發(fā)酵工程實(shí)驗(yàn)報(bào)告集

1、蘇州科技學(xué)院化生學(xué)院學(xué)生實(shí)驗(yàn)報(bào)告 生物技術(shù)大實(shí)驗(yàn) 發(fā)酵工程工藝控制生物技術(shù)大實(shí)驗(yàn)實(shí) 驗(yàn) 報(bào) 告 集班級(jí) 生物技術(shù)1212 學(xué)號(hào) 1220212206 姓名 宋揚(yáng) 使用時(shí)間 2015.12.14 至 2015.12.19 組別 一 蘇 州 科 技 學(xué) 院 化 學(xué) 與 生 物 工 程 學(xué) 院實(shí)驗(yàn)室學(xué)生守則一、嚴(yán)格遵守實(shí)驗(yàn)室各項(xiàng)規(guī)章制度和管理措施，服從教師及實(shí)驗(yàn)技術(shù)人員的指導(dǎo)。二、嚴(yán)格按照實(shí)驗(yàn)要求，做好實(shí)驗(yàn)預(yù)習(xí),實(shí)驗(yàn)之前5分鐘進(jìn)入實(shí)驗(yàn)室，及時(shí)、準(zhǔn)確地完成實(shí)驗(yàn)任務(wù)，實(shí)事求是地完成實(shí)驗(yàn)報(bào)告，杜絕弄虛作假。三、嚴(yán)格執(zhí)行操作規(guī)定，愛(ài)護(hù)儀器設(shè)備及工具。凡不按教師的指導(dǎo)擅自操作引起儀器、設(shè)備損壞者，應(yīng)予賠償。四

2、、愛(ài)護(hù)實(shí)驗(yàn)室公共財(cái)物，節(jié)約水電、材料和試劑。未經(jīng)允許不得隨便挪動(dòng)非實(shí)驗(yàn)需用的其他儀器，不得隨便拆裝儀器或?qū)x器、工具帶至室外。五、持實(shí)驗(yàn)室的嚴(yán)肅安靜，不得大聲喧嘩、嘻鬧，嚴(yán)禁在實(shí)驗(yàn)室內(nèi)抽煙和吃東西。六、嚴(yán)防事故，確保實(shí)驗(yàn)室安全，發(fā)現(xiàn)異常情況，應(yīng)及時(shí)向有關(guān)教師和管理人員報(bào)告。七、每次實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，主動(dòng)整理好儀器設(shè)備，歸還所借器材，關(guān)閉電源、水源，按指導(dǎo)老師的要求做好實(shí)驗(yàn)結(jié)束工作及室內(nèi)外的清潔衛(wèi)生工作，經(jīng)指導(dǎo)老師許可后，方可離開(kāi)。 蘇州科技學(xué)院化學(xué)與生物工程學(xué)院實(shí) 驗(yàn) 報(bào) 告實(shí)驗(yàn)名稱(chēng)輔酶Q10發(fā)酵過(guò)程工藝控制組別九實(shí)驗(yàn)結(jié)果及實(shí)驗(yàn)分析與討論：摘要：通過(guò)輔酶Q10產(chǎn)生菌類(lèi)球紅細(xì)菌Rhodobacter

3、sphaeroides的培養(yǎng)，學(xué)會(huì)菌種在小型發(fā)酵罐中培養(yǎng)的過(guò)程，包括培養(yǎng)基和設(shè)備的滅菌、種子的培養(yǎng)、接種、發(fā)酵工藝控制等，進(jìn)一步鞏固所學(xué)的有關(guān)發(fā)酵過(guò)程的控制、中間補(bǔ)料、溶氧控制、變溫發(fā)酵及代謝調(diào)節(jié)等工藝，學(xué)會(huì)分析代謝曲線，掌握有關(guān)參數(shù)及輔酶Q10的定量分析方法。關(guān)鍵詞：輔酶Q10，補(bǔ)料發(fā)酵，葡萄糖量，溶氧測(cè)定 輔酶Q10（Coenzyme Q10），是一種位于線粒體上的脂溶性化合物，化學(xué)名稱(chēng)為2,3-二甲氧基-5-甲基-6-癸異戊烯基苯醌。輔酶Q10的制備方法有組織提取法、微生物發(fā)酵法和化學(xué)合成法。目前，我國(guó)國(guó)內(nèi)多家公司均實(shí)現(xiàn)了輔酶Q10的工業(yè)化生產(chǎn)，多采用微生物發(fā)酵法，且據(jù)報(bào)道，最高產(chǎn)量已達(dá)

4、到3000mg/L。葡萄糖是碳源中最易利用的糖,幾乎所有的微生物都能利用葡萄糖,所以葡萄糖常作為培養(yǎng)基的一種主要成分,并且作為加速微生物生長(zhǎng)的一種有效的糖。適量地增加葡萄濃度可以有效提高產(chǎn)物的合成量。因此，選擇合適的葡萄糖補(bǔ)加方式并合理控制培養(yǎng)基中葡萄糖的濃度有利于產(chǎn)物的合成。 本試驗(yàn)采用類(lèi)球紅細(xì)菌Rhodobacter sphaeroides進(jìn)行深層液體發(fā)酵生產(chǎn)輔酶Q10，發(fā)酵方式為流加分批發(fā)酵。通過(guò)流加補(bǔ)料將發(fā)酵過(guò)程中葡萄糖濃度分別控制在10g/L-15g/L,5g/L-10g/L,探究發(fā)酵過(guò)程中維持葡萄糖不同濃度對(duì)類(lèi)球紅細(xì)菌發(fā)酵生產(chǎn)輔酶Q10的影響。一、實(shí)驗(yàn)的儀器和試劑1、儀器BIOTE

5、CH-7BG型發(fā)酵罐、高效液相色譜、顯微鏡、臺(tái)式離心機(jī)、旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀等。2、菌種類(lèi)球紅細(xì)菌Rhodobacter sphaeroides3、培養(yǎng)基（1）種子培養(yǎng)基（g/L）：葡萄糖 3，酵母提取物 8，NaCl 2，KH2PO4 1.3，MgSO4·7H2O 0.25, 1mL 輔液（2）發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L) : 葡萄糖30,甘露醇7.5,玉米漿干粉3，魚(yú)粉蛋白胨3，谷氨酸鈉5, NaCl 3.5 硫酸銨 3，KH2PO4 3，MgSO4 ·7H2O 15 ,FeSO4 1.25,MnSO4 0.12,1mL 輔液；用NaOH調(diào)pH至 7.0（發(fā)酵罐培養(yǎng)基加3ml 泡敵） 輔

6、液（g/L）：鹽酸硫胺 1，生物素0.015，煙酸 1，CuSO4 0.1。（3）補(bǔ)料培養(yǎng)基(g/L)：葡萄糖300（4）發(fā)酵消泡劑配比（v）：泡敵水=110。（5）培養(yǎng)基滅菌方法：培養(yǎng)基等配好后在蒸汽滅菌罐內(nèi)于115下滅菌30分鐘。二、實(shí)驗(yàn)的步驟1、發(fā)酵工藝條件路線為平板活化 菌種子斜面 搖瓶種子 罐發(fā)酵。2、斜面種子培養(yǎng)從平板培養(yǎng)基上單菌落接種于斜面培養(yǎng)基上，32恒溫培養(yǎng)3d。3、搖瓶種子培養(yǎng)250ml搖瓶加入50 ml 種子培養(yǎng)基，滅菌后冷卻，挖一約0.5cm2小塊斜面放入培養(yǎng)基中，30，200r/min，培養(yǎng)24h。4、發(fā)酵（1）罐發(fā)酵培養(yǎng)以8%（v/v）接種量接種于5L（裝液3L）發(fā)

7、酵培養(yǎng)基中，32，pH6.8±0.2，0.03Mpa，3L/min（初始）,200 r/min（初始），補(bǔ)料分批培養(yǎng)，用氨水自動(dòng)調(diào)節(jié)pH，到120小時(shí)（45d）左右放罐。接種后培養(yǎng)2-3h后，通過(guò)調(diào)節(jié)空氣流量和轉(zhuǎn)速，控制溶氧（DO）在50%的水平。發(fā)酵液pH會(huì)先上升再下降，待其降至6.8，通過(guò)補(bǔ)加氨水，控制pH在6.8。每4h測(cè)一次葡萄糖含量，計(jì)算補(bǔ)料體積，分別維持葡萄糖濃度（A）1211班：葡萄糖濃度維持在10-15 g/L。（B）1212班：葡萄糖濃度維持在5-10 g/L。補(bǔ)料速率：根據(jù)還原糖分析結(jié)果及溶氧水平情況進(jìn)行補(bǔ)料（30-60min補(bǔ)料一次）。每班取3個(gè)搖瓶測(cè)定有關(guān)參數(shù)

8、。（2）參數(shù)測(cè)定及記錄在線參數(shù)每1hr記錄一次；離線參數(shù)每8hr取樣分析一次，包括總糖、還原糖、氨基氮、菌體濃度、pH、輔酶Q10含量等。（3）放罐條件待發(fā)酵后期，輔酶Q10產(chǎn)量下降，溶氧上升，pH上升，開(kāi)始下罐。5、離線參數(shù)測(cè)定在發(fā)酵過(guò)程中每4小時(shí)取一次樣分析以下項(xiàng)目：(1)美藍(lán)染色，鏡檢觀察，并記錄類(lèi)球紅細(xì)菌細(xì)胞菌體形態(tài)。(2)菌體濃度測(cè)定：干重法。（見(jiàn)附錄1）(3)還原糖測(cè)定：生物傳感分析儀。（見(jiàn)附錄2）(4)取發(fā)酵液離心后的上清液用甲醛滴定法測(cè)氨基氮。（見(jiàn)附錄3）(5)輔酶Q10的提取及定量測(cè)定：用酸熱法提取Q10（在90水浴鍋加熱，注意不要用電爐加熱），用HPLC測(cè)定輔酶Q10的含量

9、。（見(jiàn)附錄4）6、在線參數(shù)測(cè)定在發(fā)酵罐上連續(xù)測(cè)定pH、溶氧(DO)、轉(zhuǎn)速、流量、溫度等。7、記錄所測(cè)參數(shù)，記入輔酶Q10發(fā)酵批報(bào)表。三、輔酶Q10發(fā)酵過(guò)程有關(guān)離線參數(shù)的分析方法1、 菌體濃度的測(cè)定(1)菌體濃度的測(cè)定用離心法 取5mL菌液于已稱(chēng)好管重（W0）的10mL離心管中（每次3個(gè)平行），4下離心15min，離心轉(zhuǎn)速為 5000 rpm。離心所得菌體用稀鹽酸溶液(0.05M HCl:約4mL HCl加水至1L)洗滌兩次，稱(chēng)濕重W1，。注意：洗滌時(shí)，要充分震勻。打開(kāi)離心管蓋，至80烘箱中烘至恒重，稱(chēng)干菌體與離心管重量W2。(2)計(jì)算公式濕重X1=(W1W0)×20干重X2=(W2W

10、0)×20W1：濕菌體與離心管重量，g；W2：干菌體與離心管重量，g；W0：離心管重量，g；單位：g/L。2、發(fā)酵液中還原糖測(cè)定生物傳感分析儀測(cè)定發(fā)酵液中還原糖測(cè)定操作在“準(zhǔn)備就緒”狀態(tài)下，按“運(yùn)行”鍵，儀器自動(dòng)清洗2次，以更新反應(yīng)池和管道內(nèi)的緩沖液，清洗結(jié)束后進(jìn)入自動(dòng)定標(biāo)狀態(tài)。這時(shí)，注入25ml標(biāo)樣，儀器自動(dòng)開(kāi)始測(cè)定標(biāo)樣并定標(biāo)，測(cè)定完成后，自動(dòng)清洗一次，進(jìn)入下一測(cè)定循環(huán)。儀器根據(jù)上次定標(biāo)時(shí)的測(cè)定誤差，自動(dòng)判斷是否需要繼續(xù)定標(biāo)，如需要，則再次提示定標(biāo)。當(dāng)完成儀器標(biāo)定后，綠燈不再閃爍，儀器進(jìn)入測(cè)定樣品狀態(tài)。注入25ml樣品，根據(jù)結(jié)果確定要稀釋的倍數(shù)。初始為40倍。3、發(fā)酵液中氨基氮的測(cè)

11、定（一）實(shí)驗(yàn)材料(1)中性甲醛溶液將試劑級(jí)甲醛（36-37%）調(diào)到PH7（用 PH計(jì)檢查）?；蚴窃?0ml36-37%甲醛中加入幾滴0.5酚酞乙醇水溶液，然后用0.2N氫氧化鈉溶液滴定到微紅。（需臨用前配制，若放置一些時(shí)間后，在使用前要重新中和。）(2)酚酞指示劑0.5%酚酞的50%乙醇溶液。(3)標(biāo)準(zhǔn)堿溶液0.1N 氫氧化鈉溶液，使用前應(yīng)標(biāo)定。(4)溴酚蘭指示劑0.05%溴酚蘭的20%乙醇溶液。（二）實(shí)驗(yàn)方法(1)分別吸取發(fā)酵液離心上清液2.0ml于兩個(gè)磨口具塞錐形瓶中，各加蒸餾水5ml。向另一磨口具塞錐形瓶中加入7ml蒸餾水，做空白對(duì)照。(2)向上述三個(gè)瓶中各加中性甲醛溶液5.0ml，混勻

12、，加溴酚蘭指示劑2滴，加酚酞指示劑4滴。(3)用標(biāo)準(zhǔn)0.100mol/LNaOH溶液滴定至紅色，分別紀(jì)錄消耗的NaOH毫升數(shù)。4、菌體中輔酶Q10含量提取與測(cè)定(1)菌體細(xì)胞的破碎酸熱法：酸熱法處理菌體主要是利用鹽酸對(duì)細(xì)胞中的糖及蛋白質(zhì)等成分的作用,疏松細(xì)胞的結(jié)構(gòu)，再經(jīng)過(guò)沸水、冷凍處理，使細(xì)胞達(dá)到破碎的效果，輔酶Q10得率相對(duì)較高，操作也相對(duì)簡(jiǎn)單。酸熱法：取1ml發(fā)酵液，加入0.2mL 0.1 mol/L的鹽酸，于90°C水浴鍋中，水浴處理15 min。破壁好迅速冷卻，5000rpm離心10min，棄盡上清。加入5mL提取液（乙酸乙酯：乙醇=5:3，體積比），漩渦震蕩儀上混勻，置于超

13、聲波清洗儀中超聲抽提15min,暗室中抽提15min,每隔5min搖勻一次。將抽提液離心10min。上層有機(jī)相0.46m濾頭過(guò)濾，待測(cè)。(2)輔酶Q10含量的分析輔酶Q10用HPLC進(jìn)行分析，液相分析儀器為安捷倫，色譜柱為C18反相柱（5m×4.6mm×150mm）。流動(dòng)相為甲醇：異丙醇=3：1，柱溫箱為40，流速為1mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)是275nm。輔酶Q10標(biāo)準(zhǔn)品梯度稀釋后經(jīng)HPLC分析建立。輔酶Q10標(biāo)準(zhǔn)曲線：y=0.06729x R2=0.99996 (x為峰面積，y為輔酶Q10濃度mg/L)菌體中輔酶Q10含量y=0.06729*5x=0.33645x (提取時(shí)

14、，輔酶Q10稀釋了5倍)四、實(shí)驗(yàn)結(jié)果菌體量隨著時(shí)間增加而增長(zhǎng)，而輔酶Q10 含量也隨著菌體量的增長(zhǎng)而變大。后期因?yàn)榫w量的減少，Q10產(chǎn)量也開(kāi)始降低。下罐。 還原糖濃度（柱狀圖）還原糖濃度不斷下降，在24小時(shí)開(kāi)始每隔一段時(shí)間補(bǔ)充葡萄糖，使葡萄糖含量維持在6左右。一開(kāi)始溶氧在100%，隨著菌體生長(zhǎng)發(fā)酵，開(kāi)始下降，控制在30%左右，隨著菌體增加，降為0，后期發(fā)酵罐變粘，影響氧氣傳遞。前期消耗氮源，產(chǎn)氨，pH上升，隨著菌體生長(zhǎng)繁殖，消耗碳源，產(chǎn)酸，pH下降，糖缺乏時(shí)，pH上升，補(bǔ)充碳源，使pH維持在6.8左右。當(dāng)pH過(guò)低時(shí)，通過(guò)補(bǔ)加氨水，使pH維持穩(wěn)定。實(shí)驗(yàn)成績(jī)： 教師： 日期： 實(shí) 驗(yàn) 報(bào) 告五、

15、參考文獻(xiàn)【1】李嘯·生物工程專(zhuān)業(yè)綜合大實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)·北京：化學(xué)工業(yè)出版社，2009【2】陳長(zhǎng)華·發(fā)酵工程實(shí)驗(yàn)·北京：高等教育出版社，2009【3】黃儒強(qiáng)，李玲·生物發(fā)酵技術(shù)與設(shè)備操作·北京：化學(xué)工業(yè)出版社，2006學(xué) 期 實(shí) 驗(yàn) 小 結(jié) 轉(zhuǎn)眼間，我已從懵懂的大一新生變成了大四老生，我開(kāi)始漸漸覺(jué)得焦慮，以及對(duì)未來(lái)的恐懼。不知道自己的未來(lái)會(huì)怎么樣，雖然確定了一定要考研，可是也不知能不能考上理想的學(xué)院。否則，就要踏上未知的社會(huì)，開(kāi)始另一段人生必要的過(guò)程。 在本學(xué)期剛過(guò)一半時(shí)段的時(shí)候我們開(kāi)始了“傳說(shuō)”中的大實(shí)驗(yàn)，畢竟我們大一到大三的實(shí)驗(yàn)都是比較容易的，花時(shí)間較少的，沒(méi)有這么長(zhǎng)時(shí)間的，而且要花很多精力。更重要的是還有來(lái)自考研的壓力。雖然一度想過(guò)要放棄做這個(gè)實(shí)驗(yàn)，不過(guò)我還是認(rèn)真的做了，雖然做的并不理想。其實(shí)，對(duì)這個(gè)實(shí)驗(yàn)我還是很上心，雖然不怎么想做，想要集中精力好好考研。 這次的實(shí)驗(yàn)是連續(xù)發(fā)酵測(cè)定輔酶Q10，這個(gè)實(shí)驗(yàn)出了要