生化實驗六酶的基本性質(zhì)

1、專業(yè)： _生物工程姓名： _陳傳鑫實驗報告學(xué)號： _63日期： _地點(diǎn)： _生物實驗樓 306課程名稱：生物化學(xué)實驗指導(dǎo)老師：史影成績：實驗名稱：酶的基本性質(zhì)實驗底物專一性、激活劑和抑制劑、最適溫度同組學(xué)生姓名：陳莞爾，潘盛警 .酶的基本性質(zhì)底物專一性一、實驗?zāi)康?.了解酶的專一性。2.掌握驗證酶的專一性的基本原理及方法。3.學(xué)會排除干擾因素，設(shè)計酶學(xué)實驗。二、基本原理酶是具有高度專一性的有催化功能的蛋白質(zhì)。酶蛋白結(jié)構(gòu)決定了酶的功能酶的高效性，酶促反應(yīng)要比無機(jī)催化反應(yīng)快數(shù)十倍。酶催化的一個重要特點(diǎn)是具有高度的底物專一性，即一種酶只能對一種或一類底物其催化作用，對其他底物無催化反應(yīng)。根據(jù)各種酶對

2、底物的選擇程度不同，可分成下列幾種：1.相對專一性。一種酶能催化一類具有相同化學(xué)鍵或基團(tuán)的物質(zhì)進(jìn)行某種類型的反應(yīng)。2.絕對專一性：有些酶對底物的要求非常嚴(yán)格只作用于一種底物，而不作用于任何其他物質(zhì)。如脲酶只能催化尿素進(jìn)行水解而生成二氧化碳和氨。如麥芽糖酶只作用于麥芽糖而不作用其它雙糖，淀粉酶只作用于淀粉，而不作用于纖維素。3.立體異構(gòu)專一性：有些酶只有作用于底物的立體異構(gòu)物中的一種，而對另一種則全無作用。如酵母中的糖酶類只作用于D-型糖而不能作用于L- 型的糖。本實驗以唾液淀粉酶和蔗糖酶對淀粉和蔗糖水解反應(yīng)的催化作用來觀察酶的專一性。用Benedict 試劑檢測反應(yīng)產(chǎn)物。Benedict 試劑

3、是堿性硫酸銅溶液，具有一定的氧化能力，能與還原性的半縮醛羥基發(fā)生氧化還原反應(yīng)，生成磚紅色氧化銅沉淀。Na2CO3+ 2H 2O2NaOH + H 2 CO3CuSO4+ 2NaOHCu(OH) 2+ Na2SO41Cu2 O 沉淀。還原糖 ( CHO or C=O)+ 2Cu(OH) 2Cu2O + 2H 2O + 糖的氧化產(chǎn)物（黃色或磚紅色）淀粉和蔗糖無半縮醛基，無還原性，與Benedict 試劑無顯色反應(yīng)。淀粉被淀粉酶水解后產(chǎn)生葡萄糖， 蔗糖被蔗糖酶水解后產(chǎn)生果糖和葡萄糖，產(chǎn)物都是還原糖， 因此能被Benedict試劑氧化生成磚紅色的三、實驗材料與試劑1、實驗材料 蔗糖酶 (樣品）； 新鮮

4、唾液（含唾液淀粉酶）；2、實驗試劑 蔗糖酶液蔗糖酶液 (樣品）加蒸餾水適當(dāng)稀釋，備用； 唾液淀粉酶液（學(xué)生自制）取 0.5mL 唾液至 25ml 量筒中，用蒸餾水（稀釋）到25ml，用棉花過濾備用。唾液稀倍數(shù)因人而異，可稀釋50 400 倍，甚至更高； 5%蔗糖（ A.R. ）溶液； 0.5%淀粉溶液（含 0.3%NaCl ）； Benedict 試劑 ；四、實驗器材與儀器1.漏斗，2.脫脂棉花；3.恒溫水浴（ 37， 100）； 4.量筒； 5.試管； 6.燒杯； 7.吸量管。五、實驗內(nèi)容酶的專一性實驗，按下表操作。檢查試劑淀粉酶的專一性蔗糖酶的專一性編號0.5%淀粉（0.3%NaCl ）3

5、33溶液 (ml)5%蔗糖溶液333(ml)蒸餾水333(ml)2唾液淀粉酶液(ml)111蔗糖酶溶液111(ml)搖勻，置 37水浴保溫 10minBenedict 試劑222222222(ml)搖勻，置沸水浴煮2 3min記錄觀察結(jié)果藍(lán)色藍(lán)色藍(lán)色磚紅色藍(lán)色藍(lán)色藍(lán)色黃綠色藍(lán)色六、結(jié)果分析和討論結(jié)果：、號試管均呈硫酸銅的藍(lán)色，說明這3 支試管內(nèi)無還原糖，淀粉和蔗糖均未水解； 號試管呈磚紅色說明試管內(nèi)淀粉被水解，號試管呈藍(lán)色說明試管內(nèi)蔗糖未水解，號試管呈藍(lán)色說明無還原糖，從這三支試管看出唾液淀粉酶只對淀粉有催化活性，不能催化蔗糖水解，具有對淀粉的底物專一性； 號試管呈黃綠色，說明試管中部分蔗糖被

6、水解，但未水解完全，號試管呈藍(lán)色說明淀粉未水解， 號試管呈藍(lán)色說明無還原糖，從這三支試管看出蔗糖酶只對蔗糖的水解有催化作用，對淀粉無催化作用，具有對蔗糖的底物專一性。七、思考題1觀察酶專一性實驗為什么要設(shè)計這3 組實驗？每組各有何意義？蒸餾水有何用？答：第一組作為整個實驗的空白對照組，檢測Benedict 試劑對實驗結(jié)果的顏色有何影響。第二組作為檢測淀粉酶的專一性實驗組，第三組作為檢測蔗糖酶的專一性的實驗組。蒸餾水作為每一個組中的空白對照，與組內(nèi)其余兩組進(jìn)行對照。2將酶液煮沸10min 后，重做二、三的操作，觀察有何結(jié)果？答：二、三組的實驗結(jié)果將和一組相同，即每組中 3 支試管都呈藍(lán)色，因為酶

7、在煮沸過程中已經(jīng)變性，失去催化活性，故不能催化各自對應(yīng)底物的水解反應(yīng)。3在此實驗中，為什么要用0.5%淀粉 (0.3%NaCl) 溶液？ 0.3%NaCl 的作用是什么？答：0.3%NaCl 中的 Cl -是作為激活劑激活唾液淀粉酶的活性，使實驗結(jié)果不至于因為唾液淀粉酶的活性不足而導(dǎo)致不同。. 影響酶活性的因素激活劑和抑制劑3一、實驗?zāi)康暮鸵?. 了解激活劑和抑制劑對酶促反應(yīng)速度的影響。2. 學(xué)習(xí)檢定激活劑和抑制劑影響酶促反應(yīng)速度的原理和方法。二、實驗基本原理在酶促反應(yīng)過程中， 酶的活性常收到某些物質(zhì)的影響， 有些物質(zhì)能使酶的活性增加， 稱為激活劑； 某些物質(zhì)它們并不引起酶蛋白變性，但能使酶

8、分子上的某些必需基團(tuán)（主要是指酶活性中心上的一些基團(tuán)）發(fā)生變化，因而引起酶活力下降，甚至喪失，致使酶反應(yīng)速度降低，稱為酶的抑制劑。酶的激活劑種類：1、一些簡單的無機(jī)離子，如Mg2+ 、Cl- 等；2、一些中等大小的有機(jī)分子，如抗壞血酸等也是激活劑，它們對某些含巰基的酶具有激活作用；3、有些酶的催化作用易受某些抑制劑的影響，因而能除去抑制劑的物質(zhì)也可稱為激活劑，如 EDTA 能除去重金屬，因而能解除重金屬對酶的抑制作用。4、具有蛋白質(zhì)性質(zhì)的大分子物質(zhì)，這些激活劑是指可對某些無活性的酶原起作用的酶。酶的抑制劑有許多種：如重金屬離子（ Ag+ 、Hg2+ 、Pb2、 Cu2等）、CO、氯化物、 H2

9、S、砷化物、氟化物、生物堿、有機(jī)磷農(nóng)藥等都是抑制劑。少量的激活劑或抑制劑就能影響酶的活性，而且常具有特異性。值得注意的是激活劑和抑制劑不是絕對的，各種激活劑對酶的作用是不同的。本實驗利用淀粉被水解的不同階段產(chǎn)物與碘有不同顏色反應(yīng)，定性觀察唾液淀粉酶在酶促反應(yīng)中激活或抑制現(xiàn)象。 淀粉經(jīng)酶促水解為葡萄糖的不同階段的產(chǎn)物與碘作用的顏色反應(yīng)如下：淀粉紫色糊精紅色糊精無色糊精麥芽糖葡萄糖I2顯藍(lán)色顯紫色顯紅色不顯色不顯色不顯色（ 碘色）（碘色）（碘色）仍為多糖（有還原性）（無還原性）4本實驗中， Cl - 為唾液淀粉酶的激活劑； Cu2+為唾液淀粉酶的抑制劑。利用淀粉酶別水解不同階段產(chǎn)物與碘有不同的呈色

10、反應(yīng)，觀察唾液淀粉酶的酶促反應(yīng)中的激活和抑制現(xiàn)象。水解程度通過水解混合物遇碘溶液所呈現(xiàn)的顏色變化判斷。三、實驗材料與試劑1、實驗材料新鮮唾液2、實驗試劑 唾液淀粉酶（學(xué)生自制）取唾液 1ml 至 25ml 量筒中，用蒸餾水稀釋至 25ml，用棉花過濾備用。唾液稀釋倍數(shù)因人而異，可稀釋 50 400 倍，甚至更高。 0.1% 淀粉溶液 1.0% 氯化鈉溶液 1.0% 硫酸銅溶液 1.0% 硫酸鈉溶液 碘化鉀 -碘液四、實驗器材和儀器1.試管及試管架2.量筒五、實驗步驟試劑處理0.1% 淀粉溶液1% 硫酸銅溶液1% 氯化鈉溶液1% 硫酸鈉溶液蒸餾水唾液淀粉酶碘化鉀 -碘液（滴）記錄觀察結(jié)果3.漏斗

11、4.脫脂棉花5.點(diǎn)滴板試管編號1(ml)3(ml)1(ml)(ml)(ml)(ml)1混勻， 37恒溫水浴，保溫1深藍(lán)偏黑6.吸量管7.恒溫水?。?37）23433311111110min111紅棕色深藍(lán)色深藍(lán)色5注意：找出準(zhǔn)確的保溫時間，是本實驗是實驗?zāi)芊癯晒Φ年P(guān)鍵步驟之一，唾液淀粉酶液濃度可根據(jù)個人情況而定，通過37水浴溶保溫計時，反應(yīng)時間最好在8 15min 以內(nèi)，只有確定準(zhǔn)確的保溫時間才能進(jìn)行實驗。（ 2） 加入酶液后，務(wù)必充分搖勻，保證酶與全部淀粉液接觸的反應(yīng)才能得到理想的顏色梯度變化結(jié)果。（ 3）碘化鉀碘液不要過早地加到點(diǎn)滴板上，以免碘液揮發(fā)，影響顯色效果。六、結(jié)果討論與分析結(jié)果：

12、反應(yīng)時間在17min 中時能明顯區(qū)分各管顏色不同。試管 1 中顏色最深，說明CuSO4 可以抑制淀粉酶的活性；試管2 中顏色最淺，基本呈碘色，故淀粉酶活性最高，說明NaCl 可以激活淀粉酶的活性；試管3、4 中顏色基本一致，且深淺居于試管 1、2 之間，淀粉酶活性一般，說明 Na+、 SO42-對淀粉酶活性都沒有影響。故總體上看，可以得出 Cl -是唾液淀粉酶的激活劑， Cu 2+是唾液淀粉酶的抑制劑。同時， 因為各管的結(jié)果顏色都偏深，所以使用的唾液淀粉酶樣品活性不高，這與區(qū)分各管顏色差別需要反應(yīng)時間較長（17min ）相符合。七、思考題1. 激活劑可分哪幾類？本實驗中NaCl 、硫酸銅是屬于

13、哪種類型？答：激活劑可分為：簡單無機(jī)離子、中等大小有機(jī)分子、能出去抑制劑的物質(zhì)、具有蛋白質(zhì)性質(zhì)的大分子物質(zhì)等。 NaCl 屬于簡單無機(jī)離子； CuSO4 屬于重金屬抑制劑。2. 本實驗中， 1， 2， 3， 4 管各有何用意？為什么要設(shè)計第3 管和第 4 管？答： 1 管可觀察抑制劑對反應(yīng)影響的現(xiàn)象，2 管可觀察激活劑對反應(yīng)影響的現(xiàn)象，第3 管可以將 1 管中的 Na+ 和 2 管中的 SO42- 對反應(yīng)的影響去除，4 管作為空白對照。3. 抑制劑與變性劑有何不同？試舉例說明。答：抑制劑只改變酶的催化活性，并不使蛋白質(zhì)變性，其影響是可逆的；變性劑破壞了蛋白質(zhì)的高級結(jié)構(gòu)，使蛋白質(zhì)變性，并且多數(shù)變

14、性劑的影響是不可逆的。如：Cu2+是唾液淀粉酶的抑制劑，但如果將Cu2+去除淀粉酶的活性又可以變?yōu)檎Ｋ健?. 影響酶活性的因素 溫度，最適溫度測定一、實驗?zāi)康暮鸵?1. 了解溫度對酶活力的影響；2. 學(xué)習(xí)測定最適溫度的原理和方法；二、實驗基本原理酶的催化反應(yīng)受溫度影響很大， 每一種酶所催化的反應(yīng)， 在一定條件下， 僅在某一溫度范圍內(nèi)表現(xiàn)出最大的活力， 即反應(yīng)速度最大時的溫度， 這個溫度稱為該酶促反應(yīng)的最適溫度，高于或低于最適溫度時， 反應(yīng)速度逐漸下降。 因此，酶促反應(yīng)與溫度的關(guān)系，用酶活力對溫度作圖，通常具有鐘罩形曲線特征。溫度與酶活力的關(guān)系測定是選擇一定的條件，把底物濃度、酶濃度、反應(yīng)

15、時間、 pH 等固定在最適狀態(tài)下， 然后在一系列不同溫度條件下， 進(jìn)行反應(yīng)初速度測定， 以酶反應(yīng)初速度對溫度作圖， 可以得一個鐘罩形的曲線， 即為溫度酶活性曲線， 在某溫度有一酶活力最大值，這個溫度即為最適溫度。實驗利用唾液淀粉酶為試驗對象，在0 65之間選擇不同的溫度，進(jìn)行酶活力測定。根據(jù)淀粉被唾液淀粉酶水解的程度的不同， 遇碘呈現(xiàn)顏色的變化來判斷酶活力的大小及最適溫度。實驗采用蔗糖酶為試驗對象，在室溫至75之間選擇不同溫度進(jìn)行酶活力測定。蔗糖酶的活力常以其反應(yīng)產(chǎn)物還原糖（葡萄糖）的生成量來表示。測定還原糖的方法很多，本實驗選擇 3,5二硝基水揚(yáng)酸法測定還原糖量。在堿性條件下， 3,5二硝水

16、楊酸與還原糖溶液共熱后被還原成紅色氨基化合物， 并在一定濃度范圍內(nèi)， 還原糖的量與反應(yīng)溶液所呈棕紅色物質(zhì)顏色的深淺程度成正比。因此，可以用分光光度法測定酶促反應(yīng)后生成的還原糖量，從而測定蔗糖水解的速度和酶活力。三、實驗材料與試劑1、實驗材料蔗糖酶液 (樣品）加蒸餾水適當(dāng)稀釋，備用；新鮮唾液。2、實驗試劑0.2mol/L 醋酸緩沖液（pH4.6 ）5%蔗糖（ A.R. ）溶液（ W/V ）3,5二硝基水揚(yáng)酸（簡稱DNS ）試劑0.5%淀粉溶液（含0.3%NaCl ）IK-I2 溶液7四、實驗器材與儀器1.試管及試管架，2恒溫水浴，3吸量管 ,4滴管 ,5點(diǎn)滴板， 6分光光度計，7制冰機(jī)。五、實驗

17、步驟溫度對唾液淀粉酶活力的影響按下表操作管號12345試劑0.5%淀粉液（ 0.3%NaCl ）(ml)22222溫度（）冰浴約 0室溫375065各保溫 5min唾液淀粉酶（ ml）11111將試管內(nèi)溶液混勻后，置各相應(yīng)溫度，保溫10minIK-I2液（滴）11111記錄顏色變化藍(lán)色藍(lán)色紅棕色橙紅色藍(lán)色淺顏色深淺深0375070溫度（）溫度 -酶活力曲線圖溫度對蔗糖酶活力的影響編號012345條件反應(yīng)溫度（）室 溫室 溫375065750.2mol/L 醋酸緩沖液（ pH4.6 ）(ml)11111185%蔗糖溶液(ml)0.50.50.50.50.50.5預(yù)熱 3min稀釋酶液 ( 樣品）

18、(ml)H2O0.50.50.50.50.5(作相應(yīng)的預(yù)溫）0.5保溫反應(yīng) 10 min3,5二硝基水楊酸（ ml）111111混勻后， 100加熱 5min蒸餾水（ml）555555A 52000.3411.1651.3200.6680.075六、結(jié)果分析討論溫度對唾液淀粉酶活力的影響從溫度對唾液淀粉酶的活力曲線可以看出，當(dāng)溫度為50時顏色最淺，即淀粉水解最完全，唾液淀粉酶的活性最高；在50兩邊唾液淀粉酶的活性都隨著溫度的改變而降低，故本組實驗的唾液淀粉酶的最適溫度在50左右。唾液淀粉酶的活性并不是在正常的人體體溫37時最適，根據(jù)激活劑和抑制劑探索中的結(jié)果顏色普遍偏深，主要原因認(rèn)為是本組的唾液淀粉酶樣品活性不高，故樣品的最適溫度較正常情況有所提高，不是37而是本次實驗測得的50。溫度對蔗糖酶活力的影響由試劑在520nm 波長的吸光度對溫度作圖得到如上圖的A 520-T 曲線。由圖線看出蔗糖酶在 50時活性最高，故蔗糖酶的最適溫度為50。同時由曲線看出溫度高于70后酶活性顯著下降， 這是因為此時酶已經(jīng)因為高溫發(fā)生了變性，失去了大部分的催化活性，故催化能力大大減弱。9七、思考