大鼠胃促黃體生成素及其受體的免疫組化及原位雜交研究(一)(精)

1、大鼠胃促黃體生成素及其受體的免疫組化及原位雜 交研究（一）【摘要】 目的：探討大鼠胃組織中是否表達促黃體生成素（LH 及其受體 （LHR）,為進一步研究 LH 對胃的功能調節(jié)提供理論依據.方法：采用免疫組織 化學 SABC 和原位雜交的方法進行研究.結果：在大鼠胃底腺的壁細胞和主細 胞呈 LH 和 LHR 免疫反應陽性.陽性物質分布于細胞質和細胞膜上，細胞核呈陰 性反應.上述細胞同樣含有 LH 和LHR mRN 雜交信號，信號物質亦分布于細胞 質內，細胞核呈陰性反應.結論：大鼠胃壁細胞和胃主細胞既能產生 LH,又 能表達 LHR 說明 LH 對胃壁細胞和胃主細胞功能作用可能是通過旁分泌或自分

2、泌的作用來實現的【關鍵詞】黃體生成素免疫組織化學原位雜交胃底腺0 引言LH（luteinizing hormone, LH） 及其受體（luteinizing hormone receptor,LHR）可以在下丘腦-垂體-性腺軸之外表達已經被公認.我們先前的實驗已經證明，大鼠頜下腺的漿液性腺泡上皮細胞能夠表達LH 及其受體1-2，但作為消化系統(tǒng)最重要器官之一的胃組織是否表達LH 及其受體，目前尚未闡明，本實驗采用免疫組織化學和原位雜交等技術對該問題進行了研究1 材料和方法1.1 材料正常雄性 SD 大鼠，體質量（200 土 20） g,購自第四軍醫(yī)大學試驗 動物中心；LH mAb 購自美國 Z

3、YME 公司；LHR 多克隆抗體、SABC 式劑盒與敏感 性加強型原位雜交檢測試劑盒I型為武漢 BOSTE 公司產品；Vector 購自 TaKaRa 公司；地高辛標記隨機引物標記試劑盒購自Roche; Hi ndIH，EcoRI 內切酶購自 New England Biolabs 公司；膠回收試劑盒購自 Promega 公司；DAB 顯色試劑盒購自北京中山試劑公司.1.2 方法1.2.1LH 及其受體的免疫組織化學 SABC 法 SD 大鼠術前晚禁食不禁水，經 腹腔注射戊巴比妥鈉（40 mg/kg ）麻醉，取出胃組織立即放入 Bouins 液中固 定，用石蠟包埋后將組織蠟塊切成 4 mm 的

4、切片，并將切片貼附于 APES 處理過 的載玻片上，烘干備用將切片進行二甲苯脫蠟，先后各 10 min，無水乙醇 5 min，加入 30 g/L 甲醇中 20 min 以去除內源性過氧化物酶，然后按SABC 法進行 LH 及其受體的免疫組織化學染色，第一抗體： LH 抗體（1 : 500 稀釋）和 LHR 抗體（1 : 300 稀釋），在 4C冰箱孵育過夜，第二抗體：LH 和 LHR 分別為生物素標記的羊抗鼠或羊抗兔 IgG （1 : 200 稀釋）， 室溫孵育 2 h. SABC 復合物 （1 :200 稀釋）室溫孵育 30 min. DAB 顯色 1015 min，蒸餾水終止反應，剃度乙醇

5、脫水，透明二甲苯兩次，各 10 min，中性樹膠封片.用正常兔血 清取代第一抗體進行孵育作陰性對照1.2.2LH 及其受體的標記探針根據文獻2產生的克隆制備探針，分別從 LH 及其受體的上切下最初的 DNA 片段，長度分別為 150，650 bp，并進行回收，采用隨即引物標記法進行標記，具體方法按Roche 公司的地高辛標記試劑盒進行：用滅菌去離子蒸餾水稀釋1 卩 g DNA 至總體積 16卩 L;把 DNA 瓦置于沸水中，水浴 10 min.然后，迅速冰浴 3 min 以上，使 DNA 熱變性；加 4 卩 L DIG Random Labeling Mix（ 高效），混勻后再 1000 g

6、離心 5 min，置 37C水浴反應過夜， 時間越長， 產量越高.延長反應時間至 20 h 可明 顯增加地高辛標記 DNA勺產量，并加入 0.2 mmol/L EDTA 2 卩 L 以終止反應， 置-20C保存?zhèn)溆?1.2.3LH 及 LHR mRN 原位雜交程序用上述方法麻醉動物后，取出胃組織立 即放入用 Bouins 液（內含 1g/L DEPC）中固定，整個制片過程均防 RNA 酶污 染，切片厚度為 4 卩 m 將切片進行二甲苯脫蠟，先后各 15 min,剃度乙醇水 化，加入 30 g/L 甲醇中 20 min 以去除內源性過氧化物酶；胃蛋白酶活性 37C消化 30 s，以增加探針的穿透

7、力；4 g/L 多聚甲醛終止反應 5 min，以 終止蛋白酶 K 的作用；每張切片滴加含 2.0 mg/L 地高辛標記探針的原位雜交液 30 卩 l，置濕盒中 42C雜交 20 h ;分別用 37C預熱的 2XSSC 0.1XSSC 洗滌 5 minX3，10 minX2;滴加小鼠抗地高辛抗體 37C，2 h，0.5 mol/L TBS 洗 滌 5 minX3;滴加生物素化羊抗小鼠 IgG 37C1 h，0.5 mol/L TBS 洗滌 5 minX3;滴加 ABC 37C30 min. 最后用 DAB顯色液顯色，室溫 1015 min， 鏡下觀察其顯色情況，水洗終止反應.梯度乙醇脫水，中性樹

8、膠封片.陰性對 照分別用不含探針的雜交緩沖液取代含探針的雜交液，及用正常羊血清取代羊 抗地高辛抗體 IgG 進行孵育.2 結果2.1LH 及 LHR 免疫組織化學結果 LH 及 LHR 免疫反應陽性細胞呈棕黃色，背 底不著色，反差明顯，陽性細胞很易鑒別，兩種陰性對照實驗均呈陰性反應.大鼠胃小凹上皮細胞呈 LH 與 LHR 免疫反應陰性，而在胃底腺壁細胞、主細胞均 呈陽性反應， 陽性物質分布于細胞質， 細胞核呈陰性分布， 但粘液細胞均呈陰 性反應 （圖 1） .2.2LH 及 LHR mRN 原位雜交 LH 及 LHR mRN 雜交信號的細胞也呈棕黃色， 背底不著色，反差明顯，陽性細胞很易辨認，

9、陰性對照試驗呈陰性反應.在大鼠胃 LH 及 LHR mRN 雜交信號分布一致，陽性信號物質主要位于胃底腺壁細 胞、主細胞的細胞質內，細胞核呈陰性，但粘液細胞內的雜交信號均呈陰性反 應（圖 2）.胃壁細胞（T）和主細胞（*）呈 LH 免疫反應陽性，陽性物質分布于細胞 質，細胞核呈陰性分布.圖 1 大鼠胃底腺 LH 免疫組織化學染色 SABCX200 （略）陽性物質位于胃壁細胞(T)和主細胞(*)的細胞質內，胞核呈陰性.圖 2 大鼠底腺 LH mRNA 雜交信號 DABX400 (略)3 討論傳統(tǒng)認為 LH 和絨毛膜促性腺激素(chorionic gonadotropin, CG)分別是由腺垂體嗜

10、堿性細胞、胎盤滋養(yǎng)細胞所分泌的糖蛋白，二者具有相似的立體結 構，并與表皮生長因子(epidermal growth factor, EGF) 、神經生長因子 (nerve growth factor,NGF)等屬于同一個超家族，因此 LH 和 CG 除了傳統(tǒng)的內分泌作用外，它們也具有生長因子的特性近年來的許多研究表明，LH 及其 受體可存在于腦垂體之外，如前列腺3、卵巢4、睪丸5及頜下腺2等組織，這說明 LH 也可能異位合成并通過旁分泌或自分泌效應調節(jié)不同 類型細胞的功能這與本實驗的研究結果是相一致的胃壁細胞是一種多功能的細胞，既能分泌多種生物活性物質，又有多種生 物活性物質的受體的表達6.我

11、們先前的研究已經發(fā)現，胃壁細胞既能表達 GnRr 又能表達GnRH 受體7，并且 GnRH 類似物對胃酸的分泌起一定的抑制 作用.我們近來的研究也發(fā)現8，胃壁細胞的促卵泡激素受體免疫反應呈陽性，并認為 FSH 對大鼠胃底腺壁細胞的功能可能有一定的調節(jié)作用本研究發(fā)現，大鼠胃壁細胞LH 及 LH 受體免疫反應呈陽性，提示該處可能存在的調節(jié)軸，對胃壁細胞功能進行調節(jié)，但是它究竟起哪種功能起調節(jié)作用有待進一步研究加以證 實胃主細胞是胃底腺中數量最多的細胞，其最主要的功能是分泌胃蛋白酶原近年來的研究表明，胃主細胞也是一種功能較多的細胞，如在主細胞上可表達 轉化生長因子(transforming grow

12、th factor, TGF)和 EGF 受體，主細胞可以通過鄰近壁細胞的旁分泌作用產生的 EGF 來調節(jié)壁細胞的9數量，還可以通過 EFG來調節(jié)胃脂肪酶的活性，其作用途徑可能是通過有絲分裂蛋白激酶p42/44來實現的10本研究中發(fā)現，胃主細胞 LH 及 LH 受體均呈免疫反應陽性， 因此推測 LH 可能對主細胞的功能進行調節(jié)，其作用途徑也可能是通過鄰近壁細 胞的旁分泌作用，或是通過自分泌效應來調節(jié)細胞的生長及功能，但有待于進 一步實驗加以證實【參考文獻】1付建芳，黃威權,王世鄂，等大鼠下頜下腺卵泡刺激素、黃體生 成素的分布及與促性腺激素釋放激素受體的共定位研究J解剖學報，2004, 35(6

13、): 652-655.2陳蕾，白宏偉，孫緒德，等.大鼠頜下腺 LH 及其受體的定位、核心 片斷的克隆及序列分析J解剖學報，2007, 38(5): 572-576.3Sibley PE, Harper ME, Joyce BG, et al. The immuno cytochemical detection of protein horm ones in huma n prostatictissues J. Prostate, 1981;2(2):175-185.4Kobayashi M, Nakano R, Ooshima A. Immunohistochemical localizati

14、 on ofpituitary gon adotrophi ns and gon adal steroidsconfirms the two cel 1sXm gonador.rophnV hypo thesis ofsteroidogenesis in thehuman ovaryJ. J Endocrinol, 1990,126(3):483-488.5Zhang FP, Rannikko A, Huhtaniemi I. Isolation andchiT.cterizction oftesTs ypecific cDNAs for 1 ureini zing hormone bulc.

15、 Sl.bl.ri i I ii ihuITIL J.Biochem Biophys Res Commun, 1995, 210(3):858-865.6Schepp W, Dehne K, Herrmuth H, et al. Identification and functionalimportaneeII. I :ten飛on r;：:.t p;：:ri1 ccl I sJAm J Physiol, 1998, 275(5 Pt 1):G1094-1095.7Chen L, Sun XD, Zhao J, et al. Distribution, cloning and seque ncing of GnRH, its receptor, and effects of gastric acid secretion of GnRH analogue in gastricparietal cells of ratsJ.Life Sci, 2005, 76(12):1351-1365.8于輝，唐旭，呂葆真，等.卵泡刺激素受體在大鼠下頜下腺及