SDSAGE蛋白電泳方法

1、SDS-PAGE一. 實驗原理SDS 是一種陰離子表面活性劑，在蛋白質(zhì)溶液里加入 SDS 和巰基乙醇后，巰基乙醇能使蛋白 質(zhì)分子中的二硫鍵還原， SDS 能使蛋白質(zhì)的氫鍵、疏水鍵打開并結(jié)合到蛋白質(zhì)分子上，形成蛋白 質(zhì)-SDS 復合物。在一定條件下，SDS 與大多數(shù)蛋白質(zhì)的結(jié)合比例為 1.4:1。由于十二烷基磺酸根 帶負電，使各種蛋白質(zhì)的 SDS-復合物都帶上相同密度的負電荷，它的量大大超過了蛋白質(zhì)原有的 電荷量，因而掩蓋了不同種類蛋白質(zhì)間原有的電荷差別。SDS 與蛋白質(zhì)結(jié)合后，還引起了蛋白質(zhì)構(gòu)象的改變。蛋白質(zhì)-SDS 復合物的流體力學和光學性質(zhì)表明，它們在水溶液中的形狀，近似于雪 茄煙形的長橢

2、圓棒，不同蛋白質(zhì)的 SDS 復合物的短軸長度都一樣，約為 1.8nm ，而長軸則隨蛋白 質(zhì)的 Mr 成正比的變化?；谏鲜鲈?，蛋白質(zhì) -SDS 復合物在凝膠電泳中的遷移率，不再受蛋白 質(zhì)原有電荷和形狀的影響，而只與橢圓棒的長度有關， 也就是蛋白質(zhì) Mr 的函數(shù)。二. 試劑器材30%凝膠貯液(100mL):稱取試劑Acr 29.2g和Bis 0.8g置于100mL燒杯中， 向燒杯中加入約60mL雙蒸 水，充分攪拌溶解后加雙蒸水定容至 100mL，置于棕色瓶內(nèi) 4C貯存，每過 1-2 個月應重新配制；注意:丙稀酰胺具有很強的神經(jīng)毒性，并可通過皮膚吸收， 其作用有積累性，配制時應戴手套和口罩等。分

3、離膠緩沖液(1.5 mol/L Tris-HCI，pH 8.8，100mL):稱取 Tris 18.2g 溶于約 80mL 雙蒸水，用 6mol/L 的HCI 調(diào)整 pH 值至 8.8,加雙蒸水定容到 100mL，4C貯存；堆積膠緩沖液(0.5 M Tris-HCl，pH 6.8，100mL):稱取 Tris 6.00 容于約 80mL 雙蒸水，用 1mol/L 的HCl 調(diào)整 pH 值至 6.8,加雙蒸水定容到 100mL，4C貯存；電泳緩沖液(1L):稱取試劑 Tris 3.03g 和甘氨酸 14.40 置于 500mL 燒杯中， 向燒杯中加入約 400mL 雙蒸 水充分溶解，再加入 10

4、%SDS 溶液 1.0mL，以雙蒸水定容至 1L 伯然 pH 值為 8.3,無需再調(diào))，4C貯 存，可重復使用 5-6 次；2 勸卩樣緩沖液(10mL):取下列試劑置于 10mL 塑料離心管中0.5mol/L Tris-HCl 緩沖液(pH6.8)2.0mL10%SDS 溶 液4.0mL甘油2.0mL巰基乙醇2.0mL分離膠緩沖液（mL）10.0溴酚藍0.02g混勻后 1mL 分裝，-70C可貯存 6 個月；10%AP:稱取（NH4）2SO31.0 g,溶于 10.0mL 雙蒸水中，分裝成每份 1mL, -20C貯存；TEMED :分裝成每份 1mL，4C避光貯存；水飽和正丁醇 （100mL）

5、:在玻璃瓶中加入 50mL 雙蒸水和 50mL 正丁醇， 振搖。 上層相即水飽和正丁 醇，室溫下可長期保存。染色液（100mL）:稱取考馬斯亮藍 R-250 0.25g 加入雙蒸水 40.0mL、甲醇 50.0mL 和乙酸 10.0mL,攪拌溶解后濾紙過濾除去不溶顆粒；脫色液（1L）:分別取甲醇 50mL 和乙酸 75mL，加雙蒸水 875mL 稀釋。其他器材：容量瓶（1L、100ml、10ml）、燒杯、離心管（15ml、1.5ml）、移液器、移液器吸頭、干燥器、渦旋振蕩器和廢液缸等。分離膠配方（100mL，4 塊膠）貯液分離膠中丙烯酰胺的終濃度(%)8.09.010.011.012.013.

6、014.015.016.017.018.0凝膠貯液（mL）26.6730.0033.3336.6740.0043.3346.6750.0053.3356.6760.00分離膠緩沖液（mL）25雙蒸水（mL）46.5343.2039.8736.5333.2029.8726.5323.2019.8716.5313.2010%SDS (mL)1.010%AP (mL)0.75TEMED (mL)0.05 （抽氣后添加）堆積膠配方（40mL，4 塊膠）堆積膠中丙烯酰胺的終濃度（）貯液3.04.05.0凝膠貯液(mL)4.005.366.66將凝膠浸泡在染色液中，置于搖床上染色4hr，染色液可回收重復利

7、用雙蒸水(mL)25.3624.0022.7010%SDS(mL)0.410%AP(mL)0.2TEMED(mL)0.04 (抽氣后添加)三操作步驟樣品處理：在密封的螺蓋微量離心管中， 用 2X加樣緩沖液按 1:1 稀釋蛋白質(zhì)樣品溶液， 于 100C煮沸 3- 5min，分子質(zhì)量標準品也經(jīng)上述處理。凝膠制備：將玻璃板用蒸餾水清洗干凈，再用 75%的酒精去脂，干燥后固定在灌膠支架上；配制 12%的分離膠，加入 TEMED 前抽真空 10min 以除去丙烯酰胺溶液中的空氣；加入TEMED 后輕輕振蕩混勻，迅速注入安裝好的玻璃板的間隙中，給堆積膠留出約1cm 的空間。在丙烯酰胺溶液上覆蓋一層水飽和的

8、正丁醇，以防止空氣擴散到凝膠中抑制聚合作用，并保證凝膠 表面水平；在室溫條件下，凝膠應在 30min-50min 內(nèi)聚合完成。凝膠聚合后凝膠和上層液相之間 可見折射率的變化；倒掉覆蓋層并用蒸餾水清洗凝膠頂部數(shù)次，并用濾紙條吸凈殘留的蒸餾水，注意勿破壞凝膠 表面；制備堆積膠并迅速注入分離膠上，立即插入干凈的梳子，不要混入氣泡，以一定的角度將 梳子插入堆積膠能減少氣泡的產(chǎn)生。堆積膠聚合后小心移去梳子，避免破壞加樣孔，用蒸餾水小 心清洗加樣孔，以除去未聚合的丙烯酰胺。加樣：將凝膠固定在電泳裝置上，電泳上槽內(nèi)加入電泳緩沖液沒過加樣孔，并檢查有無滲漏。傾斜整個裝置以趕走凝膠下面可能留有的氣泡；按預定順序

9、加樣，每孔加入20 L,在對照孔中加入分子質(zhì)量標準品 6-7 L，如有空置的加樣孔，加入等體積的 1X加樣緩沖液。電泳：將電泳裝置與電源相連，正極接下槽、負極接上槽進行電泳，樣品在堆積膠階段電壓為80V，而在分離膠階段電壓調(diào)整為 120V。直到溴酚藍到達分離膠的底部后，關閉電源，斷開電 極。從電泳裝置上卸下玻璃板，用小鏟子剝下凝膠后切除一角以標注凝膠方位。染色：脫色：染色結(jié)束后，將凝膠浸泡在脫色液中，置于搖床上脫色過夜，其間更換脫色液3 次.記錄：將顯示蛋白條帶的凝膠用凝膠成像儀拍照，記錄試驗結(jié)果，并根據(jù)分子質(zhì)量標準品計算目標 蛋白的分子量。四.注意事項：SDS 與蛋白質(zhì)的結(jié)合按質(zhì)量成比例，蛋白質(zhì)含量不可以超標，否則SDS 結(jié)合量不足。用 SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳法測定蛋白質(zhì)相對分子量時，必須同時作標準曲線，并且SDS-PAGE 測定分子量有 10%誤差。有些蛋白質(zhì)由亞基（如血紅蛋白）或兩條以上肽鏈（a-胰凝乳蛋白酶）組成的，它們在巰基乙醇和SDS 的作用下解離成亞基或多條單肽鏈。因此，對于這一類蛋白質(zhì)， SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳法 測定的只是它們的