (NaCl) 10g/L另外根據(jù)經(jīng)驗(yàn)值用 5mol/LNaOH 調(diào)節(jié)該培養(yǎng)基的 pH，使其達(dá)到。LB固體培養(yǎng)基 1L和液體一樣，加 15g 瓊脂粉，一定要在溫度降下之前加好抗生素，并 且倒好板。LB固體培養(yǎng)基倒板 配制： 100ml LB 培養(yǎng)基加入 1.5g 瓊脂粉 抗生素的加入：高壓滅菌后，將融化的 LB 固體培養(yǎng)基置與 55 的水浴中，待培養(yǎng) 基溫度降到 55時(手可觸摸)加入抗生素，以免溫度過高導(dǎo)致抗