細胞生物學標書

1、 xxxxxx 大學 xxxx 學院學生細胞生物學課題項目申請書 項目名稱： 項目技術(shù)負責人： 項目申請單位： 學院：班級：姓名：學號： 一、立項的背景和意義 心血管流行病學調(diào)查顯示，盡管近30年來心血管病死亡率除東歐各國外的大多數(shù)國家都有不同程度的下降，但其仍是多數(shù)國家45歲以上男性第一位的死亡原因，在女性則是僅次于腫瘤的第二位死因，嚴重影響著人類的期望壽命和生存質(zhì)量（資料來源：世界衛(wèi)生組織衛(wèi)生統(tǒng)計年報，1993年日內(nèi)瓦）。我國已進入老齡化社會，是世界上老年人口最多的國家，預計到本世紀中葉，老年人口將達到4億。同時隨著人們生活水平的不斷提高、膳食不當、生活習慣和外部環(huán)境等多種因素，近年來心血

2、管疾病已成為我國發(fā)病率和死亡率高居第一的疾病1，嚴重影響著人們的生命健康，其發(fā)病及防治受到全社會的極大關注。二、國內(nèi)外研究現(xiàn)狀和發(fā)展趨勢近年來，分子生物學和細胞生物學的研究成果促使心血管藥理學內(nèi)容日新月異地更新，對心血管病癥的研究相對成熟，大部分心血管相關基因研究比較清楚，藥物的作用靶點也相對明確2.而我國傳統(tǒng)中藥丹參及其復方在治療冠心病、動脈粥樣硬化方面以其療效確切、副作用小、安全、經(jīng)濟等優(yōu)點，成為臨床最常用的治療血瘀癥冠心病中藥。丹參為唇形科多年生草本植物丹參（Salvia miltiorrhiza）的根莖，始載于神農(nóng)本草經(jīng)。丹參的化學成分目前已研究得較為系統(tǒng)，主要為共軛醌、酮類化合物，酚

3、酸類物質(zhì)，具有較廣泛的藥理的作用，其中對循環(huán)系統(tǒng)的影響研究得較多3-4，大量的藥理學研究表明，丹參具有抗心肌缺血、舒張血管、保護內(nèi)皮損傷、縮小心肌梗塞面積，抗自由基、減少缺血再灌注心肌損傷，保護心肌高能磷酸化合物等廣泛的心血管活性5。藥代動力學研究結(jié)果表明，丹參素和兒茶醛可經(jīng)肌肉和胃腸道吸收入血，隱丹參酮口服吸收較差或吸收后迅速被肝臟轉(zhuǎn)化, 一部分首先轉(zhuǎn)化為丹參酮A, 后者進一步被羥化代謝為含羥基代謝物, 并結(jié)合內(nèi)源物使極性增大而利于排出。分子藥理學的研究表明復方丹參可通過影響基因的表達調(diào)控達到治療作用，如丹參可抑制血管內(nèi)皮細胞和粒細胞表達CD11b、ICAM-1、E-selectin等粘附分

4、子6-7，抑制血管平滑肌細胞表面CD54等粘附分子表達，降低血小板膜粘附分子CD41、CD62P、和P-選擇素的表達，丹參酮可以抑制心肌細胞c-jun基因的表達等8-9。國際上對其保護心血管作用的研究亦逐漸增多；日本學者研究表明，丹參提取物可抑制血小板聚集10-11；臺灣學者近期研究表明丹參提取物對TNF-所致主動脈內(nèi)皮細胞粘附分子表達的抑制作用呈劑量依賴關系12。但丹參保護心血管作用的藥理研究仍不夠深入，尤其是其作用途徑、靶標不甚明晰。王升啟教授領導的研究組對復方丹參方保護心血管作用的分子機理以及四物湯化學成分組合補血作用及其機理研究進行了一定的探索13，并據(jù)此提出“化學基因組學”理論，認為

5、中藥復方是通過化學成分組合影響到信號分子組合，使紊亂的信號分子網(wǎng)絡恢復平衡，從而達到治療中醫(yī)的證和相關疾病的作用和效果14-15。本項研究旨在探索中藥丹參保護心血管作用的分子機理，通過化學組學、基因組學及蛋白質(zhì)組學技術(shù)發(fā)現(xiàn)其作用的“組合靶標”，在“化學基因組學”研究技術(shù)平臺層面上進行成分-靶標相互作用研究，進而驗證丹參保護心血管作用的靶標以及找到療效確切、安全經(jīng)濟的單體及其組合，為高技術(shù)含量的中藥研發(fā)、產(chǎn)業(yè)現(xiàn)代化和國際化提供一些基礎數(shù)據(jù)。三、項目主要研究開發(fā)內(nèi)容和技術(shù)關鍵1.主要研究開發(fā)內(nèi)容1.1 基于表達譜的生物信息學藥靶發(fā)現(xiàn)利用靶標相關基因芯片、蛋白質(zhì)組學和基于表達譜的生物信息學藥靶發(fā)現(xiàn)技

6、術(shù)，從血淤證模型中發(fā)現(xiàn)候選靶標。1.2 基于化學基因組學的成分-靶標相互作用研究采用實時熒光RT-PCR、WESTERN印跡等技術(shù)，在血瘀證模型（血管內(nèi)皮、平滑肌、心肌及血小板）上觀察有效單體及組合對各作用靶標及其通路和網(wǎng)絡的調(diào)控作用，初步確定各有效成分作用的靶分子及特異性；然后采用生物質(zhì)譜及親和色譜等技術(shù)，在分子水平上分析有效成分與靶分子的結(jié)合性能，從而驗證成分和靶標的可藥性；最后在動物體內(nèi)驗證有效成分（組合）對靶標（組合）作用的有效性。通過基因芯片及蛋白質(zhì)組技術(shù)實驗初篩獲得8-15個潛在靶標，并進一步通過生物信息學篩選4-5個候選靶標，結(jié)合反義及siRNA技術(shù)，對候選靶標進行特異性驗證，獲

7、得1-2個丹參有效成分的作用靶標。 針對上述靶標，研究丹參有效成分及其組合（配伍）對其表達和調(diào)控的影響，獲得成分與靶標相互作用的實驗數(shù)據(jù)。2.關鍵技術(shù)基因表達譜分析：結(jié)合生物信息學分析，篩選心血管相關基因并制備相應的表達譜分析芯片。利用該芯片研究丹參方有效成分及其組合在細胞和動物模型上對靶細胞和組織基因表達譜的影響，通過軟件分析找出差異表達基因。蛋白質(zhì)表達譜分析：將對照及模型組的蛋白質(zhì)分別進行熒光標記后，進行雙向電泳，結(jié)果用掃描儀掃描并采用蛋白質(zhì)組學分析軟件（Imagemaster 2D Elite圖象分析軟件、Imagemaster 2D Database數(shù)據(jù)庫軟件）進行分析比較，找到特異表

8、達蛋白，并對特異蛋白進一步采用質(zhì)譜分析其結(jié)構(gòu)和功能。候選靶標的生物信息學篩選：采用本室開發(fā)的基于基因表達譜的基因分類系統(tǒng)Tclass和基于表達譜的樣本類型自動識別的整合方案SamCluster進行靶標篩選和生物信息學驗證，結(jié)合功能基因組和疾病基因組研究成果，篩選出候選靶標?；诨瘜W基因組學的“成分-靶標”相互作用關系分析：根據(jù)有效成分、靶標選擇均勻、正交或析因等統(tǒng)計學方法設計實驗，并對數(shù)據(jù)以簡單相關分析、典型相關分析、多元回歸分析等多種分析方法分析“成分-靶標”相互作用關系。3.擬解決的關鍵問題3.1分子間相互作用網(wǎng)絡的構(gòu)建及基于表達譜和分子相互作用網(wǎng)絡的組合靶標篩選方法心血管疾病是研究相對成

9、熟的疾病，大部分心血管相關基因研究比較清楚、藥物作用的靶點也相對明確。我們擬基于現(xiàn)有心血管疾病相關基因及功能、生物信息學、蛋白質(zhì)/基因表達譜、酵母雙雜交及藥理學等研究基礎，參考文獻軟件及數(shù)據(jù)庫等信息資源，構(gòu)建心血管相關基因和藥物靶標的分子相互作用網(wǎng)絡。在我們原先建立的基于基因芯片表達譜聚類、分類軟件及算法的基礎上，進一步建立基于心血管疾病相關基因網(wǎng)絡的組合靶標篩選方法。3.2丹參有效成分組合的選擇：根據(jù)前期文獻及本實驗室研究工作基礎，采用丹參的有效部位丹參總酮、丹參總酚酸、丹參總提物及其主要有效成分丹參酮IIA、丹參素、丹酚酸B、原兒茶醛等幾種單體成分，分別在有效部位及有效單體兩個層次上進行正

10、交或析因設計，結(jié)合細胞、血小板聚集等高通量模型，初步篩選出其候選有效成分組合2-3組。對候選組合進一步在動物模型上進行系統(tǒng)的藥理學驗證，選出有效成分組合。該組合及其成分可以作為組合靶標的發(fā)現(xiàn)和功能驗證工具藥。3.3 有效成分-組合靶標間交互作用關系的實驗設計及學分析采用均勻、正交或析因設計、基因芯片及Western印跡研究其不同組份的有效組合對組合靶標表達的影響；采用“典型相關分析(canonical correlation analysis)”等統(tǒng)計學方法，研究各有效成分對組合靶標表達調(diào)控的協(xié)同效應四、項目預期目標A建立“化學基因組學”研究技術(shù)平臺，并據(jù)此闡明丹參保護心血管作用機理；B發(fā)表

11、3-5篇高水平SCI論文，申請1-2項專利，培養(yǎng)4-5名本科生。五、項目實施方案、技術(shù)路線、組織方式與課題分解1.項目實施方案：利用生物芯片技術(shù)結(jié)合蛋白質(zhì)組學、化學組學、生物信息學及統(tǒng)計學等技術(shù)，在分子、器官及整體水平上發(fā)現(xiàn)丹參作用的心血管疾病相關基因和蛋白表達調(diào)控靶標以及功能驗證，進一步將作用不同靶標的有效成分進行配伍，并利用上述技術(shù)平臺進行驗證，以期發(fā)現(xiàn)丹參有效成分為基礎的最佳“分子配伍”。從而實現(xiàn)多層次、多靶點、多學科地研究、闡明丹參保護心血管作用的物質(zhì)基礎及分子機制，并為探討配伍的科學內(nèi)涵提供實驗數(shù)據(jù)。1.1丹參有效成分的分子作用通路的篩選選擇丹參提取物及其有效成分，采用細胞和動物模型

12、，用基因芯片和蛋白質(zhì)組學等高通量分析技術(shù)，研究其對基因和蛋白表達譜的影響，采用生物信息學軟件(Image 4.0、Arraysight、Imagemaseter 2D Elite圖象分析軟件、Imagemaster 2D Database 數(shù)據(jù)庫軟件) 進行差異比較分析。結(jié)合表達譜數(shù)據(jù)及文獻數(shù)據(jù)庫構(gòu)建心血管相關基因網(wǎng)絡。采用開發(fā)的Tclass和Samclass進行聚類和分類分析，結(jié)合功能和疾病基因組學手段和知識篩選出丹參有效成分作用的分子作用通路。1.2丹參有效成分的分子作用通路的功能驗證對發(fā)現(xiàn)的候選組合靶標進行分析，如果是已知功能基因或蛋白質(zhì)則直接進行組合篩選；如果是新基因或蛋白質(zhì)則首先進行

13、結(jié)構(gòu)和功能研究；然后采用反義核酸、siRNA技術(shù)，RT-PCR技術(shù)，Western 印跡技術(shù)等在細胞和動物模型上對丹參有效成分的分子作用通路進行組合功能驗證。1.3丹參有效成分最佳“分子配伍”的篩選進一步用丹參有效單體的不同成分、不同劑量、不同比例的配伍依次在細胞和動物模型上對候選組合靶標進行驗證，在“化學基因組學”研究技術(shù)平臺層面上進行有效成分配伍研究，以期找到療效確切、安全經(jīng)濟的單體及其組合。2.技術(shù)路線（課題分解）：2.1 設計并制備人心血管相關芯片：根據(jù)心血管疾病相關文獻，設計并制成低密度的寡核苷酸芯片。從Cardio 數(shù)據(jù)庫(Cardiovascular Disease Relate

14、d Database )中找出大約400種心血管疾病相關基因，這些基因的人類mRNA 序列來自GenBank。 使用大規(guī)模探針設計軟件Mprobe來設計寡核苷酸探針，芯片質(zhì)控方法采用陽性對照結(jié)合看家基因和陰性對照，對逆轉(zhuǎn)錄、雜交過程進行監(jiān)測和結(jié)果分析。2.2 建立損傷的細胞模型：動脈粥樣硬化(atherosclerosis, AS)的形成涉及許多環(huán)節(jié)，包括脂質(zhì)代謝紊亂，血管內(nèi)皮細胞損傷，平滑肌細胞增殖，從中層遷移到內(nèi)膜下，單核和巨噬細胞的遷移、增生和分化，泡沫細胞的形成，細胞的壞死和脂質(zhì)沉積等。本項研究擬建立以TNF- (2ng/ml)、oxLDL (12.5g/ml)損傷的血管內(nèi)皮、平滑肌、

15、心肌及血小板模型。2.3 丹參主要單體對人血管內(nèi)皮細胞、平滑肌細胞、心肌細胞等藥理作用的篩選：選擇藥理試驗劑量范圍；凋亡保護試驗；白細胞粘附試驗；凝血纖溶物質(zhì)（PAI-1, tPA）分泌；NO分泌；內(nèi)皮素-1分泌；平滑肌細胞增殖實驗。2.4 丹參有效成分保護心血管作用的表達譜及蛋白質(zhì)組學研究： 丹參有效成分孵育內(nèi)皮細胞、平滑肌細胞等6-12小時，再以TNF-、oxLDL刺激6小時，提取細胞的RNA及總蛋白進行表達譜及蛋白質(zhì)組學研究，發(fā)現(xiàn)差異表達基因及蛋白，作為丹參有效成分的潛在靶標。2.5 丹參有效成分保護心血管作用的機理研究及靶標驗證：以反義核酸、siRNA技術(shù)，Q-RT-PCR、Weste

16、rn Blot及通路抑制劑等技術(shù)研究丹參有效成分及其組合保護心血管作用的分子機制及功能驗證。2.6 丹參有效成分保護心血管作用的動物試驗及臨床觀察：2.6.1 觀察丹參活性組分對實驗性動脈粥樣硬化家兔的治療作用。雄性新西蘭兔高血脂飼養(yǎng)1216周形成實驗性的動脈粥樣硬化，給予高脂飲食同時給予丹參活性成分，4，8，12，16周末采血檢測血流變、血脂情況，于16周時處死，測定血脂變化TC、TG、LDL-C，血清和血管壁中NO和ET1的含量變化。測定頸動脈受損內(nèi)皮細胞黏附因子VCAM1的變化。與陽性對照藥復方丹參方及辛伐他汀比較。2.6.2 觀察丹參活性組分對實驗性高血脂癥家兔的治療作用。雄性新西蘭兔

17、高血脂飼養(yǎng)2周形成實驗性的高血脂癥，然后分組連續(xù)給予高脂飲食和丹參活性成分，4周后高脂給量減半，繼續(xù)給予丹參動脈粥樣硬化活性成分至6周，測定給藥后4和6周時的血脂變化TC、TG、LDL-C，血清和血管壁中NO和ET1的含量變化。測定頸動脈受損內(nèi)皮細胞黏附因子VCAM的變化。與陽性對照藥復方丹參方及辛伐他汀比較。2.6.3 觀察丹參活性組分對大鼠缺血再灌注(Ischemic reperfusion injury，IRI)的影響，對血栓烷2和前列環(huán)素(TXA2/PGI2)比值的調(diào)節(jié)作用，以及一氧化氫(NO)、內(nèi)皮素(ET1)、纖維蛋白原(Fig)水平，改善血液流變性等作用，改善的病理生理。與陽性藥

18、物復方丹參方比較。2.6.4 觀察丹參活性組分對高黏滯血癥家兔和急性高黏滯血癥模型大鼠血管內(nèi)皮分泌功能的影響，采用復合因素（高分子右旋糖酐、腎上腺素、牛血清白蛋白）、長時間(11d)造成高黏滯血癥慢性模型；采用次性靜脈注射高分子右旋糖酐，皮下注射腎上腺素造成急性高黏滯血癥模型。分別用丹參活性組分進行治療，觀察血管內(nèi)皮細胞分泌功能的變化及丹參活性組分的干預效果。檢測指標：紅細胞變形能力, 紅細胞比容、紅細胞聚集指數(shù), 紅細胞電泳時間；血液流變性；全血比黏度、血漿纖維蛋白原；血小板聚集和黏附性及TXB2、6KetoPGF1的含量的影響；血管細胞黏附因子VCAM、ICAM、ESLECTIN的表達。陽

19、性藥物為復方丹參方和阿司匹林。2.6.5 在臨床上選擇高血脂癥患者，中醫(yī)診斷符合血瘀證標準的患者，觀察經(jīng)丹參注射液治療后血脂、血流變，血清NO和ET1含量的變化，以及頸動脈斑塊面積的變化。陽性對照藥物為復方丹參方和辛伐他汀。技術(shù)路線：2.1基于表達譜的生物信息學藥靶發(fā)現(xiàn)：加藥后加藥前血瘀證細胞/組織/血清丹參有效成分藥靶基因芯片潛在藥靶基因基因/蛋白質(zhì)表達譜分析蛋白質(zhì)組學技術(shù)候選靶標基于表達譜的生物信息學分析干預2.2基于化學基因組學的成分-靶標相互作用研究血瘀癥動物模型（實驗性動脈粥樣硬化家兔，實驗性高血脂癥家兔，大鼠缺血再灌注）血瘀癥細胞模型（血管內(nèi)皮細胞，平滑肌細胞，心肌細胞）丹參有效成

20、分及其組合潛在藥靶（受體、激酶、信號分子等）病理組織檢查生化指標（血脂變化TC、TG、LDL-C，血清和血管壁中NO和ET1的含量變化）信號通路和藥理學驗證（Q-RT-PCR，Western Blot，Elisa，etc.）丹參保護心血管作用的靶標丹參有效成分作用于血瘀型冠心病模型，采用基因芯片和蛋白質(zhì)組技術(shù)分析其對基因和蛋白表達譜的影響，找出差異基因及蛋白質(zhì)，并通過PR-PCR、Western印跡等技術(shù)進行驗證，發(fā)現(xiàn)該成分保護心血管的分子作用通路。進一步用丹參有效成分的不同成分、不同劑量、不同比例的組合依次在細胞和動物模型上對候選組合靶標進行驗證，在“化學基因組學”研究技術(shù)平臺層面上進行成分

21、-靶標相互作用研究，進而驗證丹參保護心血管作用的組合靶標以及找到療效確切、安全經(jīng)濟的單體及其組合。六、計劃進度安排2013.6-2013.12：丹參有效成分作用靶標的篩選及生物信息學驗證。通過基因芯片及蛋白質(zhì)組技術(shù)初篩得到8-15個潛在靶標，并進一步通過生物信息學篩選4-5個候選靶標。2014.1-2014.12：丹參有效成分作用靶標的實驗驗證。結(jié)合反義及siRNA技術(shù)，對候選靶標進行特異性驗證，獲得1-2個丹參的作用靶標，針對上述靶標，研究丹參有效成分及其組合（配伍）對其表達和調(diào)控的影響，獲得成分與靶標相互作用的實驗數(shù)據(jù)。2015.1-2015.12：丹參有效成分與靶標相互作用研究及驗證。通

22、過靶標的功能基因組及疾病基因組分析，設計出1-2組最佳成分組合，并在動物模型上對其藥理作用及靶標表達和調(diào)控進行實驗驗證，獲得最佳成分配伍及其作用靶標；并歸納出丹參有效成分與靶標相互作用關系。七、現(xiàn)有工作基礎和條件 本研究所具有20多年從事中醫(yī)中藥研究的經(jīng)驗和一支成熟的科研隊伍，擁有近3000平方米的實驗室，包括中藥制劑研究室，細胞實驗室、細胞培養(yǎng)室（無菌室）、蛋白質(zhì)組學實驗室、遺傳與分子生物學實驗室、微生物與免疫實驗室、生物化學實驗室，由細胞生物學、生物化學、微生物與免疫、遺傳學、分子生物學和中藥制劑分析等學科支撐，是浙江省中西醫(yī)結(jié)合基礎重點實驗室和國家中醫(yī)藥管理局脂代謝三級實驗室以及省教委蛋

23、白質(zhì)組學重點實驗室。有配制先進的實驗動物房，能提供實驗用的清潔級實驗動物?，F(xiàn)有正教授2人，副教授5人，其它專業(yè)技術(shù)人員20人?？砷_展藥物制劑，蛋白檢測、生化分析等研究。有從事本研究用的相關設備，如冷凍超高速和高速離心機、蛋白液相分離層析系統(tǒng)、核酸電泳儀、雙相電泳系統(tǒng)、核酸定量測定儀、紫外分光光度計、酶標儀、熒光分析儀、紫外凝膠成像系統(tǒng)、超凈工作臺、倒置熒光顯微鏡、超低溫冰箱、液氮罐、各種培養(yǎng)箱等等。本實驗室與奧地利格拉茨大學生物化學研究所建有所際關系；與德國Max-Plank生物物理研究所和中科院上海生物化學與細胞生物研究所具有良好的合作關系。八、經(jīng)費預算九、參考文獻1張旭靜，孔建龍，黃久儀等

24、。中藥抗動脈粥樣硬化作用研究進展。藥學實踐研究 2004 22（6） 321-323）2林琦，陸金國，丹參抗動脈粥樣硬化的研究進展. 山西中醫(yī)2002 18 (4) 56-58）3Lei XL, Chiou GCY. 1986. Studies on cardiovascular actions of Salvia miltiorrhiza. Am J Chinese Med 14: 26-32.4Liu GT, Zhang TM, Wang BE, Wang YW. 1992. Protective action of seven natural phenolic compounds aga

25、inst peroxidative damage to biomembranes. Biochem Pharmacol 43:147-152.5Onitsuka M, Fujiu M, Shinma N, Maruyama HB. 1983. New platelet aggregation inhibitors from Tan-Shen: radix of Salvia miltiorrhizaBunge. Chem Pharm Bull 31:1670-1675.6Wu YJ, Hong CY, Lin SJ, Wu P, Shiao MS. 1998. Increase of vita

26、min E content in LDL and reduction of atherosclerosis in cholesterol-fed rabbits by a water-soluble antioxidant- rich fraction of Salvia miltiorrhiza. Arteri Thromb Vasc Biol 18:481-486.7Yagi A, Fujimoto K, Tanonaka K, Hirai K, Takeo S. 1989. Possible active components of Tan-Shen (Salvia miltiorrhi

27、za) for protection of the myocardium against ischemiainduced derangements. Planta Med 55:51-54.8Zhou XM, Lu ZY, Wang DW. 1996. Experimental study of Salvia miltiorrhiza on prevention of restenosis after angioplasty. Chung-Kuo Chung Hsi i Chieh Ho Tsa Chih 16:480-482.9王浴生,鄧文龍,薛春生.中藥藥理與應用.第2版.北京.人民衛(wèi)生出版