保健食品中大豆異黃酮檢驗(yàn)方法

1、保健食品中大豆異黃酮的檢驗(yàn)方法高效液相色譜（HPLC）法中華人民共和國(guó)食品工業(yè)標(biāo)準(zhǔn)編制說(shuō)明1 .任務(wù)來(lái)源國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)保健食品中大豆異黃酗的檢驗(yàn)方法制修訂是根據(jù)全國(guó)食品工業(yè)標(biāo)準(zhǔn)化委員會(huì)的要求,由朝陽(yáng)區(qū)產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)所負(fù)責(zé)，與紅牛維他命飲料有限公司協(xié)作，進(jìn)行制訂工作（項(xiàng)目編號(hào)：-T-469）,根據(jù)項(xiàng)目?jī)?nèi)容確定了該項(xiàng)工作的具體方案和工作計(jì)劃，按照項(xiàng)目要求開(kāi)展工作。2 .意義大豆異黃酮是一類(lèi)具有營(yíng)養(yǎng)學(xué)價(jià)值和治療意義的菲固醇類(lèi)物質(zhì)，也是目前國(guó)際上公認(rèn)的安全有效的天然植物雌激素。目前發(fā)現(xiàn)的大豆中天然存在的大豆異黃酮共有12種，分為游離 型的元和結(jié)合型的糖兩類(lèi)，游離型的試元約占總量的2%-3%,包括染料木素（

2、Genistein）,大豆黃素（Daizein）和黃豆黃素（Glycitein）,結(jié)合型的糖試約占總量的 97%98%?已發(fā)現(xiàn)大 豆異黃酮是一種優(yōu)良的天然抗氧化劑，具 有多種生物活性，如對(duì)腫瘤、心血管疾病、骨質(zhì)疏松癥和更年期綜合癥預(yù)防與治療作用。因此，當(dāng)前國(guó)際上特別是美國(guó)和日本對(duì)大豆異黃酮開(kāi)展了大疑的應(yīng)用研究工作，以大豆異黃酮為主要成分的保健食品已成為一種新型暢銷(xiāo)食品。拯統(tǒng)計(jì)，國(guó)內(nèi)外市場(chǎng)上含有大豆異黃酮的保健食品達(dá)數(shù)十種之多。主要有片劑、膠鋌、口服 液、飲料等。例如，威海清華紫光科技生產(chǎn)的金奧力大豆異黃酮膠鋌，成都中 科生物技術(shù)開(kāi) 發(fā)有限公司生產(chǎn)的天雌大豆異黃酮營(yíng)養(yǎng)片（膠鋌）、紅牛維他命飲料有

3、限公司開(kāi)發(fā)的大豆異 黃酮保健飲料、廣東九極日用保健品有限公司生產(chǎn)的九極牌麗延口服液等。美國(guó) C1iibar公 司開(kāi) 發(fā)出添加了大豆異黃酮的運(yùn)動(dòng)飲料，美國(guó)加州Imagine食品公司開(kāi)發(fā)含大豆異黃酮、蛋 白質(zhì)、碳水化合物、23種維生素和礦物質(zhì)的能量飲料。不同的產(chǎn)品，大豆異黃酗的含量也不同，目前保健品市場(chǎng)上片劑一般每片（500mg）約含大豆異黃酮幾十亳克，膠鋌每粒含大豆異黃酮幾十亳克，口服液飲料每一百毫升含大豆異黃酮幾十到上百亳克，大豆異黃酮粉末含大豆異黃酮為每克一百到幾百亳克。國(guó)內(nèi)生產(chǎn)含大豆異黃麗的保健食品廠家很多，有的產(chǎn)品標(biāo)示的大豆異黃酮含量與實(shí)際含量差別很大，實(shí)際含量遠(yuǎn)小于標(biāo)示含量，保健品市場(chǎng)

4、有待于進(jìn)一步規(guī)范。為了保障消費(fèi)者的利益，也為企業(yè)提供更好的技術(shù)支持，因此建立一種相對(duì)統(tǒng)一、簡(jiǎn)便適用、經(jīng)濟(jì)的測(cè)定保健食品中大豆異黃酮含量的檢測(cè)方法是很必要的。3 .國(guó)內(nèi)外檢測(cè)方法研究進(jìn)展作為一種天然有效的抗氧化劑，大豆異黃酮越來(lái)越受到重視，對(duì)其功能性研究，生物活性研究以及產(chǎn)品開(kāi)發(fā)也是越來(lái)越廣泛。但是純凈的大豆異黃酮難溶或不溶于水，易溶于甲醇、乙醇、丙酮、乙酸乙酯、等有機(jī)溶劑。大豆異黃酮的性質(zhì)限制了它在飲料等食品體系中的應(yīng)用，但是隨著保健品市場(chǎng)的逐漸升溫，齊種聲稱(chēng)含有大豆異黃酮成分的保健品和食品越來(lái)越多，但是國(guó)家并未制左統(tǒng)一的檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)，國(guó)內(nèi)僅有農(nóng)業(yè)部于 2007年2月1日開(kāi)始實(shí)施的行業(yè)標(biāo) 準(zhǔn)NY/

5、T1252-2006大豆異黃酮，它主 要針對(duì)大豆異黃酗產(chǎn)品。衛(wèi)生部出版的保健食品檢驗(yàn)與評(píng)價(jià)技術(shù)規(guī)范（2003版）中有用HPLC法測(cè)定染料木素和大豆黃素的方法。雖然許多學(xué)者建立了基于不同系統(tǒng)分析大豆異黃酮含量的方法，如紫外分光光度法，該方法簡(jiǎn)便，但特異性較差；薄層掃描法（TLCS）操作簡(jiǎn)便。分離效果較好，但顯色劑用量難于 控制，人為誤差較大； 氣相色譜法（GC）進(jìn)樣量少、高敏感性、高選擇性、但在測(cè)左大豆黃素和染料木素時(shí)需要制備衍生物，樣品制備步驟較多，耗時(shí)長(zhǎng)：毛細(xì)管電泳法（CE）速度快，選 擇性高，儀器價(jià)格昂貴，難以普及：高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法（LC-MS）具有無(wú)可比擬的優(yōu)越 性，易于立性和左

6、量但因儀器價(jià)格昂貴，普及困難：高效液相色譜法（HPLC）測(cè)定樣品范用廣，樣品制備步驟少，成本低，分離效率高,靈敏度好，測(cè)左結(jié)果準(zhǔn)確，而且可有多種檢測(cè)器供 選擇。所以本課題組通過(guò)查詢(xún)資料和調(diào)研，選擇高效液相色譜（HPLC）法測(cè)左保健食品中 大豆異黃酮的含量。4 .實(shí)驗(yàn)部分4.1 色譜條件的選擇參照國(guó)內(nèi)外文獻(xiàn)資料，選擇了乙睹-水作為流動(dòng)相，比較了在相同的進(jìn)樣量情況下，不 同pH值 （pH=5.O, 4.0, 3.5, 3.0）的流動(dòng)相對(duì)大豆異黃酮分離效果的影響。在 pH較高時(shí)，大豆黃素、黃豆黃素和 染料木素的峰有拖尾現(xiàn)象，在 pH值3.0時(shí)峰型較好，拖尾現(xiàn)象得到 改善。通過(guò)上述試驗(yàn)的比較，最終確定

7、色譜流動(dòng)相為：乙臘冰 （pH3.0）;梯度洗脫：12%? 18%乙臘，0 ? lOmin： 18%? 24%乙10?23min： 24%? 30%乙臘，23? 30min； 30$乙臘，30? 50min,80%乙臘，50? 55mino此條件下，保留時(shí)間和峰面枳比較，有較好的穩(wěn)泄性和重現(xiàn)性。一次開(kāi)機(jī)，連續(xù)運(yùn)轉(zhuǎn)5天，以下六個(gè)分別為第 21, 38, 49, 107, 123, 124針?biāo)M(jìn)標(biāo)樣的保留時(shí) 間，見(jiàn)表1表格1六次進(jìn)樣保留時(shí)間比較單位:min平均值RSD(%)大豆昔13. 37713. 35013. 33213. 37413. 37313. 30013. 350. 23黃豆昔14.27

8、114.24214.23714. 27514. 27714.20114.250.21染料木昔19. 90119. 82319. 80119. 89019. 90119. 79619. 850. 26大豆黃素32. 02131.95131.93232. 07232. 08231.02231.851.28黃豆黃素33. 33633. 30333. 29233. 36233. 38233. 27533. 330. 13染料木素43. 73943. 52443. 50743.81543. 82243. 49743. 650. 36對(duì)以大豆昔、黃豆昔、染料木昔、大豆黃素、黃豆黃素和染料木素進(jìn)行波長(zhǎng)掃描，

9、 波長(zhǎng)范囤：220nm? 450nm,光譜圖見(jiàn)附頁(yè)1通過(guò)光譜圖比較，這六種物質(zhì)在260nm有最大吸收，因此選左 260nm作為檢測(cè)波長(zhǎng)4.1.3標(biāo)準(zhǔn)工作曲線(xiàn)和線(xiàn)性范帶I配制不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)使用液在上述色譜條件下進(jìn)行HPLC測(cè)定。線(xiàn)性方程和相關(guān)系數(shù)見(jiàn)表2和附頁(yè)2。表格2標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)數(shù)據(jù)列表樣品名稱(chēng)濃度（u g/mL）峰而積線(xiàn)性方程相關(guān)系數(shù)大豆昔0. 20958.6Y 二 38. 20869X+4. 010240. 999992. 095082.910. 4750408.041.90001619. 783. 80003192. 0125.70004810. 9黃豆昔0. 19907.5Y 二 34. 7

10、4200X+2. 313090. 999991.990072.99. 9500350.939. 80001391.879. 60002754. 0119.40004157. 2染料木昔0. 207512.22. 0750121.010. 3750589.441.50002323. 683. 00004595. 3124.50006922. 3大豆黃素0. 201512.82.0150123.410. 0750619.640. 30002428. 580. 60004799. 7120.90007233. 2黃豆黃系0. 199510.81.9950110.49. 9750441.539. 90

11、001736. 379. 80003455. 3119. 70005196. 9染料木素0. 202016.6Y 二 55. 50528X+5. 775940. 99999Y 二 59. 71839X+6. 173330. 99999Y 二 43. 30426X+8. 176450. 99999Y 二 78. 92797X+6. 069000. 99999167.0812.53212. 76352. 19586. 32. 020010. 100040. 400080. 8000121.2000由表2可知，本方法的標(biāo)準(zhǔn)工作曲線(xiàn)線(xiàn)性范圍較寬，0-120 ug/mL線(xiàn)性良好。4.2 樣品處理4.2.

12、1 提取溶劑的選擇大豆異黃酮難溶或不溶于水，易溶于甲醇、乙醇、乙酸乙酯等有機(jī)溶劑，參照國(guó)內(nèi)外相 關(guān)資料,選擇了 80$甲醇提取保健食品中的大豆異黃酮成分，80書(shū)的甲醇提取的樣品色譜圖見(jiàn)附頁(yè)3。保健食品片劑和粉末一般以淀粉和糊精作為填充劑 ，80%的甲醇能夠使淀粉和糊精沉淀,期外能 夠有效提取大豆異黃酮成分：軟膠囊含油脂，用 80%的甲醇作為萃取劑，一方而大大 降低了油脂的 溶解度，延長(zhǎng)色譜柱的使用壽命，也可以有效提取大豆異黃酮。保健飲料中的大豆異黃酮可溶于水，可以直接用80%甲醇提取。4.2.2 超聲時(shí)間的選擇保健食品中組分復(fù)雜，含有淀粉、糊精、油脂、蛋白等各種成分，能夠包容大豆異黃麗有效成分

13、，通過(guò)超聲萃取能夠快速有效的提取。本實(shí)驗(yàn)選擇 Omin, lOmin , 20min, 30min, 40min進(jìn)行超聲處 理。結(jié)果見(jiàn)圖1。圖1超聲時(shí)間對(duì)提取效果的影響從上圖可以看出，超聲時(shí)間對(duì)軟膠囊提取影響較明顯，超聲波能夠使軟膠囊中油狀物破孚L,大豆異黃酮成分能夠更加快速被甲醇萃取出來(lái)，但是隨著超聲時(shí)間的延長(zhǎng)，提取量沒(méi)有明顯增加，選左超聲時(shí)間為20mino硬膠爰(粉劑)，粉劑為粉末狀物質(zhì)，它能夠較好的分散于80%的甲醇中，使得其中的 大豆異黃酮組分比較容易被提取，所以超聲 20min已能夠完全提取。4.3 本方法的檢出限本方法的檢出限：進(jìn)樣量為10 UL時(shí)，大豆昔(daidzin)、黃豆昔

14、(glycitin)和染料木 苜(genistin)、大豆黃素(da ide in)、黃豆黃素(glycitein)和染料木素(genistein)的最低 檢出濃度均為：0. 02ug/mL,最低檢出量如下：以大豆異黃酮為主要功能性成分的片劑、膠囊及大豆異黃酮粉末0. 005mg/g, 口服液的最低檢出疑為：0. 0002mg/mL,保健飲料最低檢出量為：0. 0002mg/mLo4. 4本方法的重復(fù)性和精密度按照本方法，選擇五種代表性的大豆異黃酮保健食品進(jìn)行日內(nèi)重復(fù)性測(cè)左，結(jié)果表明本 方法精密度好，準(zhǔn)確度高，操作簡(jiǎn)便，適合推廣應(yīng)用。部分結(jié)果見(jiàn)下表。表中，以大豆異黃酮總量計(jì) mg/g，飲料的單

15、位為ug/mL。表格3日內(nèi)重復(fù)性單位：mg/g、人數(shù)名稱(chēng)、123456平均值RSD(%)膠囊56. 2860. 3558. 9059. 2258. 6859. 7858.872.4粉末104. 71105. 37105. 79107. 72103. 43106. 64105.611.4片劑35. 1734.7633. 9533. 7433. 0434.2734.162.2飲料107. 58107. 31107. 90106. 38104. 92105. 91106.671J表格4樣品中六種大豆異黃酮成分的重復(fù)性單位:mg/g數(shù)名稱(chēng)123456平均值RSD (%)大豆昔32. 9932. 383

16、3. 3433.8933. 1432.9233. 111.5黃豆昔13. 7213. 4614.0013.4913. 7813. 7013. 701.5染料木昔7. 837. 737.91& 037. 927.817. 871.4大豆黃素1.781.711.771.791.771.761.761.8黃豆黃系0. 840. 820. 840. 860. 840. 840. 841.6染料木素1.831.781.831.841.841.831.820.3通過(guò)表4可以看出，六種大豆異黃酮日內(nèi)重復(fù)性較好，精密度較高按照本檢驗(yàn)方法對(duì)樣品進(jìn)行日間重復(fù)性測(cè)泄：間隔兩天，共測(cè)定三次，部分實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表5

17、表格5日間重復(fù)性單位：mg/g名稱(chēng)123平均值RSD (%)大豆昔33. 6932. 1833. 3633. 082.4黃豆昔14. 0013. 2313. 8913.713. 1染料木昔8.017. 707. 927. 882.0大豆黃素1.791.701.781.762.8一 A ?墾黃豆0. 850. 820. 840. 841.9染料木素1.831.781.851.821.94.5本方法的準(zhǔn)確度按照本檢驗(yàn)方法對(duì)樣品飲料、片劑、膠囊、口服液的加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)，回收率見(jiàn)表6表格6飲料（空白）加標(biāo)回收名稱(chēng)實(shí)際測(cè)泄均值（u g/mL） 加標(biāo)量（u g/mL）平均回收率（）大豆昔1.942.0495

18、10. 1010. 209919. 7020. 40972. 122. 1698黃豆昔10. 6010. 809821. 1021.60981.601.55103染料木昔7. 967. 7510315. 6015. 501012. 592. 59100大豆黃素12. 7012. 959825. 7025. 90991.791.8796黃豆黃系9. 599. 3510318. 9018. 701012. 072. 00104染料木素9. 8010. 009820. 7020. 00104表格7片劑(空白)加標(biāo)名稱(chēng)實(shí)際測(cè)定均值(mg./g)加標(biāo)量(mg/g)平均回收率()大豆昔0. 2500. 2

19、55980. 9701.02095黃豆昔0. 2500. 270951.0601.08098染料木昔0. 2000. 1931040. 7950. 772103大豆黃素0. 3330.3131061.3401.295103黃豆更素0. 2280. 235970. 9300. 94099染料木素0. 2500. 2501001.0301.000103表格8膠我加標(biāo)回收名稱(chēng)實(shí)際測(cè)泄值(mg/g)樣品本底值(mg/g)加標(biāo)量(mg/g)回收率(%)大豆昔43. 2535.657. 659948. 9335.6512. 7510466. 8835.6530.610222.4314. 238. 10101黃豆昔28. 4814. 2313.510647. 5314. 2332.4103染料14. 158. 305. 78101木昔18. 208