RACE原理及應(yīng)用

1、精品文檔1歡。迎下載RACE 勺簡介目前, 全長基因勺獲得是生物工程及分子生物學(xué)研究勺一個重點。盡管已經(jīng) 有多種方法可以獲得基因勺全長序列， 但在很多生物研究中， 由于所研究勺目勺 基因豐度較低，從而使得由低豐度 mRNA!過轉(zhuǎn)錄獲得全長 cDNA 艮困難。近年來 發(fā)展成熟的cDNA 末端快速擴增(RACE 技術(shù)為從低豐度轉(zhuǎn)錄快速獲得全長 cDNA 提供了一個便捷勺途徑。cDNA 末端快速擴增(rapid amplification of cDNA ends,RACE)技術(shù)是一種基于 mRNAe 轉(zhuǎn)錄和 PCR 技術(shù)建立起來的、以部分的已知區(qū)域序列為起點,擴 增基因轉(zhuǎn)錄本的未知區(qū)域,從而獲得

2、mRNA(cDN 完整序列的方法。簡單的說就是 一種從低豐度轉(zhuǎn)錄本中快速增長 CDNA5 和 CDNA3 末端，進而獲得獲得全長 cDNA 簡單而有效的方法，該方法具有快捷、方便、高效等優(yōu)點,可同時獲得多個轉(zhuǎn)錄本。因此近年來 RACES 術(shù)已逐漸取代了經(jīng)典的 cDNA 文庫篩選技術(shù),成為克 隆全長 cDNA 序列的常用手段。第二 RACE 的原理RACE 是采用 PCR 技術(shù)由已知的部分 cDNA 順序來擴增出完整 cDNA5 和 3 末端,是一種簡便而有效的方法,又被稱為錨定 PCR (anchoredPCR)和單邊PCR(one2side PCR)。3 RACE 勺原理一) 加入 olig

3、o(dT)17 和反轉(zhuǎn)錄酶對 mRNAS 行反轉(zhuǎn)錄得到(-)cDNA;二) 以 oligo(dT)l7 和一個 35bp 的接頭(dT17-adaptor)為引物，其中在引物 的接頭中有一在基因組 DNA 中罕見的限制酶的酶切位點。這樣就在未知 cDNA 末 端接上了一段特殊的接頭序列。再用一個基因特異性引物 (3 amp)與少量第一鏈 (-)cDNA 退火并延伸，產(chǎn)生互補的第二鏈 (+)cDNA。三) 利用 3amp 和接頭引物進行 PCR 循環(huán)即可擴增得到 cDNA 雙鏈。 擴增的特 異性取決于3amp的堿基只與目的cDNA分子互補而用接頭引物來取代 dT17一 adaptor則可阻止長

4、(dT) 堿基引起的錯配。精品文檔2歡迎下載5 RACE 勺原理5 RACEf 3 RACE 略有不同。首先，引物多設(shè)計了一個用于逆轉(zhuǎn)錄的基 因特異引物 GSP-RT 其次，在酶促反應(yīng)中增加了逆轉(zhuǎn)錄和加尾步驟，即先用 GSP-R 逆轉(zhuǎn)錄mRNA 獲得第一鏈(-)cDNA 后，用脫氧核糖核酸末端轉(zhuǎn)移酶和 dATP 在 cDNA5 端加poly(A)尾，再用錨定引物合成第二鏈(+)cDNA,接下來與 3 RACES 程相同。用接頭引物和位于延伸引物上游的基因特異性引物(5amp)進行PCRT增。ffi 1于RACE的原理圖3 AACE-PCRmlvmal箱ri9f prtmvrAA AAAO4nA

5、tur; annualarhor primxTTTTTPQH wrlhOimJ rtniGinior pfirmrs精品文檔3歡迎下載全長 cDNA 的獲得通過 RACE 方法獲得的雙鏈 cDNA 可用限制性內(nèi)切酶酶切和 southem 印跡分 析并克隆。 通常的克隆方法是同時使用一個切點位于接頭序列上的限制性內(nèi)切酶 和一個切點位于擴增區(qū)域內(nèi)的內(nèi)切酶。由于大多數(shù)非特異性擴增的cDNA 產(chǎn)物不能被后一個限制性內(nèi)切酶酶切，因而也就不會被克隆.從而增加了克隆的選擇效 率。還可以用在基因特異性引物的 5 端摻人一個限制性內(nèi)切酶的酶切位點的方 法來克隆。最后， 從兩個有相互重疊序列的 3和 5 RACE

6、物中獲得全長 cDNA 或者通過分析 RACE物的 3和 5端序列，合成相應(yīng)引物來擴增 mRNA 勺反轉(zhuǎn) 錄產(chǎn)物，從而獲得全長 cDNA第三 RACE 的應(yīng)用RACE 技術(shù)主要是應(yīng)用于對全長 cDNA 序列的獲得，但對該技術(shù)進行一定的修 改后，也可在其它方面顯示出極高的應(yīng)用價值。首先，RACE 技術(shù)可用于 cDNA 文庫的構(gòu)建及篩選。Belyavaasky 等(1989)用 10個骨髓瘤細胞分離的總 RNA 通過 TdT 加同聚尾、(dT)16 引物反轉(zhuǎn)錄，接著 用(dC)13和錨定引物擴增的方法建立了一個 106 克隆的 cDNA 文庫。同時，用該 方法構(gòu)建文庫的優(yōu)點是它們都只需要很少量的實

7、驗材料。建喜等 (2001) 利用 RACE 技術(shù)從已經(jīng)構(gòu)建*M*H Mrt itmnd pmwMFt VmWAPCfi wW dCUM rDW uwig 1h#AtadgMi Amhcr PFVWMium和flapw*1?prtmarr f*CflprwMrf亍，4* . QwrrFMRHAr*?CCWLf*RTPW0JCPWLM (MAAMAXMn fwi2 fWM DhlA *nCCTPBMTTFAtaWig94尿g prtnwr 4G$WHM A AM.E2TRACE的臣理圖精品文檔4歡迎下載的 cDNA 文庫中成功克隆了家兔精子膜蛋白基因。其次， 應(yīng)用 RACE 克隆已知片段的旁側(cè)內(nèi)

8、部序列(neighboring internal sequenee)0Fritz 等(1991)以及 Struck 等(1994)分別用該法獲得了 3端和 5 端的旁側(cè)序列。Zhang(1996)應(yīng)用 LA-PCR 方法獲得了特異基因的 5末端非編 碼和編碼序列 ,省去了構(gòu)建及篩選基因組文庫的麻煩0王東等(2003) 利用 RT-PCR 和 RACE 技術(shù)從玉米中獲得一個長度為 2469bp F2KP 蛋白基因的 cDNA 克隆。此 外，RACE 技術(shù)還可用于克隆同源基因的同源片斷，為尋找同基因提供了一種方 法0除此之外,Whitcomb 等設(shè)計的隨機引物/錨定 PCR 能對克隆質(zhì)粒載體上的靶

9、 序列進行定點刪除，采用(N)10 錨隨機引物和變性的質(zhì)粒 DNA1行雜交,然后通 過 T7 聚合酶來延伸，這樣單鏈 DNA 就可被一隨機引物和一基因特異性引物擴增，一端可達到缺失刪除,缺失的片段可達 2Kbo Balavoine 應(yīng)用連接介導(dǎo) PCR 從一種 扁蟲中克隆得到 8個分別屬于 Hox,msh,NK-1 和 NK-2 的含同源盒的片段，說明 RACE 可用于克隆同源基因的同源片段，為尋找同源基因提供了一種手段。RACE 技術(shù)與生物信息學(xué),例如 EST 庫相結(jié)合,具有快速,高效克隆新基因的特 點,為快速釣取基因家族候選新成員提供新思路 ,如果一個基因是多基因家族的 一個成員,用基因特

10、異引物(GSP 河能同時擴增幾個高度同源的 Cdna.李紅等利 用一條 cDNA 乍為探針,通過 BLASTNA GenBank 中整合出了 7 條更長的 EST,通過 設(shè)計引物,利用RACST 增,得到了 7 條新基因.相比單純尋找新基因的全長，此種 方法的結(jié)合充分利用了信息巨大的基因資源庫 ,得到了更多的信息 ,獲得新基因 速度更快*效果更高，屬一種頗具規(guī)?；姆椒ǎ苡袘?yīng)用前景?？傊?，隨著 RACES 術(shù)的不斷改進和完善,優(yōu)化 PCRT增的條件以提高擴增的 效率和忠實性， RACE 技術(shù)必將在基因克隆以及基因家族和基因表達變化等研究 中發(fā)揮極大的作用。第四 RACE 的優(yōu)點與局限性RAC

11、 技術(shù)相對于其他方法克隆全長 cDNA 來說具有價廉、簡單和快速等特點。 用RAC 或得 cDNA 克隆只需幾天的時間，而且對豐度很低的起始反應(yīng)物質(zhì)，照樣 能迅速反饋是否有目的產(chǎn)物生成。因此，可根據(jù)不同的 RNA 制備來修訂反轉(zhuǎn)錄條 件，以滿足精品文檔5歡。迎下載全長 cDNA 的獲得。同時，通過 RACES 術(shù)獲得 5端調(diào)控序列和多聚 腺苷化信號序列的信息， 有助于選擇引物以用于轉(zhuǎn)錄模型非常復(fù)雜的基因中擴增 cDNA 的亞群。另外，RACES 術(shù)能產(chǎn)生大量獨立克隆，這些克隆可用來證實核苷 酸序列，并使得被選擇性剪接或開始用于很少使用的啟動子的特殊轉(zhuǎn)錄物的分離 成為可能。RACEJ 術(shù)從理論上

12、來說是很簡單的，但是實際操作中會面臨許多技術(shù)上的 難題。許多研究人員發(fā)現(xiàn)，利用 RACE 來獲得全長基因并非如想像中那般成功,甚至經(jīng)常會發(fā)生錯誤的擴增和克隆結(jié)果 , 多數(shù)情況下 ,5 端的編碼區(qū)經(jīng)常會由 于反轉(zhuǎn)錄過程的不徹底而丟掉 , 特別是由于有大的轉(zhuǎn)錄物或者存在復(fù)雜的二級結(jié) 構(gòu)的時候,而且連接反應(yīng)通常是特異性差效率很低,這樣 PCF 成功進行就不能保 證.尤其在長片段擴增時,PCR 就顯得不那么有效.例如幾個 Kb 片段的產(chǎn)物就需要 優(yōu)化改變擴增條件，而且擴增結(jié)果經(jīng)常出現(xiàn)非特異性擴增條帶 , 使得選擇目的條 帶變得十分困難,而對于豐度較低,長度較長的基因 RACE 方法困難更大,這是困 擾研究人員的一大難題。由于 RAC 礦增中經(jīng)常出現(xiàn)由于引物的不匹配而導(dǎo)致的 非特異性擴增 , 有時需要進行幾輪巢式擴增來達到獲得特異性擴增的目的 , 然而 多輪擴增又容易提高 PCR 反應(yīng)的錯誤發(fā)生率,由于這些原因,利用 RACES 術(shù)通常 不易獲得所希望的結(jié)果。盡管 RAC 戰(zhàn)術(shù)在應(yīng)用中取得了很大的成功但在實際操作過程仍有不少局 限性。一般來說導(dǎo)