實驗一 蛋白質(zhì)的沉淀與凝固

1、實驗內(nèi)容實驗一 蛋白質(zhì)的沉淀與凝固 蛋白質(zhì)溶液是一穩(wěn)定的親水性溶膠液，其穩(wěn)定的因素有二：一是蛋白質(zhì)膠粒上的電荷使之相互排斥，不易凝集成團；二是膠粒表面的水化膜，它使膠粒與水融洽相依，又在膠粒之間起了隔離作用。如果上述兩種穩(wěn)定蛋白質(zhì)溶液的因素被破壞，蛋白質(zhì)將于溶液中沉淀析出。 促使蛋白質(zhì)沉淀的因素很多，大致可分為兩類：第一類是可逆的沉淀反應(yīng)。這時蛋白質(zhì)的空間構(gòu)象未受到很大改變，除去沉淀因素后，可以重新溶解，例如鹽析和低溫乙醇沉淀蛋白。第二類是不可逆的沉淀反應(yīng)，重金屬鹽類或生物堿試劑沉淀蛋白后，由于蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)發(fā)生重大改變，所以不再溶于水中。不可逆的蛋白質(zhì)沉淀多表示蛋白質(zhì)已經(jīng)變性。變性的蛋白質(zhì)在等電

2、點附近加熱時，蛋白質(zhì)分子間相互盤繞而變成堅實的凝塊。一、 蛋白質(zhì)的鹽析 原理高濃度的鹽離子可與蛋白質(zhì)膠粒爭奪水化膜，同時鹽又是強電解質(zhì)，可抑制蛋白質(zhì)的解離。因而用高濃度的中性鹽，使蛋白質(zhì)帶電量減少，水化膜破壞而從溶液中沉淀出來。鹽析沉淀蛋白一般不引起蛋白變性，故常用于分離各種天然蛋白質(zhì)。由于蛋白質(zhì)的組成及性質(zhì)不同，所以鹽析時所需中性鹽的濃度也不相同。例如半飽和的硫酸銨沉出球蛋白，飽和的硫酸銨則沉出清蛋白。 操作 1.取一試管，加入3ml 5%蛋白質(zhì)溶液及3ml飽和硫酸銨溶液，搖勻靜止數(shù)分鐘后觀察現(xiàn)象。 2.將試管內(nèi)容物過濾，加硫酸銨粉末于濾液中，使達飽和狀態(tài)，搖勻后觀察現(xiàn)象。（注意固體硫酸銨若

3、加到過飽和則有結(jié)晶析出，勿與蛋白質(zhì)沉淀混淆。） 3.取上項渾濁液1ml，加水2ml，觀察是否復(fù)容。二. 乙醇沉淀蛋白質(zhì) 原理乙醇是脫水劑，可與蛋白質(zhì)爭奪水化膜；此外，加入乙醇可使水的介電常數(shù)變小，蛋白質(zhì)解離度降低，帶電量減少。故加入乙醇能破壞蛋白質(zhì)的膠體性質(zhì)而使蛋白質(zhì)沉淀。用此法在低溫下操作可使沉出的蛋白質(zhì)保持其理化特性及其生物學(xué)活性，但室溫中乙醇與蛋白質(zhì)接觸較久后，可使之變性，形成不可逆的沉淀。 操作1. 取試管4支，標出1、2、3、4號碼，按下表操作試劑 12345%蛋白質(zhì)溶液（ml）111-1%乙酸（滴）-1-2-95%乙醇（ml）-2 2.將3管及4管置冰水中，放置5分鐘，然后將第4管

4、的冰乙醇倒入第3管中（此步最好在冰水中進行），混勻，同時向第1及第2管中各加入未冰浴的乙醇2ml混勻，觀察各管的沉淀情況并立即向第1、2及3管中各加入蒸餾水10ml，混勻，比較各管變化并解釋之。三. 重金屬鹽沉淀蛋白 原理 在溶液的PH值大于蛋白質(zhì)的等電點時，帶負電荷的蛋白質(zhì)與重金屬離子（Ca2+、Hg2+、Ag1+、Pb2+等）結(jié)合成鹽而沉淀。 操作 取試管4支，按下表操作。試劑 （滴）12345%蛋白質(zhì)溶液55551%乙酸 -101010g/L硫酸銅3-3-30g/L硝酸銀-3-3混合均勻，比較各管渾濁程度并解釋之。四. 生物堿試劑沉淀蛋白 原理能沉淀生物堿（或植物堿）或與其產(chǎn)生顏色反應(yīng)的

5、物質(zhì)稱為生物堿試劑，如鞣酸、苦味酸、磷鎢酸等。在溶液的PH值小于蛋白質(zhì)的等電點時，帶正電荷的蛋白質(zhì)與生物堿試劑的負離子結(jié)合成鹽而沉淀。 操作 取試管3支，按下表操作。試 劑 1235%蛋白質(zhì)溶液（ml）1111%乙酸（滴）101010苦味酸溶液（滴）數(shù)滴-鞣酸溶液（滴）-數(shù)滴-三氯乙酸溶液（滴）-數(shù)滴混合均勻，比較各管渾濁程度并解釋之。五. 蛋白質(zhì)的加熱凝固 原理 蛋白質(zhì)在其等電點附近加熱，即發(fā)生變性凝固，在加熱過程中，隨著蛋白質(zhì)變性作用的深化，使已變性的蛋白質(zhì)分子間凝聚成凝膠狀的蛋白塊。但應(yīng)注意，當?shù)鞍踪|(zhì)溶液遠離等電點而帶有很多同種電荷時，加熱雖可使其變性，但因同種電荷的排斥作用并不發(fā)生凝固

6、現(xiàn)象。 操作取試管4支，按下表操作試 劑12345%蛋白質(zhì)溶液（ml）22221%乙酸（滴）-1-2-10%乙酸（ml）-0.5-100g/LNaOH（ml）-0.5混勻后各管分別加熱，觀察有否沉淀析出及沉淀析出的多少、快慢并解釋之。另外在第2管加熱蛋白沉出后再加入5ml蒸餾水，觀察是否復(fù)溶，為什麼？ 試劑 15%蛋白溶液：取出雞蛋清用蒸餾水稀釋5倍，攪勻后用紗布過濾。 2飽和硫酸銨溶液。 3硫酸銨結(jié)晶粉末。 495%乙醇。 51%乙酸和10%乙酸。 630g/L硝酸銀溶液。 710g/L硫酸銅溶液。 8100g/L氫氧化鈉溶液。 9苦味酸飽和溶液及鞣酸飽和溶液。 10100g/L三氯乙酸溶液

7、。 （李素婷） 實驗三 微量凱氏定氮法 原理蛋白質(zhì)樣品與濃硫酸共熱時，分解出氮、二氧化碳和水，而氮轉(zhuǎn)變?yōu)榘?，氨與硫酸結(jié)合生成硫酸銨，再與納氏試劑顯色，與標準液比較，可求其含氮量。如測血清蛋白，可將總氮量減去非蛋白氮量，再乘以6.25即得蛋白質(zhì)量。 操作1取血清或血漿0.2ml，以0.9%NaCl溶液稀釋至10ml（稀釋50倍）2取消化管1支，加入稀釋血清0.5ml，50%硫酸0.5ml, 玻璃珠1枚，在電爐上消化。3當出現(xiàn)白霧并充滿消化管時，消化管口加玻蓋，再繼續(xù)消化3分鐘左右，冷卻，加3%H2O212滴，再消化至出現(xiàn)白霧，加蓋，繼續(xù)消化至無色透明，完全冷卻后加蒸餾水至17.5ml，再加納氏試

8、劑至25ml，混勻，與標準管比色。4標準管制備：取硫酸銨標準液（應(yīng)用液）制備標準曲線，以蒸餾水作空白調(diào)零，500nm波長比色。5標準曲線制備：取硫酸銨標準液（應(yīng)用液）制備標準曲線，取5支干凈試管操作如下試 劑（ml）12345標準硫酸銨應(yīng)用液-0.81.21.62.018N H2SO40.10.10.10.10.1蒸餾水3.42.62.21.81.4混勻，各管加奈氏試劑1.5 ml, 以第1管為空白，用500nm波長比色得各管光密度值，以濃度為橫坐標，測得各管光密度為縱坐標，作一標準曲線。6測得測定管的光密度值，于標準曲線上查出含氮量。計算 蛋白質(zhì)g %=含氮量´6.25´

9、100 試劑150%硫酸2. 18N硫酸溶液：取比重1.84的分析純濃硫酸50毫升慢慢加到50毫升蒸餾水中。3. 3%H2O24. 0.9%NaCl5. 奈氏試劑： 奈氏試劑貯存液：于500毫升錐形瓶內(nèi)加入碘化鉀150克，碘110克及蒸餾水100毫升和純汞150克，振搖到碘色將變時（約15分鐘），混合液發(fā)生高熱，將錐型瓶放入冷水內(nèi)繼續(xù)振搖至棕紅色的碘轉(zhuǎn)變成帶綠色的碘化鉀汞溶液時為止。將上清液傾入2000毫升的量筒中，用蒸餾水洗滌瓶內(nèi)壁及瓶內(nèi)沉淀物數(shù)次，將洗液一并傾入量筒中，加蒸餾水至2000毫升。奈氏試劑應(yīng)用液：取10%氫氧化鈉溶液700毫升，加入奈氏貯存液150毫升，搖勻，用蒸餾水稀釋到10

10、00毫升。如渾濁，可靜止過夜，取上請液備用。6硫酸胺標準貯存液：（1毫升=1毫克氮） 取分析純硫酸銨置烤箱中110oC，干燥半小時，取出置干燥器內(nèi)待其冷卻，準確稱取干燥的硫酸銨4.716克，置1000毫升量瓶中，加蒸餾水300毫升使之溶解，加純濃硫酸1毫升，再加蒸餾水至刻度。(NH4)2SO4分子量132.06；其氮占28。 故：132.0628=4.716X X=1 即4.716克硫酸銨中含氮1克 7硫酸銨標準應(yīng)用液： 取硫酸銨標準貯存液1.0毫升，于100毫升容量瓶中，加純硫酸0.1毫升，以蒸餾水稀釋至刻度，于帶磨口玻璃瓶中保存。（周曉慧）實驗四 雙縮尿法測定蛋白質(zhì)含量 原理凡含有兩個以上

11、肽鍵的化合物在堿性溶液中能與硫酸銅作用生成紫色或紫紅色的復(fù)合物，這一反應(yīng)稱為雙縮尿反應(yīng)。蛋白質(zhì)含有肽鍵，因而一切蛋白質(zhì)均可與雙縮尿試劑發(fā)生顏色反應(yīng)，且顏色的深淺與蛋白質(zhì)濃度成正比，經(jīng)與同樣處理的標準蛋白溶液相比，即可求出樣品中的蛋白質(zhì)含量。 操作 1.標準曲線的制備 取6支試管按下表配成不同濃度的標準蛋白液試 劑123456標準蛋白溶液（10mg/ml）0.00.10.30.50.70.9生理鹽水（ml）1.00.90.70.50.30.1雙縮脲試劑(ml)4.04.04.04.04.04.0蛋白濃度(mg/ml)0.00.20.61.01.41.8混勻后，于37水浴中保溫15分鐘，在520n

12、m波長下比色，以第一管調(diào)零，測得各管的光密度。以各管的光密度值為縱坐標，以蛋白質(zhì)濃度為橫坐標，繪制標準曲線。 2.樣品測定取待測蛋白樣品0.1ml，加生理鹽水 0.9ml，再加雙縮脲試劑4.0ml，于37水浴中保溫15分鐘，測其光密度，查標準曲線即可得出樣品中的蛋白質(zhì)含量。 試劑 110g/L標準蛋白溶液：準確稱取經(jīng)凱式定氮法校正的結(jié)晶牛血清蛋白或人血清蛋白10g，用生理鹽水配成濃度為10mg /ml。 2雙縮尿試劑：稱取CuSO45H2O 2.5g、蒸餾水100ml加熱助溶。另取酒石酸鉀鈉10g、碘化鉀5g，溶于500毫升蒸餾水中，再加200 g/L NaOH 300ml混合，然后將硫酸銅溶

13、液傾入，加蒸餾水至1000 ml。 3.生理鹽水（周曉慧）實驗五 改良酚試劑法測定蛋白質(zhì)含量 原理蛋白質(zhì)中所含酪氨酸和色氨酸等殘基能在堿性條件下與酚試劑之磷鉬酸、磷鎢酸作用產(chǎn)生藍色化合物，其顏色深淺與蛋白質(zhì)含量成正比。利用藍色深淺與蛋白質(zhì)濃度成正比的關(guān)系可繪制標準曲線，測定樣品中蛋白質(zhì)含量。 操作 （一）制作標準曲線 1取試管6支分別編號，按下表加入試劑： 試 劑（ml）123456標準蛋白溶液（1mg/ml）0.00.20.40.60.81.0生理鹽水1.00.80.60.40.20.0試劑A0.90.90.90.90.90.9 混勻后置于50°C水浴10分鐘，冷卻后各管加入試劑B

14、 0.1ml，室溫放置10分鐘，各管加入試劑C 3ml，立即混勻，置37°C水浴箱恒溫10分鐘。冷卻后以1號管為空白，在分光光度計上以波長650nm比色，讀取光密度值。 2.以各標準樣品蛋白質(zhì)濃度為橫坐標，各管光密度值為縱坐標作標準曲線。（二）樣品測定 取試管2支，按下表加入試劑試 劑（ml）測定管空白管稀釋的待測樣品1.0-生理鹽水-1.0試劑A0.90.9 混勻后在50°C水浴箱中保溫10分鐘，取出冷卻后，兩管各加試劑B 0.1ml，室溫放置10分鐘，再各加試劑C 3ml，立即混勻，置37°C水浴箱保溫10分鐘，冷卻后在分光光度計上以波長650nm比色讀取光密

15、度值。 結(jié)果與計算根據(jù)測定管光密度值查標準曲線，由標準曲線計算樣品蛋白質(zhì)含量。注意事項 1.測定蛋白質(zhì)的濃度應(yīng)在0.0150.110mg/ml范圍。 2.各管加酚試劑必須快速，并立即搖勻，不應(yīng)出現(xiàn)混濁。試劑 1.標準蛋白溶液：稱量干燥的人血清白蛋白（BSA）或丙種球蛋白10mg，用生理鹽水配制成1mg/ml的標準蛋白溶液。 2試劑A：2g酒石酸鉀鈉及100g Na2CO3溶于500ml 1mol/L NaOH中，用蒸餾水稀至1000ml。 3試劑B：2g酒石酸鉀鈉及1g CuSO4×5H2O分別溶解于少量水中，混合后加蒸餾水至90ml，再加10ml 1mol/L NaOH即成。 4試

16、劑C： （1）市售的酚試劑，用1mol/L NaOH滴定相當于2.5 mol/L HCl，按110稀釋即可。 （2）稱取Na2WO4×2H2O 100g及Na2MoO4×2H2O 25g溶于700ml蒸餾水中，加入85% H3PO4 50ml，濃HCl 100ml混勻后，置圓底燒瓶中回流10小時，加入硫酸鋰（Li2SO4×H2O）150g、蒸餾水50ml及濃溴水數(shù)滴，繼續(xù)煮沸15分鐘去溴，冷卻后稀釋至1000ml，過濾，溶液應(yīng)為金黃色，置棕色瓶中保存，使用時稀釋至1mol/L。（周曉慧）實驗六 紫外分光光度法測定蛋白質(zhì)含量 原理 蛋白質(zhì)在280nm處的特征性吸收峰

17、，是由于其中所含有的芳香族氨基酸：酪氨酸、色氨酸、苯丙氨酸所引起的，其光密度和蛋白質(zhì)的濃度呈線性關(guān)系，可用于蛋白質(zhì)的定量。對于同樣濃度的不同蛋白質(zhì)，如果酪氨酸、色氨酸及苯丙氨酸含量不同，其光密度值也不同，選用標準蛋白質(zhì)時必須注意。若樣品中含有其它具有紫外吸收的雜質(zhì)，如核酸、核苷酸等，可產(chǎn)生較大的誤差，故應(yīng)作適當?shù)男Ｕ?。蛋白質(zhì)樣品中含有核酸時，混雜的核酸在280nm處也有吸收，對此法有一定的影響。因此，一般情況下在測定A280的同時，測定A260，計算A280/A260 的比值。如果A280/A2601.5，可忽略不計核酸的影響，A280/A260<1.5時，需按下列公式計算蛋白質(zhì)的濃度：

18、 蛋白質(zhì)濃度（mg/ml）=1.55A280-0.76A260 操作 1標準曲線的制備： 取試管8支按下表加入試劑試 劑（ml）12345678標準蛋白液（1mg/ml）0.0000.5001.0001.5002.0002.5003.0004.0000.9%NaCl溶液4.0003.5003.0002.5002.0001.5001.0000.000蛋白濃度(mg/ml)0.0000.1250.2500.3750.5000.6250.7501.000混勻，選波長280nm，用1cm石英比色杯，第一管為空白，分別測定各管溶液光密度值。以蛋白濃度為橫坐標，光密度值為縱坐標，繪制標準曲線。 2樣品測定

19、：將待測的蛋白樣品用0.9%NaCl溶液稀釋，使其濃度在蛋白標準曲線范圍之內(nèi)，混勻后按上述方法測定光密度值，查標準曲線，得出樣品的蛋白濃度。 試劑 1.標準蛋白液：準確稱取結(jié)晶牛血清白蛋白 （精確0.001）用0.9% NaCl溶液配置成1mg/ml的溶液（需用凱氏定氮法校正）。 2. 0.9% NaCl溶液。（周曉慧）實驗七 凝膠過濾層析分離血紅蛋白與硫酸銅 原理血紅蛋白（分子量64500）與銅溶液混合物，通過葡聚糖凝膠G-25層析柱，以蒸餾水為洗脫劑，進行分離大分子的血紅蛋白和小分子的硫酸銅。操作1凝膠的準備：葡聚糖凝膠G-25 1g，置于錐形瓶中，加蒸餾水30ml，于沸水浴中煮沸2小時（

20、或在室溫放置6小時），待冷卻至室溫時裝柱。2裝柱：在層析管底部填少許玻璃棉，關(guān)閉玻管的出口。然后自頂部緩緩加入葡聚糖凝膠G-25懸液。待底部凝膠沉積12cm時，打開出口。當凝膠上升至距柱頂3cm時即可。3樣品的制備：（1） 血紅蛋白的制備：取草酸鉀抗凝血2ml于離心管中，3000轉(zhuǎn)/分離心5 分鐘，棄去上清液，再用生理鹽水洗血細胞兩次。將血細胞用5倍體積蒸餾水稀釋。（2） 銅溶液的制備：將硫酸銅3.73g溶解于10ml熱蒸餾水中，冷卻后稀釋到15ml。另取檸檬酸鈉17.3g及碳酸鈉（Na2CO3·H2O）10g，加水60ml，加熱使之溶解，冷卻后稀釋到85ml。之后把硫酸銅溶液緩緩傾

21、入檸檬酸鈉-碳酸鈉溶液中。（3）取血紅蛋白稀釋液、銅溶液按2：3體積混合，作為樣品。4加樣：（1）將層析柱出口打開，使床表面的蒸餾水流出，直到床面正好露出，再關(guān)閉出口。（2）用小滴管將樣品（約0.8ml）沿柱內(nèi)壁緩緩地加于床面上，然后打開流出口，使樣品進入床內(nèi)，直到床面重新露出。（3）用上述方法加入約2ml蒸餾水。當將近流干時，反復(fù)加入多量蒸餾水，進行洗脫，直至紅藍兩條帶分開為止。試劑1 葡聚糖凝膠G-25。2 草酸鉀。3 生理鹽水。4 硫酸銅。5 檸檬酸鈉。6 碳酸鈉。（王魯華）實驗八 凝膠過濾層析分離血紅蛋白與魚精蛋白原理本試驗使用交聯(lián)葡聚糖凝膠（Sephadex G-50）將血紅蛋白（紅

22、色，分子量為64500）與二硝基氟苯-魚精蛋白，從混合液中分開。由于它們的分子量及顏色的不同，可以觀察到血紅蛋白洗脫較快，而魚精蛋白洗脫較慢。操作1凝膠的制備稱取Sephadex G-50 1g，置于錐形瓶中，加蒸餾水30ml，于沸水浴中煮沸1小時（此為加熱法溶脹，如在室溫溶脹，需浸泡3小時），取出冷卻至室溫后再行裝柱。2裝柱取直徑0.81.5cm，長度1720cm的層析管，在底部填砂芯或少許玻璃棉，裝上帶有螺旋夾和細玻管的橡皮管，垂直置于鐵架上，柱中先加入少量水，充滿細玻璃管，并殘留部分水于層析管下部，以排除層析柱底部及細玻管內(nèi)的氣泡。然后關(guān)閉玻管的出口，邊輕輕攪拌以蒸餾水稀釋的葡聚糖凝膠懸

23、浮液，邊將其自層析管頂部緩緩加入，待底部凝膠沉積12cm時，再打開出口，一面繼續(xù)加凝膠，待凝膠上升至距玻管頂3cm左右即可停止，最后以蒸餾水平衡凝膠柱。加入凝膠時速度應(yīng)均勻，并使凝膠均勻下沉，以免層析床分層，同時防止柱內(nèi)有氣泡。如層析床凝膠表面不平整，可在凝膠表面用細玻棒輕輕攪動，再讓凝膠自然沉降，使表面平整。3樣品的制備（1）血紅蛋白（Hb）溶液的制備：取草酸鉀抗凝血2ml于離心管中，以2500r/min離心5分鐘，棄去上層血漿，用0.9NaCl 5ml洗血細胞，重復(fù)三次，每次要把血球攪起，以3500r/min離心5分鐘后盡量棄去上清液。加蒸餾水5ml，充分混勻，放冰箱過夜使沉淀的血球充分溶

24、血，備用。（2）DNP-魚精蛋白的制備：稱取魚精蛋白0.15g，溶于10NaHCO3溶液1.5ml中（此時該蛋白質(zhì)溶液pH應(yīng)在8.59.0左右）。另取二硝基氟苯0.15g，溶于微熱的95乙醇3ml中，待其充分溶解后，立即傾入上述蛋白質(zhì)溶液中。將此管置于沸水浴中，煮沸5分鐘，冷卻后加2倍體積的95乙醇，可見黃色的DNP-魚精蛋白沉淀。離心5分鐘，棄去上清液，沉淀用95乙醇洗2次，所得沉淀用1ml蒸餾水溶解，即為DNP-魚精蛋白溶液，備用。（3）取血紅蛋白稀釋液0.1ml，加DNP-魚精蛋白溶液0.2ml，充分混勻，此混合液即為樣品溶液。4加樣加樣時先將層析管出口打開，使床表面蒸餾水流出，直到床面

25、正好露出，用下口較大的滴管，將上述樣品（約0.3ml）緩緩沿層析柱內(nèi)壁小心地加于床表面，注意盡量不使床面攪動，然后打開出口，使樣品進入床內(nèi)，直到床面重新露出，重復(fù)上法加12倍于樣品體積的蒸餾水，這樣可使樣品的稀釋最小，而樣品又完全進入床內(nèi)。當少量蒸餾水將近流干時，加入蒸餾水使其充滿層析柱上面空間，開始洗脫。5洗脫與收集反復(fù)加入蒸餾水洗脫，調(diào)節(jié)出口處螺旋夾，使洗脫速度在0.51.0ml分左右（約1015滴分）洗脫時可觀察到黃、紅兩條區(qū)帶逐漸分開，當紅色的血紅蛋白區(qū)帶到達玻管下端時，用帶刻度的離心管收集流出液，直至紅色液全部流出為止，待測。再換以另一離心管，收集黃色的DNP-魚精蛋白洗脫液，直至黃

26、色液全部洗出為止，此液可回收重新使用。結(jié)果與計算取一試管吸取前述血紅蛋白液0.1ml，加蒸餾水至5ml作為標準管（上柱前液），取收集的血紅蛋白液加蒸餾水至5ml。以蒸餾水為對照，測得標準管及收集管液體在540nm波長處的光密度值，按下列公式計算血紅蛋白的回收率。血紅蛋白回收率（）洗脫收集液光密度值上柱前液光密度值 ×100試劑1 Sephadex G-502 草酸鉀抗凝血液3 0.9NaCl4 魚精蛋白5 10NaHCO36 2，4-二硝基氟苯7 95乙醇（王魯華）實驗九 血清蛋白醋酸纖維薄膜電泳 原理 血漿中的各種蛋白質(zhì)，它們的等電點都在pH7.0以下，如將它們置于pH8.6的緩沖

27、液中電泳時，它們都解離成負離子，向正極移動。在同一pH溶液中，由于各種蛋白質(zhì)所帶電荷的數(shù)量不同以及分子大小不同，因此它們在電場中的移動速度也有差別，利用這種性質(zhì)可以把各種蛋白質(zhì)分開。 醋酸纖維薄膜作為電泳支持物具有電滲小、分離速度快，區(qū)帶清晰、操作簡便等優(yōu)點。醋酸纖維薄膜電泳可將血清蛋白分為白蛋白及1-球蛋白、2-球蛋白、-球蛋白-球蛋白等5條區(qū)帶。固定染色之后，不僅可看到清晰的色帶，并可將各帶染料溶于堿溶液中進行定量測定，從而計算出血清中各種蛋白質(zhì)的構(gòu)成比。 操作 1準備與點樣： （1）將薄膜切成2×8cm的小條，在薄膜無光澤面距端1.5cm處用鉛筆畫一橫線，表示點樣位置。 （2）

28、將薄膜無光澤面向下，浸入巴比妥緩沖液中(緩沖液盛于培養(yǎng)皿中)。 （3）將充分滲透(指膜上沒有白色斑痕)的膜條取出，用濾紙吸去多余的緩沖液，把膜條兩端各貼于兩塊玻片上使點樣線駕空。 (4)吸取少量血清滴于普通玻璃板上，用X光片或加樣器的鋼口蘸取樣品，平直印于膜上，待血清全部滲入膜內(nèi)，移開點樣器。 2電泳：將點樣后的膜條置于電泳槽架上，放置時無光澤面(即點樣面)向下，點樣端置于陰極。槽架上四層紗布怍橋墊，膜條與紗布需貼緊，待平衡5分鐘后通電，調(diào)節(jié)電壓至90V，或電流為0.40.6mA/cm寬，通電1小時左右關(guān)閉電源。 3染色：通電完畢后用鑷子將薄膜取出，直接浸于盛有氨基黑10B的染色液中，染5分鐘

29、取出，首先用自來水沖洗一下，然后立即浸入盛有漂洗液的培養(yǎng)皿中，反復(fù)漂洗數(shù)次，直至背景變白為止。用濾紙吸干薄膜。 4定量：（1）取試管6支，編好號碼，分別加入0.4mol/L氫氧化鈉4ml。（2）剪開薄膜上各條蛋白色帶，另于空白部位剪平均六小的薄牽，分別浸入上述試管內(nèi)，不時搖動，使藍色洗出。（3）約半小時后，用分光光度計進行比色，在650nm波長下讀取各管的光密度，用空白薄膜條洗出液為空白對照。 計算 光密度總和T=A+1+2+ 各部分蛋白質(zhì)的構(gòu)成比為： 白蛋白=A/T；1球蛋白=1/T：依次類推。 臨床意義 1 正常值：白蛋白為0.540.61；1球蛋白為0040.06；2球蛋白為0070.0

30、9；球蛋白為0.100.13；球蛋白為0.170.222 肝硬化時，白蛋白顯著降低，球蛋白升高23倍。腎病綜合征時，白蛋白降低，2、球蛋白升高。 試劑 1.巴比妥緩沖液（pH8.6）：巴比妥鈉12.76g、巴比妥1.66g、蒸餾水加熱溶解后再加水至1000ml（離子強度0.06）。 2，氨基黑10B染色液：氨基黑10B 0.5g、甲醇50 ml、冰醋酸10 ml、蒸餾水40 ml。 3漂洗液：95%乙醇45 ml、冰醋酸5 ml、蒸餾水50 ml。 40.4mol/L NaOH。（王文勇）實驗十一 血清-球蛋白的分離、純化及鑒定 原理 為了研究蛋白質(zhì)的性質(zhì)、結(jié)構(gòu)及功能，首先要從大分子體系中分離

31、純化這種蛋白質(zhì)，并且須保持天然蛋白質(zhì)原有的結(jié)構(gòu)與生物學(xué)活性（即不變性）是比較復(fù)雜的，蛋白質(zhì)分離主要是利用各種蛋白質(zhì)性質(zhì)的不同，尤其是蛋白質(zhì)在不同酸、堿環(huán)境中的性質(zhì)和電學(xué)性質(zhì)的差異。分離蛋白質(zhì)常用的方法有：鹽析、層析、超離心、超過濾等，根據(jù)目的要求不同，可分別采用這些方法或幾種方法配合使用。本實驗以分離純化血清-球蛋白為例，介紹一種蛋白質(zhì)的分離純化方法。過程包括：鹽析、離心分離、凝膠層析、離子交換層析純化、濃縮和電泳鑒定等幾個步驟。 （一）鹽析法粗提蛋白質(zhì) 血清中含有清蛋白和球蛋白（a- b- g- 、球蛋白），由于它們所帶電荷不同，分子量不同，在高濃度鹽溶液中溶解度不同，因此，可利用它們在中性

32、鹽溶液中（常用硫酸銨、硫酸鈉等）溶解度的差異而進行沉淀分離，此法稱為鹽析法。由于各種蛋白質(zhì)分子的顆粒大小和親水程度不同，故鹽析所需的鹽濃度不一，調(diào)節(jié)鹽的濃度可使不同的蛋白質(zhì)沉淀析出，達到分離目的。 本實驗采用在血清中加入50%飽和度的硫酸銨，使球蛋白沉淀析出，清蛋白則仍溶解于溶液中，經(jīng)離心分離獲得沉淀部分，即為含有g(shù)-球蛋白的粗制品。 （二）凝膠過濾層析法脫鹽用鹽析法分離而得到的蛋白質(zhì)中含有大量的中性鹽，會妨礙蛋白質(zhì)的進一步純化，因此必須首先去除。常用的方法有透析法、凝膠過濾層析法等。凝膠過濾層析法主要根據(jù)混合物中分子大小不同的各種物質(zhì)，隨流動相流經(jīng)作為固定相的凝膠層析柱時，各種物質(zhì)分子擴散移

33、動速度不同使混合物中各種物質(zhì)得到分離的技術(shù)。凝膠有多種，葡聚糖凝膠（Sephadex）是常用的一種人工合成的凝膠，脫鹽用sephadexG-25層析柱，它的骨架是-1，6-糖苷鍵聯(lián)接成的直鏈葡聚糖，由環(huán)氧氯丙烷作交聯(lián)劑制成的多孔網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的多聚物。結(jié)果大分子物質(zhì)（蛋白質(zhì)）直徑大，不能進入凝膠顆粒的網(wǎng)孔中，垂直向下移動，速度快。而小分子物質(zhì)（無機鹽）可擴散入凝膠顆粒網(wǎng)孔中，流經(jīng)的路程長、速度慢，從而使混合物中各組分按分子大小不同的順序流出，蛋白質(zhì)先流出，無機鹽后流出，得到除去鹽的蛋白質(zhì)溶液 （三）離子交換層析純化蛋白質(zhì)純化蛋白質(zhì)的方法很多，如各種層析方法：離子交換層析、凝膠層析、吸附層析及親和層析

34、等；各種電泳方法：可選用制備區(qū)帶電泳、等電聚焦電泳及蛋白質(zhì)結(jié)晶等。本實驗采用DEAE-纖維素二乙基氨乙基，-CH2-CH2-N+H（CH2-CH3）2 離子交換層析法進一步純化g-球蛋白。蛋白質(zhì)是兩性電解質(zhì)，本實驗所調(diào)整的溶液pH為6.5，此時溶液中的清蛋白pI 4.7、-球蛋白pI 5.06、-球蛋白pI 5.12皆帶負電荷，而r-球蛋白pI 7.3帶正電荷。DEAE-纖維素是一種陰離子交換樹脂，本身帶有正電荷，可與溶液中帶負電荷的離子結(jié)合，如-球蛋白、-球蛋白等。而帶正電荷的r-球蛋白則不能結(jié)合在樹脂上，因而在洗脫的溶液中只留有r-球蛋白，以達到純化的目的。 （四）濃縮干燥的葡聚糖凝膠顆粒

35、內(nèi)部有孔隙容積。當把干燥的葡聚糖凝膠顆粒投入稀的高分子溶液中時水分和低分子量物質(zhì)就會進入凝膠顆粒內(nèi)部的孔隙直到充滿為止，而高分子物質(zhì)則排阻于凝膠顆粒之外，因此，經(jīng)十幾分鐘后通過離心或過濾就可分離出膨脹的凝膠顆粒，得到濃縮了的高分子溶液。 利用葡聚糖凝膠G-25型干膠吸水膨脹，而不吸入蛋白質(zhì)的特性，在已純化的-球蛋白溶液中加入適量葡聚糖凝膠G-25型干膠。離心約5分鐘（3000轉(zhuǎn)/分）。上清液即為濃縮的-球蛋白溶液。 （五）電泳法鑒定（醋酸纖維素薄膜電泳法）利用醋酸纖維素薄膜作為電泳支持物，將未分離純化的原血清樣品點樣于膜上進行電泳時，可將血清蛋白分為清蛋白、1、2、 及-球蛋白等5條區(qū)帶，而用

36、分離純化后的-球蛋白溶液點樣電泳，在-球蛋白相應(yīng)位置僅呈現(xiàn)1條區(qū)帶（電泳遷移率相同），將區(qū)帶洗脫，或直接掃描，可計算出各種蛋白質(zhì)的百分含量。 操作（一）鹽析粗提：取正常人血清2.0ml于小試管中，邊搖邊緩慢加入飽和硫酸銨溶液2.0ml，使之成為半飽和溶液?；靹蚝笫覝胤胖?0分鐘，3000轉(zhuǎn)/分，離心10分鐘，棄去含有清蛋白的上清液。于沉淀中加蒸餾水1.0ml，振搖使之溶解，此液即為粗提的球蛋白溶液。（二）脫鹽：1.凝膠處理：（老師準備），稱取葡聚糖凝膠G-25型6.0g于小燒杯中，加100ml蒸餾水，置沸水浴1小時，并以玻璃棒輕輕攪動以使氣泡逸出。冷卻置室溫，待凝膠大部下沉后，棄去含有細微懸浮

37、凝膠顆粒的上清液。加蒸餾水約100ml輕輕攪動片刻，再棄去含有細微顆粒的上清液。加0.02mol/L pH 6.5醋酸銨溶液100ml。輕攪拌片刻，待大部分凝膠下沉后，棄去含有細微顆粒的上清液，再加醋酸銨溶液100ml重復(fù)處理一次，最后加入醋酸銨溶液20ml，此即為已溶脹備用的凝膠溶液。2.裝柱：取一層析管（1.5´20cm 或25ml堿式滴定管），垂直夾于鐵架臺上，關(guān)閉玻管出口，先加入醋酸銨溶液約10ml,打開出口讓硫酸銨溶液充滿下部容器然后排出，以排除空氣。關(guān)閉出口，自玻管頂部緩慢加入溶脹后的葡聚糖凝膠混懸液，邊加邊攪拌，保持凝膠均勻連續(xù)地沉降，當混懸液達玻管頂部時，打開出口，以

38、螺旋夾控制流速10-20滴/分，繼續(xù)加混懸液，待凝膠面上升至距玻管頂口3cm左右時即可停止，柱床面留一層液體。3.平衡：用螺旋夾控制流速8-10滴/分，用醋酸銨溶液（ pH6.5）流洗平衡幾分鐘后，即可使用。凝膠管柱上端平衡液始終不少于1cm高度，不得出現(xiàn)干膠和斷層，并應(yīng)保持凝膠面平整。4.上樣：即樣品上柱，待層析液（醋酸銨溶液 pH 6.5）上端的液面剛好下降至凝膠表面時（切勿進入空氣）將凝膠層析管下端的螺旋夾擰緊，這時將鹽析所得的球蛋白溶液用滴管小心加入層析柱內(nèi)，打開螺旋夾，用試管收集流出的液體，當球蛋白溶液恰好完全進入凝膠柱上端面內(nèi)時，立即用2ml醋酸銨溶液小心沖洗管壁上的蛋白質(zhì)，然后再

39、重復(fù)沖洗一次。5.洗脫：反復(fù)加入多量醋酸銨溶液進行洗脫，洗脫速度為10滴/分，每當試管內(nèi)收集到1ml(約15滴)液體時，應(yīng)取1滴置磁反應(yīng)板上加入200g/L磺基水楊酸試劑檢驗有無蛋白質(zhì)流出，如有則呈白色混濁。每收集1ml換一試管，并不斷檢查蛋白質(zhì)，直到反應(yīng)呈陰性為止。再分別從每個試管各取出1滴蛋白液置磁反應(yīng)板上加入50g/L醋酸鋇，直至檢查出現(xiàn)白色的BaSO4沉淀為止，將含蛋白質(zhì)而無硫酸銨的溶液合并，此即為已脫鹽的球蛋白溶液，待進一步純化。6凝膠的再生與保存：葡聚糖凝膠可柱內(nèi)再生，故凝膠層析柱可重復(fù)使用，每次用完后以醋酸銨溶液進行充分洗滌，留待再用。為防止凝膠霉變，可用含0.02%疊氮化鈉的醋

40、酸銨溶液進行流洗后再放置。長時間不用，宜將凝膠從柱內(nèi)倒出，以濕態(tài)保存，只要在其中加適當?shù)囊志鷦┤?.02%疊氮化鈉置4oC冰箱內(nèi)，可放置幾個月至一年，不需要干燥。如凝膠柱有輕微污染，則可用0.2mol/LNaOH和0.5mol/LNaCl的混合液處理。 （三）純化 1DEAE-纖維素處理：稱取DEAE-纖維素3.0g，加0.5mol/L鹽酸溶液45ml，攪拌后放置30分鐘，加蒸餾水250ml，攪勻，待纖維素大部分下沉后，棄去含有細微顆粒的上層液體，如此反復(fù)2-3次，用蒸餾水洗至流出液pH4.0，再加0.5mol/L氫氧化鈉溶液45ml，攪拌后放置30分鐘，棄取上層液體，再用蒸餾水洗至pH7.0

41、，棄上層液體后加醋酸銨溶液約200ml,用1mol/L的醋酸調(diào)至pH6.5（約5ml），留待裝柱。 2裝柱：與葡聚糖凝膠層析裝柱法相同。 3.平衡：用pH6.5醋酸銨溶液、平衡的方法、時間同葡聚糖凝膠層析。 4.上樣：將脫鹽收集的球蛋白溶液上柱，方法過程與脫鹽法相同。 5.洗脫：用pH 6.5醋酸銨溶液反復(fù)加入多量進行洗脫，流速20-30滴/分，方法與上述脫鹽法相同，同樣用200g/L磺基水楊酸檢查有無蛋白流出。此次收集的即為純化的-球蛋白溶液，留待濃縮及鑒定。 6.DEAE-纖維素的再生與保存：先用1.5mol/L NaCl-0.3mol/L NH4Ac溶液流洗幾遍，再用0.02mol/L醋

42、酸銨溶液（pH6.5）洗滌平衡后可重復(fù)使用。 （四）濃縮 將純化后的-球蛋白溶液量其體積，每毫升加葡聚糖凝膠G-25干膠顆粒0.25g，吸收水分，搖動2-3分鐘，離心5分鐘（3000轉(zhuǎn)/分），上清液即為濃縮的-球蛋白溶液，用吸管吸至另一個小試管中，留待電泳鑒定。 （五）電泳法鑒定 1準備：在2´8cm醋酸纖維薄膜無光澤面距一端1.5cm處用鉛筆輕劃一條線，表示點樣的位置。 2.浸泡醋酸纖維薄膜：將薄膜無光澤面向下，漂浮于巴比妥緩沖液面上，使膜條自然浸濕下沉，浸泡一般要大于2小時，最好過夜，充分浸透至膜上沒有白色斑痕。 3點樣：將充分浸透的膜條取出，用濾紙吸去多余的緩沖液，吸取少量血清

43、滴于玻片上，用X光片或加樣器的鋼口蘸取血清，平直印在點樣線上，待血清完全浸入薄膜后移開。另點樣一條膜條，吸取少量已純化的-球蛋白溶液滴于玻片上，其它操作同上述血清點樣。注意點樣位置與血清薄膜一致，以便比較遷移率。 4電泳：將點樣膜條置于電泳槽上，使點樣面向下，點樣端置于陰極，槽架上用四層濾紙或兩層紗布作橋架，膜條與濾紙需貼緊，平衡約5分鐘后接通電源，調(diào)節(jié)電壓100-110V，穩(wěn)定電流為0.4-0.6mA/cm寬膜條，通電50-60分鐘后關(guān)閉電源停止電泳。 5染色：用鑷子將電泳后的膜條取出，浸于盛有氨基黑10B 的染色液中，染色5分鐘取出，先用蒸餾水沖一下，立即按順序浸入不同杯的漂洗液中漂洗4-

44、5次，直至薄膜背景漂凈為止，用濾紙吸干薄膜。對照觀察血清薄膜與-球蛋白薄膜兩者的電泳區(qū)帶分析結(jié)果。血清-球蛋白分離、純化及鑒定操作流程2.0ml血清加2.0ml飽和硫酸銨溶液 混勻，放置10分鐘 3000轉(zhuǎn)/分 離心10分鐘 鹽析 沉淀（球蛋白），加1ml水溶解 上清液為清蛋白部分，棄去 脫鹽 上葡聚糖凝膠柱 用0.02mol/L、pH6.5醋酸銨溶液洗脫，收集含蛋白質(zhì)部分 純化 上DEAE-纖維素柱 用0.02mol/L、pH6.5醋酸銨溶液洗脫，收集含蛋白質(zhì)部分 濃縮 用葡聚糖凝膠G-25干膠濃縮 鑒定 用醋酸纖維素薄膜電泳鑒定 注意事項 1由于醋酸銨是揮發(fā)性鹽類，故溶液配置時不得加熱，配

45、好后必須密封保存，以防pH及濃度發(fā)生改變，否則會影響所分離蛋白質(zhì)純度。 2.用HCl處理DEAE-纖維素時，時間不宜過長，否則DEAE-纖維素會發(fā)生變質(zhì)。 試劑 1. 0.3mol/L醋酸銨溶液（pH 6.5）：稱取醋酸銨23.13g，加蒸餾水約800ml溶解，用酸度計準確調(diào)制節(jié)至pH6.5（用稀氨水或稀乙酸），再加蒸餾水定容至1000ml。 2. 0.02mol/L醋酸銨溶液（pH 6.5）：取1液用蒸餾水稀釋15 倍，在準確調(diào)整至pH6.5。 3. 1.5mol/L NaCl-0.3mol/L NH4Ac溶液：稱取NaCl 87.7g，溶于0.3mol/L NH4Ac(pH6.5)中定容至

46、1000ml。 4. 飽和硫酸銨溶液：稱取固體硫酸銨850g，加入1000ml蒸餾水中，在70-80oC攪拌促溶，室溫放置過夜，瓶底析出白色結(jié)晶，上清液即為飽和硫酸銨溶液。 5. 200g/L磺基水楊酸 6. 50g/L 醋酸鋇：3.5ml HAc + 2.6g Ba(OH)2 + 蒸餾水至100ml。 7.0.5mol/L HCl溶液 8. 0.5mol/L NaOH溶液 9. pH8.6巴比妥緩沖液：稱取巴比妥鈉12.76g,巴比妥，1.66g 用蒸餾水加熱溶解后，再加蒸餾水至1000ml。 10氨基黑10B染液：稱取氨基黑10B 0.5g 溶解于50ml甲醇中，再加冰醋酸10ml及蒸餾水

47、40ml。 11漂洗液：量取95%乙醇45ml，加冰醋酸5ml，蒸餾水50ml混勻。 12葡聚糖凝膠G-25 (SephadexG-25)。 13.DEAE- 纖維素。 14正常血清。 （周曉慧）實驗十二 動物肝組織中核酸的提取和鑒定原理動物組織中的核糖核酸（RNA）與脫氧核糖核酸（DNA）大部分與蛋白質(zhì)結(jié)合形成核蛋白。肝組織中的核蛋白可用水提取，再用酚破壞核酸與蛋白質(zhì)之間的結(jié)合鍵，并用乙醚抽提除去蛋白質(zhì)及其它雜質(zhì)，最后用乙醇將核酸沉淀。核酸（RNA，DNA）可被硫酸水解產(chǎn)生磷酸、有機堿（嘌呤和嘧啶）及戊糖（核糖或脫氧核糖）。此三類化合物可用下列方法鑒定：磷酸 能與鉬酸試劑作用生成磷鉬酸，后者

48、在還原劑的作用下還原形成鉬藍，常用的還原劑有氨基苯磺酸、氯化亞錫、維生素C等。H3PO4+12H2MoO4 H3PO4·12MoO3 +12H2O 鉬酸 磷鉬酸還原劑H3PO4·12MoO3 H3PO4·6MoO3·3Mo2O5 鉬藍嘌呤堿 能與苦味酸作用形成針狀結(jié)晶。核糖 經(jīng)與強酸（鹽酸或硫酸）共熱生成糠醛，后者與3，5-二羥甲苯（5-甲基-1，3-苯二酚，苔黑酚orcinol）反應(yīng)，縮合而成綠色化合物。脫氧核糖 在強酸中加熱可生成-羥基-酮基戊醛，后者與二苯胺作用生成藍色化合物。操作（一） 動物肝組織中核酸的提取1將兩只小白鼠處死，剖腹取出肝臟，用清

49、水除去血液后置于研缽中（或用兔肝2-5g）加入凈砂少許，研磨至糊狀，再加蒸餾水3ml繼續(xù)研磨3分鐘。1 再加入90%苯酚5ml，研磨10分鐘后倒入一圓底離心管中，離心5分鐘（約250r/min）。 3將上層液體移于另一圓底離心管中，加乙醚2ml，管口覆蓋聚乙烯薄膜后用拇指將管口按住，用力振搖12分鐘（或用玻璃棒攪拌）。離心5分鐘后吸取全部下層液體于另一圓底離心管中。4于該管中加入95%乙醇2ml，并用玻璃棒攪拌約2分鐘，離心3分鐘后傾去上清液，沉淀即為核酸。（二）核酸的水解在核酸沉淀管內(nèi)加入5硫酸4ml搖勻，置沸水浴中加熱15分鐘，即得核酸水解液。用流水冷卻后進行下列定性實驗。（三）核酸組分的

50、定性鑒定1磷酸的鑒定：取試管2支，編號，按下表加入試劑，搖勻，于沸水浴中23分鐘，觀察兩管顏色之變化。試劑（滴）測定管（U）對照管（B）核酸水解液5%硫酸鉬酸試劑4%維生素C105410542嘌呤堿的鑒定：取試管支，加入飽和苦味酸約2ml，再加入核酸水解液46滴，搖勻，靜置于室溫中，觀察有無黃色針狀結(jié)晶出現(xiàn)。3核糖的鑒定：取試管兩支，編號，按下表操作。試劑（滴）測定管（U）對照管（B）核酸水解液5%硫酸拜耳氏試劑6969搖勻，于沸水浴中加熱5分鐘后，觀察兩管顏色的變化。4脫氧核糖的鑒定：取試管兩支，編號，按下表操作。試劑（滴）測定管（U）對照管（B）核酸水解液5%硫酸二苯胺試劑20402040

51、搖勻，于沸水浴中加熱10分鐘，觀察兩管顏色的變化。注意事項1在制備肝勻漿時要充分研磨，破壞肝組織。2肝組織可取自小鼠、家兔或豬肝，但以兔肝效果較好。以2公斤家兔計，兔肝重70g左右，每實驗室僅需1只家兔。3實驗中使用乙醚、乙醇等易燃溶劑，又要使用沸水浴，如用明火加熱者應(yīng)注意防火，以防發(fā)生事故。試劑190%苯酚溶液。2乙醚。395%乙醇。45%硫酸。54%維生素C溶液（已氧化變質(zhì)的維生素C不能用）。6鉬酸試劑：鉬酸銨5g溶于100ml蒸餾水中，再加入濃硫酸15ml。冷卻后加蒸餾水至1000ml，冷處保存（一個月內(nèi)不變質(zhì)）。7飽和苦味酸溶液 苦味酸約1.3g，溶于100ml蒸餾水中，靜置過夜。臨用

52、前取上清液。8拜耳（Bial）氏試劑 稱取1.5g3，5-二羥甲苯，加入濃鹽酸500ml，再加10%氯化高鐵20至30滴。臨用前配制，冰箱保存。9二苯胺試劑 取二苯胺1g溶于100ml冰乙酸（A.R.），加入2.75ml濃硫酸。臨用前配制，儲于棕色瓶中。（王魯華）實驗十三 動物組織中DNA的提取原理動物組織中的基因DNA均以脫氧核糖核蛋白的形式存在。在濃氯化鈉（12mol/L）溶液中，脫氧核糖核蛋白的溶解度很大，而核糖核蛋白的溶解度很小。在稀氯化鈉（0.14mol/L）溶液中，脫氧核糖核蛋白的溶解度很小，而核糖核蛋白的溶解度很大。因此，可利用不同濃度的氯化鈉溶液，將脫氧核糖核蛋白和核糖核蛋白從樣品中分別抽提出來。將抽提得到的脫氧核糖核蛋白用SDS處理，使DNA與蛋白質(zhì)分開，再用氯仿-異丙醇將蛋白質(zhì)沉淀除去，而DNA溶于上層水相中，加入適量的95%乙醇，DNA鈉鹽即沉淀析出。為防止DNA酶解，提取時應(yīng)加入EDTA二鈉（乙二胺四乙酸）。得到的樣品中DNA含量可用二苯胺法定量測定。DNA分子中的脫氧核糖基，在酸性溶液中轉(zhuǎn)變成-羥基-酮基戊醛，與二苯胺試劑作用生成藍色化合物，可用比色法測定。操作 1.DNA的分離純化：（1）將10只小白鼠迅速殺死，取出肝臟，用0.14mol/L NaCl-