培養(yǎng)基(含測試試劑)質(zhì)量控制規(guī)程

1、文件類型：操作指導(dǎo)書 第01版第0次修改 文件名稱：培養(yǎng)基（含測試試劑）質(zhì)量控制規(guī)程 文件編碼：WHHDSPJT/QM03-506D-00培養(yǎng)基（含測試試劑）質(zhì)量控制規(guī)程一、培養(yǎng)基制備要求培養(yǎng)基的一般性狀：液體培養(yǎng)基應(yīng)透明、清亮，顏色符合要求。固體培養(yǎng)基應(yīng)表面濕潤但無水汽、平整光滑，厚薄均勻，一般厚度在3mm（M-H平板厚度不得<4mm）。斜面的長度不得超過試管長度的2/3)。PH值應(yīng)在規(guī)定值±0.2的范圍內(nèi)。培養(yǎng)基制備的質(zhì)量將直接影響微生物生長。因?yàn)楦鞣N微生物對其營養(yǎng)要求不完全相同，培養(yǎng)目的的不同，各種培養(yǎng)基制備要求如下：1. 根據(jù)培養(yǎng)基配方的成分按量稱取，然后溶于蒸餾水中，

2、在使用前對應(yīng)用的試劑藥品應(yīng)進(jìn)行質(zhì)量檢驗(yàn)。2. PH測定及調(diào)節(jié)：PH測定要在培養(yǎng)基冷至室溫時進(jìn)行，因在熱或冷的情況下，其PH有一定差異，當(dāng)測定好時，按計(jì)算量加入堿或酸混勻后，應(yīng)再測試一次。培養(yǎng)基PH值一定要準(zhǔn)確，否則會影響微生物的生長或影響結(jié)果的觀察。但需注意因高壓滅菌可影響一些培養(yǎng)基的PH降低或升高，故不宜滅菌壓力過高或次數(shù)太多，以免影響培養(yǎng)基的質(zhì)量，指示劑、去氧膽酸鈉、瓊脂等一般在調(diào)完P(guān)H后再加入。3. 培養(yǎng)基需保持澄清，便于觀察細(xì)菌的生長情況，培養(yǎng)基加熱煮沸后，可用脫脂棉花或絨布過濾，以除去沉淀物，必要時可用雞蛋白澄清處理，所用瓊脂條要預(yù)先洗凈涼干后使用，避免因瓊脂含雜質(zhì)而影響透明度。4.

3、 盛裝培養(yǎng)基不宜用鐵、銅等容器，使用洗凈的中性硬質(zhì)玻璃容器為好。5. 培養(yǎng)基的滅菌既要達(dá)到完全滅菌目的，又要注意不因加熱而降低其營養(yǎng)價(jià)值，一般12115min即可，如為含有不耐高熱物質(zhì)的培養(yǎng)基如糖類、血清、明膠等，則應(yīng)采用低溫滅菌或間歇法滅菌，一些不能加熱的試劑如亞碲酸鉀、卵黃、TTC、抗菌素等，待基礎(chǔ)瓊脂高壓滅菌后涼至50左右再加入。6. 每批培養(yǎng)基制備好后，應(yīng)做無菌生長試驗(yàn)及所檢菌株生長試驗(yàn)。如果是生化培養(yǎng)基，使用標(biāo)準(zhǔn)菌株接種培養(yǎng)，觀察生化反應(yīng)結(jié)果，應(yīng)呈正常反應(yīng)，培養(yǎng)基不應(yīng)貯存過久，必要時可置4冰箱存放。7. 目前各種干燥培養(yǎng)基較多，每批需用標(biāo)準(zhǔn)菌株進(jìn)行生長試驗(yàn)或生化反應(yīng)觀察，各種培養(yǎng)基用

4、相應(yīng)菌株生長試驗(yàn)良好后方可應(yīng)用，新購進(jìn)的或存放過久的干燥培養(yǎng)基，在配制時也應(yīng)測PH，使用時需根據(jù)產(chǎn)品說明書用量和方法進(jìn)行。8. 每批制備的培養(yǎng)基所用化學(xué)試劑、滅菌情況及菌株生長試驗(yàn)結(jié)果、制作人員等應(yīng)做好記錄，以備查詢。二、培養(yǎng)基的質(zhì)量控制培養(yǎng)基的質(zhì)量控制主要包括三方面的內(nèi)容：pH測試、無菌試驗(yàn)以及已知菌生長試驗(yàn)。如果使用商品化脫水培養(yǎng)基，嚴(yán)格按照說明操作，一般不必再進(jìn)行pH測試。如果使用基礎(chǔ)物質(zhì)進(jìn)行培養(yǎng)基制備，在培養(yǎng)基冷卻后須進(jìn)行pH測試。如果pH測得值與預(yù)期值相差0.2單位，則需要酸堿調(diào)節(jié)；無菌試驗(yàn)一般為隨機(jī)抽樣3-5，在35條件下培養(yǎng)48h。如果抽樣中每個培養(yǎng)基上出現(xiàn)2個以上菌落，證明本批

5、培養(yǎng)基已被污染；已知菌生長試驗(yàn)的前提條件是實(shí)驗(yàn)室有足夠的已知菌儲備，其中包括標(biāo)準(zhǔn)菌株(如ATCC或NCTC標(biāo)準(zhǔn)菌株)及經(jīng)過準(zhǔn)確鑒定的臨床分離菌。如果條件允許，提倡使用標(biāo)準(zhǔn)菌株。有關(guān)常用培養(yǎng)基的已知菌生長試驗(yàn)見表1。表1 常用培養(yǎng)基已知菌生長試驗(yàn) 培養(yǎng)基 孵育條件 已知菌株(ATCC) 預(yù)期結(jié)果 血瓊脂 需氧或 化膿性鏈球菌19615 生長并產(chǎn)生a-溶血 C02，24h 肺炎鏈球菌6305 生長并產(chǎn)生-溶血 大腸埃希菌25922 生長 巧克力瓊脂 CO2，24-48h 淋病奈瑟菌43069 生長 流感嗜血桿菌10211 生長 麥康凱瓊脂 需氧，24h 大腸埃希菌25922 生長，粉紅色菌落 (不

6、含結(jié)晶紫) 奇異變形桿菌12453 生長，無色菌落，遷徙現(xiàn)象受抑制 鼠傷寒沙門菌14028 生長，無色菌落 糞腸球菌29212 生長 金黃色葡萄球菌25923 生長，粉紅色菌落 大腸埃希菌25922 生長，粉紅色菌落 麥康凱瓊脂 需氧，24h 奇異變形桿菌12453 生長，無色菌落，遷徙現(xiàn)象受抑制(含結(jié)晶紫) 鼠傷寒沙門菌14028 生長，無色菌落 糞腸球菌29212 抑制(部分或完全) 金黃色葡萄球菌25923 抑制(部分或完全) 鼠傷寒沙門菌14028 生長 福氏志賀菌12022  生長 SS瓊脂 需氧，24h 糞腸球菌29212 抑制(部分或完全) 大腸埃希菌25922 抑制(

7、部分或完全) 大腸埃希菌25922 生長 營養(yǎng)肉湯 需氧，24-48h 金黃色葡萄球菌25923 生長 (無添加物) 1、無菌試驗(yàn) 新制備的培養(yǎng)基要按批號隨機(jī)抽取一定數(shù)量的標(biāo)本作無菌試驗(yàn)。無細(xì)菌生長結(jié)果合格，有細(xì)菌生長，說明培養(yǎng)基已受雜菌污染，除了尋找原因外，應(yīng)不再使用。 對于分裝后進(jìn)行滅菌的培養(yǎng)基，一般隨機(jī)抽取5%10%，置35卵育24h。對無菌手續(xù)分裝的培養(yǎng)基，則應(yīng)對全部培養(yǎng)基35卵育24h。對選擇性培養(yǎng)基，應(yīng)取部分培養(yǎng)基加入1020倍無抑制性肉湯培養(yǎng)基如TSB，稀釋抑制物質(zhì)，置35卵育24h。2、細(xì)菌生長試驗(yàn) 要用已知標(biāo)準(zhǔn)菌株按照NCCLS推薦的方法測定培養(yǎng)基性能是否符合要求。 保存&#

8、216; 避光 。Ø 避熱。Ø 存放陰涼處，其保存期限與所用儲存的容器類型有關(guān)。Ø 常用的保存期為：Ø 用脫脂棉堵塞的試管，1周；Ø 用軟木塞堵的試管，2周；Ø 有旋蓋的容器，3周；Ø 平皿培養(yǎng)基（放在密封的塑料袋中），41周；Ø 平皿培養(yǎng)基，當(dāng)天。培養(yǎng)基空氣卵育時間質(zhì)控菌株（ATCC號）預(yù)期結(jié)果肉湯需氧24h鼠傷寒沙菌（14028）傳代生長宋內(nèi)氏志賀菌（9290）傳代生長大腸埃希氏菌（25922）傳代受抑制EMB需氧24h鼠傷寒沙菌（14028）生長，無色到琥珀色菌落糞腸球菌（9290）（部分）大腸埃希氏菌（25

9、922）生長，藍(lán)黑色菌落HE需氧24h鼠傷寒沙菌（14028）生長，藍(lán)至藍(lán)綠色菌落，有黑心福氏志賀氏菌（12022）生長，綠至藍(lán)綠色菌落大腸埃希氏菌（25922）抑制（部分至完全，黃色菌落）Ø 用凍存的質(zhì)控菌種最多向下傳三代，就應(yīng)更換質(zhì)控菌種。過多的傳代會增加表型改變的機(jī)會。Ø 制備工作質(zhì)控菌種，用凍存的質(zhì)控菌種接種一個瓊脂斜面或平板，卵育過夜或得到足夠的量為止。這些工作瓊脂斜面或平板上的培養(yǎng)物應(yīng)貯存于28，或者室溫，可放4個星期。菌種再傳代后應(yīng)檢查純度和典型的菌落形態(tài)。Ø 厭氧菌的工作質(zhì)控菌株應(yīng)在庖肉培養(yǎng)基或其它適宜的厭氧肉湯培養(yǎng)基中保存，或冷凍保存菌種，不應(yīng)使

10、用瓊脂斜面或平板。三、細(xì)菌染色的質(zhì)量控制 染色是細(xì)菌學(xué)檢查最常使用的方法，根據(jù)染色部位及染色目的不同可分為革蘭染色、抗酸染色、鞭毛染色、異染顆粒染色和莢膜染色等。其中革蘭染色和抗酸染色使用頻率最高?，F(xiàn)對這兩種染色方法加以說明。1革蘭染色 1)嚴(yán)格按照標(biāo)本收集程序取樣并涂片 2)對涂片進(jìn)行嚴(yán)格編號或標(biāo)識 3)在固定涂片時，避免玻片加熱過度 4)染液放置處避免高溫、干燥及灰塵 5)利用過濾的方法去除結(jié)晶紫的固體結(jié)晶 6)如果盧戈氏碘染液褪色，應(yīng)立即更新 7)利用標(biāo)準(zhǔn)菌株(金黃色葡萄球菌ATCC25923及大腸埃希菌ATCC25922)或其他已知的革蘭陽性菌及革蘭陰性菌至少每周進(jìn)行一次質(zhì)量驗(yàn)證 2妻

11、一尼染色 1)嚴(yán)格按照標(biāo)本收集程序取樣并涂片 2)對涂片進(jìn)行嚴(yán)格編號或標(biāo)識 3)每次使用新玻片，不可重復(fù)使用 4)在固定涂片時，避免玻片加熱過度 5)利用過濾的方法去除石炭酸復(fù)紅染液中的沉淀 6)利用已知的抗酸桿菌(AFB)陽性涂片每周或在更新炭酸復(fù)紅染液時至少進(jìn)行一次質(zhì)量驗(yàn)證 7)陽性涂片應(yīng)置于專門器具專門地點(diǎn)保存以備復(fù)驗(yàn) 8)陰性涂片至少保存兩周以備復(fù)驗(yàn) 四、細(xì)菌鑒定或鑒別常用試驗(yàn)的質(zhì)量控制 細(xì)菌鑒定或鑒別主要依據(jù)細(xì)菌的形念特點(diǎn)、染色特點(diǎn)、培養(yǎng)特征、生化反應(yīng)及血清學(xué)特征等。細(xì)菌這些生物表型特征或按固定組合的方式被用于細(xì)菌鑒定，或以靈活組合的方式用于細(xì)菌鑒定、鑒別及補(bǔ)充試驗(yàn)。無論怎樣，這些生

12、物表型檢測的準(zhǔn)確與否直接影響細(xì)菌鑒定的準(zhǔn)確性。下面將列舉一些常用且較為關(guān)鍵的試驗(yàn)，并對其質(zhì)量控制方法加以說明，見表2。表2 常用細(xì)菌鑒定或鑒別試驗(yàn)的質(zhì)量控制 試驗(yàn)名稱 質(zhì)控周期 陽性質(zhì)控 陰性質(zhì)控 質(zhì)控菌 結(jié)果 質(zhì)控菌 結(jié)果 觸酶試驗(yàn) 每次使用時 金黃色葡萄球菌 有氣泡產(chǎn)生 化膿性鏈球菌 無變化 凝固酶試驗(yàn) 每次使用時 金黃色葡萄球菌 與人、兔或豬血 表皮葡萄球菌 無凝固現(xiàn)象 漿產(chǎn)生凝固現(xiàn)象 氧化酶試驗(yàn) 每次使用時 銅綠假單胞菌 根據(jù)方法學(xué)不同可 大腸埃希菌 無顏色改變 產(chǎn)生粉紅色或紫色 奧普托欣敏感性試驗(yàn) 每周 肺炎鏈球菌 紙片周圍出現(xiàn)抑菌圈 化膿性鏈球菌 紙片周圍細(xì)菌均一生長 桿菌肽敏感性試驗(yàn) 每周 化膿性鏈球菌 紙片周圍出現(xiàn)抑菌圈 無乳鏈球菌 紙片周圍細(xì)菌均一生長 CAMP試驗(yàn) 與被測試菌株同 無乳鏈球菌 質(zhì)控菌生長條帶在靠 化膿性鏈球菌 無溶血程度加重區(qū)出現(xiàn) 步進(jìn)行 金黃色葡萄球菌區(qū) 內(nèi)出現(xiàn)溶血加強(qiáng) 膽汁溶菌試驗(yàn) 每批號(在允許的儲存 肺炎鏈球菌 菌落溶解 緩癥鏈球菌 無菌落溶解現(xiàn)象 條件和使用期限內(nèi)) 膽汁七葉苷試驗(yàn) 每批號(在允許的儲 糞腸球菌 使瓊脂斜面變黑 牛鏈球菌 瓊脂斜面無黑色出現(xiàn) 存條件和使用期限內(nèi)) 馬尿酸