第7章doc-上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院精品課程

1、臨床微生物學(xué)與檢驗(yàn) 第七章 細(xì)菌耐藥性檢測(cè)第七章 -細(xì)菌耐藥性檢測(cè) 一教學(xué)大綱要求 1.臨床常用抗菌藥物 2.抗菌藥物敏感試驗(yàn)3.細(xì)菌的耐藥性和產(chǎn)生機(jī)制4.細(xì)菌的耐藥性檢查 5.厭氧菌、真菌及分支桿菌體外藥敏試驗(yàn)二 教材內(nèi)容精要、抗菌藥物 1. 青霉素類 青霉素類抗生素是具有內(nèi)酰胺環(huán)的一類抗生素。作用機(jī)制為抑制細(xì)菌細(xì)胞壁的合成。種類包括青霉素G、青霉素V、苯唑西林、氯唑西林、雙氯西林、氟氯西林、氨芐西林、阿莫西林、羧芐西林、替卡西林、阿洛西林、美洛西林、哌拉西林、美西林等。2. 頭孢菌素類 第一代頭孢菌素類對(duì)革蘭陽(yáng)性細(xì)菌（包括青霉素敏感或耐受的葡萄球菌）的抗菌活性較第二、三代強(qiáng)。常用品種包括頭

2、孢唑啉、頭孢拉定、頭孢氨芐、頭孢羥氨芐、頭孢硫咪等。第二代頭孢菌素對(duì)革蘭陽(yáng)性細(xì)菌的活性與第一代相似或略差，對(duì)多數(shù)革蘭陰性細(xì)菌的抗菌活性較強(qiáng)，但對(duì)銅綠假單胞菌無(wú)抗菌活性。對(duì)-內(nèi)酰胺酶較穩(wěn)定，主要包括頭孢克洛、頭孢夫辛、頭孢夫辛酯、頭孢孟多等。第三代頭孢菌素對(duì)革蘭陽(yáng)性菌的抗菌活性不如第一、二代，對(duì)革蘭陰性細(xì)菌有較強(qiáng)的抗菌活性。對(duì)第一、二代頭孢菌素耐藥菌也較敏感。但是其抗革蘭陽(yáng)性細(xì)菌的活性仍然較弱。對(duì)-內(nèi)酰胺酶有較強(qiáng)的穩(wěn)定，組織穿透力較弱，半衰期較長(zhǎng)。主要包括頭孢噻肟、頭孢曲松、頭孢他啶、頭孢哌酮、頭孢妥倫匹酯、頭孢唑肟、頭孢地嗪、頭孢他美酯、頭孢美唑、頭孢泊肟酯、頭孢克肟等。 第四代頭孢菌素與第三

3、代相比，抗菌譜更廣泛。對(duì)革蘭陽(yáng)性球菌的抗菌活性增強(qiáng)，對(duì)-內(nèi)酰胺酶更穩(wěn)定。因此，對(duì)革蘭陰性細(xì)菌的抗菌活性仍然較強(qiáng)。主要包括頭孢吡肟、頭孢匹羅等。3. 碳青霉烯類 碳青霉烯類為一組新型-內(nèi)酰胺類抗生素，超廣譜高效能抗菌作用，對(duì)革蘭陰性細(xì)菌、陰性細(xì)菌、需氧菌、厭氧菌均有很強(qiáng)的抗菌活性，對(duì)-內(nèi)酰胺酶穩(wěn)定。有亞胺培南、美羅培南、帕尼培南等。4.頭霉素類 cephamycins包括頭孢西丁、頭孢美唑、頭孢替坦、頭孢米諾等?？咕V廣，對(duì)革蘭陰性菌、陽(yáng)性菌、厭氧菌及需氧菌均有較強(qiáng)的活性，對(duì)質(zhì)?；蛉旧w介導(dǎo)的-內(nèi)酰胺酶具有高度穩(wěn)定性?？咕饔门c第二代頭孢菌素相似。對(duì)革蘭陽(yáng)性菌的作用較弱，對(duì)革蘭陰性菌的抗菌活性較

4、強(qiáng)。銅綠假單胞菌、陰溝腸桿菌、腸球菌的多數(shù)菌株對(duì)頭孢西丁不敏感。產(chǎn)AmpC菌株、MRS菌株對(duì)本品不敏感。5. 單環(huán)類 氨曲南 （aztreonam）對(duì)-內(nèi)酰胺酶高度穩(wěn)定。對(duì)革蘭陰性需氧菌抗菌活性強(qiáng)大，但革蘭陽(yáng)性細(xì)菌及厭氧菌無(wú)抗菌作用。本品耐酶性能強(qiáng)，對(duì)青霉素類、頭孢菌素類及氨基糖苷類抗生素不敏感的細(xì)菌感染治療常仍然有效。6.-內(nèi)酰胺類/-內(nèi)酰胺酶抑制劑 -內(nèi)酰胺酶抑制劑(-Lactamase inhibitors)是一類新的-內(nèi)酰胺類藥物。迄今已開(kāi)發(fā)上市三種-內(nèi)酰胺酶抑制劑-克拉維酸、舒巴坦、他唑巴坦。（1）氨芐西林/舒巴坦 （ampicillin/sulbactam ）主要用于治療產(chǎn)-內(nèi)酰胺

5、酶的各種細(xì)菌感染。對(duì)流感嗜血桿菌、腸桿菌科細(xì)菌、金黃色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、脆弱類桿菌、卡他莫拉菌、腸球菌、不動(dòng)桿菌、布魯桿菌、淋球菌、腦膜炎球菌及霍亂弧菌等所致的感染性疾病具有較好的療效。一般不用于治療陰溝腸桿菌和銅綠假單胞菌感染。（2）阿莫西林/克拉維酸鉀 （amoxicillin/potassium clavulanate） 適用于扁桃腺炎、中耳炎、鼻竇炎、急性支氣管炎、慢性支氣管炎急性發(fā)作、肺炎及膿胸等呼吸道感染，膀胱炎、尿道炎、腎盂腎炎、產(chǎn)后感染、盆腔炎及淋病等泌尿生殖系統(tǒng)感染，癤瘡、蜂窩組織炎等皮膚軟組織感染，骨髓炎及膿毒癥等。（3）替卡西林/克拉維酸鉀 （ticarcillin

6、/ potassium clavulanate） 適用于治療敏感細(xì)菌所致的敗敗血癥、肺部感染、泌尿系統(tǒng)感染、腹膜炎、膽道感染、骨與關(guān)節(jié)感染、皮膚軟組織感染、手術(shù)后創(chuàng)口感染及淋病等。（4）哌拉西林/他唑巴坦 （piperacillin/tazobacta） 哌拉西林/他唑巴坦的適應(yīng)癥類似于氨芐西林/舒巴坦，主要用于腹腔感染、婦科感染、肺部感染（包括軍團(tuán)菌肺炎）、皮膚科感染，也可用于敗血癥、泌尿道感染及骨關(guān)節(jié)化膿性感染等。（5）頭孢哌酮/舒巴坦（cefoperazone/sulbactam） 適應(yīng)用于治療各種敏感細(xì)菌尤其是假單胞菌屬、葡萄球菌屬及脆弱類桿菌所致的肺部感染、泌尿道感染、腹腔感染及皮膚

7、軟組織感染。7糖肽類 （1） 萬(wàn)古霉素及去甲萬(wàn)古霉素 （Vancomycin Nor-vancomycin ）主要用于葡萄球菌(包括產(chǎn)酶株和耐甲氧西林株)、難辨梭狀芽胞桿菌等所致的系統(tǒng)感染和腸道感染，如心內(nèi)膜炎、敗血癥、偽膜性腸炎等。 替考拉寧 （Teicoplanin） 由放線菌產(chǎn)生的糖肽類抗生素，與萬(wàn)古霉素性質(zhì)近似。 對(duì)金葡菌，鏈球菌、李斯特菌、腸球菌等革蘭陽(yáng)性菌和一些厭氧菌有抗菌作用。對(duì)所有革蘭陰性菌、分枝桿菌、真菌等均無(wú)效。用于耐甲氧西林葡萄球菌和耐氨芐西林腸球菌所致的系統(tǒng)感染(中樞感染無(wú)效)。磷霉素類 磷霉素（Fosfomycin ）由多種鏈霉菌培養(yǎng)液中分離得的一種抗生素，現(xiàn)已由合成

8、法制取。能與細(xì)菌細(xì)胞壁一種合成酶相結(jié)合，阻礙細(xì)菌利用有關(guān)物質(zhì)合成細(xì)胞壁的第一步反應(yīng)，從而起殺菌作用。本品對(duì)耐甲氧西林金葡菌(MRSA)有抗菌作用。與其他抗生素間不存在交叉耐藥性。 主要用于敏感菌引起的尿路、皮膚及軟組織、腸道等部位感染。對(duì)肺部、腦膜感染和敗血癥也可考慮應(yīng)用。氨基糖苷類 由鏈霉菌產(chǎn)生（以-mycin結(jié)尾）者有：鏈霉素(streptomycin)、新霉素(neomycin)、卡那霉素(kanamycin，)、巴龍霉素(paromomycin)、大觀霉素（spectinomycin）、妥布霉素(tobramycin)等，及半合成的地貝卡星(dibekacin)、阿米卡星(amikac

9、in)、阿貝卡星(arbekacin)；由小單胞菌產(chǎn)生（以-micin結(jié)尾）者有：慶大霉素(gentamicin)、西索米星(sisomicin)、小諾米星(micronomicin)、阿司米星(astromicin)及半合成的奈替米星(netilmicin)、異帕米星(isepamicin)、依替米星（etimicin）等。 氨基糖苷類具有快速殺菌作用，其抗菌機(jī)制為多環(huán)節(jié)的復(fù)雜過(guò)程。主要作用于細(xì)菌體內(nèi)的核糖體，抑制蛋白質(zhì)合成，同時(shí)還能破壞細(xì)菌細(xì)胞膜的完整性。 共同特點(diǎn)：廣譜抗菌，對(duì)金黃色葡萄球菌與需氧革蘭陰性桿菌包括銅綠假單胞菌均有不同程度的抗菌作用，抗菌作用受pH值影響，在堿性條件下抗菌作

10、用增強(qiáng)；主要抑制細(xì)菌蛋白質(zhì)合成及使細(xì)菌細(xì)胞膜斷裂等多個(gè)環(huán)節(jié),對(duì)靜止期細(xì)菌發(fā)揮殺菌作用，為靜止期殺菌藥；血清蛋白結(jié)合率低，大多低于10（025）；以原形藥經(jīng)腎排泄，尿中藥物濃度高，尤以腎功能減退時(shí)明顯；氨基糖苷類與-內(nèi)酰胺類抗生素呈協(xié)同作用，尚可與氟喹諾酮類、大環(huán)內(nèi)酯類等多種抗生素聯(lián)合應(yīng)用；氨基糖苷類性質(zhì)穩(wěn)定，有效期長(zhǎng)，水溶性好，制劑除現(xiàn)有的粉針劑及水針劑外、近年有脂質(zhì)體及噴霧劑出現(xiàn)。 大環(huán)內(nèi)酯類 包括十四圓環(huán)的紅霉素、羅紅霉素、克拉霉素 、琥乙紅霉素等，十五圓環(huán)的阿奇霉素、十六圓環(huán)的麥迪霉素、米歐卡霉素。通過(guò)抑制細(xì)菌蛋白質(zhì)合成而發(fā)揮抗菌作用。對(duì)大多數(shù)革蘭陽(yáng)性細(xì)菌、革蘭陰性細(xì)菌、螺旋體、立克次體

11、及某些厭氧菌等均有抗菌作用。環(huán)素類 四環(huán)素類（tetrocycline）是由鏈霉菌所產(chǎn)生的或經(jīng)半合成而得。臨床常用者包括四環(huán)素、多西環(huán)素、米諾環(huán)素。該類藥物進(jìn)入細(xì)菌細(xì)胞后，特異地結(jié)合核糖體30S亞基，阻止氨酰-tRNA與后者結(jié)合，影響肽鏈延長(zhǎng)，使蛋白質(zhì)合成受阻，從而發(fā)揮抑制細(xì)菌生長(zhǎng)的作用。 四環(huán)素類為廣譜快效抑菌劑，最大特點(diǎn)是對(duì)立克次體、埃利克體、衣原體、支原體、螺旋體及一些原蟲等有明顯的抗菌活性；對(duì)臨床常見(jiàn)需氧菌及厭氧菌有抗菌活性?？擅顾仡?有林可霉素 與克林霉素兩種。抑制細(xì)菌蛋白質(zhì)合成而發(fā)揮其抗菌作用。對(duì)大多數(shù)革蘭陽(yáng)性細(xì)菌及某些厭氧革蘭陰性細(xì)菌具有抗菌活性。所有的革蘭陰性細(xì)菌、大多數(shù)腸球菌

12、、分枝桿菌和真菌對(duì)本品均不敏感。用于治療敏感細(xì)菌所致的呼吸道感染、軟組織感染、骨髓炎、關(guān)節(jié)感染、膽道感染及敗血癥等；對(duì)慢性骨髓炎，尤其是凝固酶陰性葡萄球菌所致的慢性骨髓炎療效好；也可用于治療厭氧菌感染等。唑烷酮類（oxazolidinine） 利奈唑胺（Linezolid）為合成的惡唑酮類(oxaxolidinones)抗菌。作用特點(diǎn)是對(duì)腸球菌和葡萄球菌起抑菌作用，對(duì)鏈球菌的多數(shù)株起殺菌作用。主要用于控制耐萬(wàn)古霉素屎腸球菌所致的系統(tǒng)感染，包括敗血癥，肺炎等。陽(yáng)菌素類（Streptogramins） 森樂(lè)西德 （Synercid-quinupristin/ dalfopristin）是四1999

13、年美國(guó)FDA批準(zhǔn)的第一個(gè)鏈陽(yáng)菌素類（streptogramin）藥物。由150mg 喹奴普丁與350mg 達(dá)夫普丁 （3：7）組成。作用于細(xì)菌核糖體，達(dá)夫普丁阻止蛋白質(zhì)早期合成，喹奴普丁阻止蛋白質(zhì)后期合成。對(duì)屎腸球菌呈抑菌活性，對(duì)糞腸球菌（E. faecalis）效果差 ，對(duì)葡萄球菌（MSS與MRS）、化膿性鏈球菌呈殺菌作用。用于成人嚴(yán)重或危及生命的萬(wàn)古霉素耐藥屎腸球菌(VREF)感染，用以清除血液中的細(xì)菌。金黃色葡萄球菌或化膿性鏈球菌性皮膚軟組織感染。喹諾酮類 臨床常用的氟喹諾酮類（fluoroquinolones）包括諾氟沙星、氧氟沙星、環(huán)丙沙星、左氧氟沙星 、加替沙星 、莫昔沙星。通過(guò)抑

14、制細(xì)菌的DAN螺旋酶及拓?fù)洚悩?gòu)酶而發(fā)揮殺菌作用。廣泛用于臨床各科細(xì)菌感染的治療。適用于敏感細(xì)菌，如革蘭陽(yáng)性細(xì)菌、革蘭陰性細(xì)菌等所致各種類型感染的治療。福霉素類 臨床常用利福平 （Rifampicin ）、利福噴丁 （ Rifapentine ）。對(duì)結(jié)核桿菌和其他分枝桿菌(包括麻風(fēng)桿菌等)，在宿主細(xì)胞內(nèi)、外均有明顯的殺菌作用。對(duì)腦膜炎球菌、流感嗜血桿菌、金黃色葡萄球菌、表皮鏈球菌、肺炎軍團(tuán)菌等也有一定的抗菌作用。對(duì)某些病毒、衣原體也有效。 主要應(yīng)用于肺結(jié)核和其他結(jié)核病，也可用于麻風(fēng)病的治療。利福平還可考慮用于耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(MRSA)所致的感染?？菇Y(jié)核治療時(shí)應(yīng)與其他抗結(jié)核藥聯(lián)合應(yīng)用。胺

15、類藥物 干擾細(xì)菌葉酸合成，間接抑制DNA合成發(fā)揮慢效抑菌作用。對(duì)臨床常見(jiàn)陽(yáng)性菌（包括MRSA、VRSA）、陰性菌（包括嗜麥芽窄食單胞菌）具有抗菌活性。包括可用于全身感染的磺胺甲基異惡唑、磺胺嘧啶，用于潰瘍性結(jié)腸炎的柳氮磺胺嘧啶銀，用于局部的磺胺米隆、磺胺醋酰鈉。分枝桿菌藥物 抗分枝桿菌病藥分以下3類： (1)抗生素 鏈霉素是主要的抗結(jié)核病藥。利福霉素類中利福平已成為常用的抗結(jié)核病藥，還可用于抗一些其他感染。(2)合成藥物 有異煙肼、乙胺丁醇、吡嗪酰胺、對(duì)氨基水楊酸、乙硫異煙胺及其類似物(丙硫異煙胺)等。 (3) 其他抗菌藥物, 如大環(huán)內(nèi)酯類等。 厭氧菌藥物硝基咪唑類 包括甲硝唑 （Metron

16、idazole）、替硝唑 （Tinidazole）、奧硝唑 （ornidazole）。是一類化學(xué)合成藥物，具有廣譜殺原蟲作用，是治療多種寄生蟲病效果較好的藥物。目前也廣泛用于厭氧細(xì)菌感染的治療。奧硝唑的抗菌及抗蟲作用機(jī)制與替硝唑相同，但其療效不及替硝唑。適用于治療滴蟲病、各種阿米巴病及賈第鞭毛蟲病等。也用于治療口腔、呼吸系統(tǒng)、鼻咽部、消化系統(tǒng)及盆腔等各部位厭氧細(xì)菌感染。還可用于治療酒糟鼻、疥瘡、銀屑病及破傷風(fēng)等疾病。兩性霉素B 及其脂質(zhì)體 作用于真菌細(xì)胞膜麥角固醇，使胞膜雙層脂膜形成微孔狀態(tài)，氧化反應(yīng)及膜離子運(yùn)動(dòng)失常，胞內(nèi)容物（主要是K+、Na+）外漏導(dǎo)致真菌溶解而死亡。真菌細(xì)胞膜通透性增加，

17、有利于藥物進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，與5-氟胞嘧啶（5-FC）聯(lián)合可表現(xiàn)為協(xié)同作用。 對(duì)新型隱球菌、曲霉菌、皮炎芽生菌、念珠菌及組織胞漿菌等多種致病真菌有較強(qiáng)的抗菌活性。白色念珠菌對(duì)本品可產(chǎn)生耐藥性。本品對(duì)毛霉菌，包括侵犯鼻、眼眶、支氣管及消化道者療效均不理想。脂質(zhì)體兩性霉素B是由兩性霉素B與膽固醇酰硫酸鹽按1：1的分子比形成的雙層環(huán)形復(fù)合結(jié)構(gòu)。這種結(jié)構(gòu)改變了兩性霉素B的藥理學(xué)和毒理學(xué)性質(zhì)。因此，脂質(zhì)體兩性霉素B降低了普通兩性霉素B的毒性，增強(qiáng)了抗真菌效果。而抗菌譜與兩性霉素B相同。主要用于治療嚴(yán)重深部真感染，包括新型隱球菌病、曲霉菌病、皮炎芽生菌病、念珠菌病及組織胞漿菌病等。215-氟胞嘧啶 為窄譜抗真菌

18、抑菌劑，高濃度時(shí)具殺菌作用。對(duì)隱球菌屬、念珠菌屬及球擬酵母樣菌有高度抗菌活性。5-FC進(jìn)入真菌細(xì)胞膜內(nèi)，可與兩性霉素B起協(xié)同作用。主要用于治療隱球菌及念珠菌等真菌引起的全身性感染或腦膜炎、肺部感染、尿路感染等。5-FC單用易發(fā)生耐藥性。22氟康唑 氟康唑?yàn)閺V譜三氮唑類抗真菌藥物，高度選擇性抑制真菌細(xì)胞色素P450依賴的14a-固醇去甲基酶(P450DM)，影響麥角固醇合成，抑制真菌生長(zhǎng)。對(duì)新型隱球菌、白色念珠菌、莢膜組織胞漿菌、皮炎芽生菌及球孢子菌等均有抗菌活性，但克柔念珠菌、光滑念珠菌對(duì)其耐藥。主要用于治療隱球菌及念珠菌等所致的嚴(yán)重深部真菌病。也可用語(yǔ)治療念珠菌性咽炎、食管炎、全身性念珠菌感

19、染。用0.2% 氟康唑治療念珠菌性角膜炎有效。23.曲康唑 伊曲康唑?qū)儆谌蝾悘V譜抗真菌藥物，其抗真菌譜及作用機(jī)制與酮康唑相似。對(duì)皮膚癬菌、念珠菌、隱球菌、糠秕孢子菌、曲菌等有較強(qiáng)抗菌活性。對(duì)深部真菌和表淺真菌均有抗菌作用。其抗菌作用機(jī)制與氟康唑相同。與酮康唑不同的是對(duì)孢子絲菌、曲霉菌、隱球菌、球孢子菌及暗色真菌等有高效。尤其是對(duì)皮膚癬菌、念珠菌、新型隱球菌、糠秕孢子菌及曲菌等具有較強(qiáng)的抗菌活性。24.戊烷脒 （pentamidine） 可用于治療卡氏肺孢子菌病、黑熱病及非洲錐蟲病。 抗菌藥物敏感試驗(yàn)1藥敏試驗(yàn)的抗菌藥物選擇臨床微生物學(xué)工作者應(yīng)熟悉常用抗菌藥物的藥理學(xué)特征和臨床適應(yīng)癥，并結(jié)合本

20、醫(yī)院、本地區(qū)的常用抗菌藥物和常見(jiàn)病原菌的耐藥狀況進(jìn)行藥敏試驗(yàn)的抗菌藥物選擇。應(yīng)重點(diǎn)選擇預(yù)測(cè)藥物即此種藥物的藥敏結(jié)果可預(yù)測(cè)同類藥物的敏感性。2K-B紙片瓊脂擴(kuò)散法（1）原理：將含有定量抗菌藥物的紙片貼在測(cè)試菌的瓊脂平板上，紙片中所含的藥物吸收瓊脂中的水分溶解后不斷地向紙片周圍擴(kuò)散，形成遞減的濃度梯度。在紙片周圍可抑菌濃度范圍內(nèi)測(cè)定菌的生長(zhǎng)被抑制，從而形成無(wú)菌生長(zhǎng)的透明圈即抑菌圈。抑菌圈的大小反映測(cè)試菌對(duì)測(cè)定藥物的敏感性。(2) 抗菌藥物紙片：專用藥敏紙片，用加樣或浸泡的方法使每片的藥量達(dá)到一定的規(guī)定量，冷凍干燥后密封，-20°C保存?zhèn)溆?。?）培養(yǎng)基：水解酪蛋白（Mueller-Hin

21、ton MH）瓊脂是對(duì)生長(zhǎng)較快的需氧和兼性厭氧菌進(jìn)行藥敏試驗(yàn)的標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)基，pH7.2-7.4，瓊脂厚度為4mm。對(duì)營(yíng)養(yǎng)要求較高的細(xì)菌進(jìn)行藥敏試驗(yàn)時(shí)，應(yīng)在MH瓊脂中加入相應(yīng)的營(yíng)養(yǎng)添加劑。（4）細(xì)菌接種：接種物的準(zhǔn)備可采用生長(zhǎng)法或直接菌落懸液法。為使藥敏試驗(yàn)的接種濃度標(biāo)準(zhǔn)化,應(yīng)使用0.5麥?zhǔn)媳葷針?biāo)準(zhǔn)的菌液濃度，制備好的菌液應(yīng)在15min內(nèi)接種完畢。置35孵育16-18h后讀取結(jié)果，苛養(yǎng)菌應(yīng)孵育在含CO2的環(huán)境中，葡萄球菌和腸球菌必須孵育24h，以檢測(cè)對(duì)苯唑西林和萬(wàn)古霉素的耐藥性。（5） 結(jié)果解釋和報(bào)告：用游標(biāo)卡尺或直尺量取抑菌圈直徑，參照NCCLS標(biāo)準(zhǔn)判斷結(jié)果。常分為以下三級(jí)：敏感（suscept

22、ible）：表示測(cè)試菌可被測(cè)定藥物常規(guī)劑量給藥后的所達(dá)到的血藥濃度所抑制或殺滅。中介（intermediate）：指測(cè)試菌對(duì)常規(guī)劑量用藥后體液或組織中的藥物濃度的反應(yīng)性低于敏感株，但在測(cè)定藥物濃集部位的體液（如尿液）或使用高于正常給藥量（如-內(nèi)酰胺類）臨床上使用有效。耐藥（resistant）：指測(cè)試菌不能被在體內(nèi)感染部位能達(dá)到的抗菌藥物濃度所抑制。（7） 紙片法藥敏結(jié)果的因素： 培養(yǎng)基的質(zhì)量對(duì)結(jié)果的準(zhǔn)確性有直接影響，如PH、硬度、濕度和深度等；藥敏紙片的含藥量是影響抑菌圈大小的重要因素；接種菌量正確與否是影響結(jié)果的重要因素之一；試驗(yàn)操作質(zhì)量；孵育條件和溫度、時(shí)間；抑菌圈測(cè)量工具的精確度；質(zhì)控

23、菌株本身的藥敏特性是否合格，有無(wú)變異。（8） 質(zhì)量控制： 采用標(biāo)準(zhǔn)菌株是進(jìn)行藥敏試驗(yàn)質(zhì)量控制的主要措施。常用的臨床藥敏質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)菌株有：金黃色葡萄球菌ATCC25923，大腸桿菌ATCC25922，銅綠假單胞菌ATCC27853 等。3稀釋法 稀釋法是定量測(cè)定抗菌藥物抑制細(xì)菌生長(zhǎng)作用的體外方法，分為瓊脂稀釋法和肉湯稀釋法。稀釋法所測(cè)得的某抗菌藥物能抑制待測(cè)菌肉眼可見(jiàn)生長(zhǎng)的最低藥物濃度稱為最小抑菌濃度（minimalinhibitory concentration，MIC）。（1） 肉湯稀釋法：常量稀釋法(macrodilution)和微量稀釋法(microdilution)。原理是 用MH肉湯將

24、抗菌藥物作不同濃度的稀釋后,再接種待測(cè)菌，定量測(cè)定抗菌藥物抑制或殺滅待測(cè)細(xì)菌的最低抑菌濃度或最低殺菌濃度（minimal bactericidal concentration MBC）。 對(duì)于需氧菌、兼性厭氧菌推薦使用M-H肉湯；而對(duì)于流感嗜血桿菌、鏈球菌則需在該培養(yǎng)液中加入補(bǔ)充營(yíng)養(yǎng)成分。（2） 脂稀釋法：瓊脂稀釋法是將不同濃度抗菌藥物分別混勻于瓊脂培養(yǎng)基中，配制出含各種濃度藥物的平板，使用微量多頭接種儀接種細(xì)菌，孵育后觀察細(xì)菌在含不同濃度藥物的平板上的生長(zhǎng)情況，以抑制細(xì)菌生長(zhǎng)的平板所含的藥物濃度測(cè)得最低抑菌濃度（MIC）。該法的特點(diǎn)時(shí)可同時(shí)做多株細(xì)菌的MIC測(cè)定，結(jié)果重復(fù)性優(yōu)于肉湯稀釋法，且

25、易于發(fā)現(xiàn)耐藥突變株或污染，是驗(yàn)證新藥體外抗菌活性時(shí)常用的參照標(biāo)準(zhǔn)。4E 試驗(yàn)：E 試驗(yàn)是一種結(jié)合了稀釋法和擴(kuò)散法的原理和特點(diǎn)測(cè)定微生物對(duì)抗菌藥物的敏感度的定量技術(shù)。 5聯(lián)合藥物敏感試驗(yàn)和殺菌試驗(yàn)抗菌藥物聯(lián)合用藥可以出現(xiàn)4種結(jié)果：無(wú)關(guān)作用：兩種藥物聯(lián)合作用的活性等于其單獨(dú)活性；拮抗作用：兩種藥物聯(lián)合作用顯著低于單獨(dú)抗菌活性；累加作用：兩種藥物聯(lián)合作用時(shí)的活性等于兩種單獨(dú)抗菌活性之和；協(xié)同作用：兩種藥物聯(lián)合作用顯著大于其單獨(dú)作用的總和。（1）聯(lián)合抑菌試驗(yàn)：棋盤稀釋法是目前臨床實(shí)驗(yàn)室常用的聯(lián)合抑菌定量方法。計(jì)算部分抑菌濃度（fractional inhibitory concentration,FI

26、C）指數(shù)。 A藥聯(lián)合時(shí)MIC B藥聯(lián)合時(shí)MICFIC指數(shù)=+ A藥單測(cè)時(shí)MIC B藥單測(cè)MIC判斷標(biāo)準(zhǔn)：FIC指數(shù) 0.5為協(xié)同作用；0.51為相加作用；12為無(wú)關(guān)作用2為拮抗作用。（3） 最低殺菌濃度測(cè)定：MBC是指能殺滅99.9%以上測(cè)試菌量的最低藥物濃度。測(cè)試的方法包括培養(yǎng)基、藥物稀釋、細(xì)菌懸液接種等，與MIC測(cè)定法相同，不同之處是：生長(zhǎng)對(duì)照用MH肉湯以1：10稀釋度連續(xù)4次稀釋，35孵育過(guò)夜，計(jì)算菌落數(shù)。當(dāng)MIC無(wú)肉眼可見(jiàn)菌生長(zhǎng)管中的菌落數(shù)最初接種菌落數(shù)的0.1%，該管的最低藥物濃度即為MBC。細(xì)菌耐藥性和產(chǎn)生機(jī)制1、細(xì)菌耐藥性的概念：細(xì)菌的耐藥性是指致病微生物對(duì)于抗菌藥物作用的耐受性

27、和對(duì)抗性。它是抗菌藥物、細(xì)菌本身及環(huán)境共同作用的結(jié)果。它可分為天然耐藥和獲得性耐藥，前者通過(guò)染色體DNA突變而致，后者大多是由質(zhì)粒、噬菌體及其他遺傳物質(zhì)攜帶外來(lái)DNA片段導(dǎo)致的耐藥性的產(chǎn)生。2、細(xì)菌耐藥性的產(chǎn)生機(jī)制（1）-內(nèi)酰胺酶：-內(nèi)酰胺酶是多種不同類型以-內(nèi)酰胺類抗菌藥物為底物的降解酶。它水解-內(nèi)酰胺環(huán)造成-內(nèi)酰胺類藥物失去活性，其水解率是細(xì)菌耐藥性的主要決定因素?，F(xiàn)在已知的-內(nèi)酰胺酶有170多種，目前常用的分類方法有Ambler 的分子結(jié)構(gòu)分類法和Bush的功能分類法。前者將-內(nèi)酰胺酶分為A、B、C、D四類，其中A、C、D類酶以絲氨酸（Ser）為活性作用單位。而后者是綜合酶的分子結(jié)構(gòu)、抑

28、制性及水解底物特征進(jìn)行分類。（2）鈍化酶或滅活酶：氨基糖苷類鈍化酶是細(xì)菌對(duì)氨基糖苷類抗菌藥物獲得性耐藥的主要機(jī)制。當(dāng)細(xì)菌獲得了編碼產(chǎn)生氯霉素轉(zhuǎn)?；福–AT）的質(zhì)粒后，可產(chǎn)生CAT使氯霉素羥基乙?；?，從而轉(zhuǎn)化成無(wú)活性的衍生物。（4） 紅霉素酶和其他滅活酶 由于細(xì)菌產(chǎn)生紅霉素酯酶或通過(guò)2-磷酸轉(zhuǎn)移酶催化的磷酸化反應(yīng)破壞了大環(huán)類酯類的十四元環(huán)藥物的酯環(huán)而造成的耐藥。（5） 青霉素結(jié)合蛋白的改變：青霉素結(jié)合蛋白（penicillin binding protein PBP）為細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)膜上的-內(nèi)酰胺類抗生素的作用靶位蛋白。由于細(xì)菌獲得外源性DNA，編碼產(chǎn)生新的低親和力的PBP或PBP本身發(fā)生修飾，對(duì)

29、抗菌藥物親和力降低，從而導(dǎo)致細(xì)菌對(duì)-內(nèi)酰胺類抗生素耐藥。 (5) 抗菌藥物作用靶位的改變：細(xì)菌通過(guò)與抗菌藥物作用靶位的改變使抗菌藥物不易結(jié)合導(dǎo)致其難以發(fā)揮效應(yīng)。（6）抗菌藥物的滲透障礙：外膜孔蛋白（porin）的突變導(dǎo)致細(xì)菌對(duì)-內(nèi)酰胺類抗生素的耐藥；藥物外排泵作用能將進(jìn)入菌體內(nèi)的藥物不斷泵出，使菌體內(nèi)的藥物濃度不足以發(fā)揮抗菌作用而導(dǎo)致耐藥。細(xì)菌耐藥性檢測(cè)方法1、細(xì)菌耐藥表型檢測(cè)：判斷細(xì)菌對(duì)抗菌藥物的耐藥性可根據(jù)NCCLS標(biāo)準(zhǔn)，通過(guò)測(cè)量紙片擴(kuò)散法、肉湯稀釋法和E試驗(yàn)的抑菌圈直徑、MIC值和IC值獲得。也可通過(guò)以下方法進(jìn)行檢測(cè)：（1）耐藥篩選試驗(yàn)：以單一藥物的單一濃度檢測(cè)細(xì)菌的耐藥性被稱為耐藥篩選

30、試驗(yàn)，臨床上常用于篩選耐甲氧西林葡萄球菌、萬(wàn)古霉素中介的葡萄球菌、耐萬(wàn)古霉素腸球菌及氨基糖苷類高水平耐藥的腸球菌等。（2）折點(diǎn)敏感試驗(yàn)：僅用特定的抗菌藥物濃度（敏感、中介或耐藥折點(diǎn)MIC），而不使用測(cè)定MIC時(shí)所用的系列對(duì)倍稀釋抗生素濃度測(cè)試細(xì)菌對(duì)抗菌藥物的敏感性，稱為折點(diǎn)敏感試驗(yàn)。雙紙片協(xié)同試驗(yàn)：雙紙片協(xié)同試驗(yàn)是主要用于篩選產(chǎn)超廣譜-內(nèi)酰胺酶（ESBLs）革蘭陰性桿菌的紙片瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)。若指示藥敏紙片在朝向阿莫西林/克拉維酸方向有抑菌圈擴(kuò)大現(xiàn)象（協(xié)同），說(shuō)明測(cè)試菌產(chǎn)生超廣譜-內(nèi)酰胺酶（1） 藥敏試驗(yàn)的儀器化和自動(dòng)化：全自動(dòng)細(xì)菌鑒定及藥敏分析儀如：Vitek-2、BD-Pheonix、Micr

31、oscan等運(yùn)用折點(diǎn)敏感試驗(yàn)的原理可半定量測(cè)定抗菌藥物的MIC值。 2-內(nèi)酰胺酶檢測(cè)：主要有碘淀粉測(cè)定法（iodometric test）和頭孢硝噻吩紙片法（nitrocefin test）。臨床常用頭孢硝噻吩紙片法，-內(nèi)酰胺酶試驗(yàn)可快速檢測(cè)流感嗜血桿菌、淋病奈瑟菌、卡他莫拉菌和腸球菌對(duì)青霉素的耐藥性。如-內(nèi)酰胺酶陽(yáng)性，表示上述細(xì)菌對(duì)青霉素、氨芐西林、阿莫西林耐藥；表示葡萄球菌和腸球菌對(duì)青霉素（包括氨基、羧基和脲基青霉素）耐藥。3耐藥基因檢測(cè)：臨床可檢測(cè)的耐藥基因主要有：葡萄球菌與甲氧西林耐藥有關(guān)的MecA基因,大腸埃希菌與-內(nèi)酰胺類耐藥有關(guān)的blaTEM、blaSHV、blaOXA基因，腸球

32、菌與萬(wàn)古霉素耐藥有關(guān)的vanA、vanB、vanC、vanD基因。檢測(cè)抗菌藥物耐藥基因的方法主要有：PCR擴(kuò)增、PCR-RFLP分析、PCR-SSCP 分析、PCR-線性探針?lè)治觥⑸镄酒夹g(shù) 、自動(dòng)DNA測(cè)序 4特殊耐藥菌檢測(cè)（1）耐甲氧西林葡萄球菌檢測(cè)：對(duì) 1g苯唑西林紙片的抑菌圈直徑10，或其MIC4g/ml的金黃色葡萄球菌和對(duì)1g苯唑西林紙片的抑菌圈直徑17，或MIC0.5g/ml的凝固酶陰性葡萄球菌被稱為耐甲氧西林葡萄球菌（MRS）。對(duì)MRS不論其體外藥敏試驗(yàn)結(jié)果，所有的-內(nèi)酰胺類藥物和-內(nèi)酰胺/-內(nèi)酰胺酶抑制劑均顯示臨床無(wú)效；絕大多數(shù)的MRS常為多重耐藥，耐藥范圍包括氨基糖甙類、大

33、環(huán)內(nèi)酯類、四環(huán)素類等。（2）耐青霉素肺炎鏈球菌檢測(cè)：當(dāng)對(duì)1g苯唑西林紙片抑菌圈直徑20或MIC0.06g/ml均應(yīng)視為耐青霉素肺炎鏈球菌（PRSP）。臨床治療顯示 PRSP對(duì)氨卞西林、氨卞西林/舒巴坦、頭胞克肟、頭胞唑肟，臨床治療療效很差，但應(yīng)檢測(cè)對(duì)頭胞曲松、頭胞噻肟和美洛培南等的MIC以判斷是否對(duì)這些抗生素敏感。（3） 耐萬(wàn)古霉素腸球菌檢測(cè)：腸球菌對(duì)30g萬(wàn)古霉素紙片抑菌圈直徑14或MIC32g/ml被稱為耐萬(wàn)古霉素腸球菌（VRE）。針對(duì)多重萬(wàn)古霉素藥物目前尚無(wú)有效治療方法，但對(duì)青霉素敏感的VRE可用青霉素和慶大霉素聯(lián)合治療，若對(duì)青霉素耐藥而不是高水平耐氨基糖甙類可用壁霉素+慶大霉素。（4）

34、產(chǎn)超廣譜-內(nèi)酰胺酶的腸桿菌科細(xì)菌檢測(cè)： 超廣譜-內(nèi)酰胺酶是一種能水解青霉素、廣譜頭孢菌素及單胺類的酶，主要由克雷伯菌、腸桿菌等細(xì)菌產(chǎn)生。當(dāng)通過(guò)篩選法時(shí)對(duì)頭孢泊肟、頭孢他啶（10g/片）抑菌圈22或氨曲南、頭孢噻肟（30g/片）27的菌株經(jīng)頭孢他啶（30g/片）、頭孢他啶/克拉維酸（30/10g）；頭孢噻肟（30g/片）、頭孢噻肟/克拉維酸（30/10g）兩組表型確證試驗(yàn)，其結(jié)果為兩組中任何一組藥物加克拉維酸與不加克拉維酸的抑菌圈相比，增大值5時(shí)判斷為產(chǎn)ESBL菌株（圖7-13）。 產(chǎn)ESBL克雷伯菌和大腸埃希菌不論其體外藥物敏感試驗(yàn)結(jié)果如何，對(duì)青霉素、頭孢菌素和氨曲南治療無(wú)效。 厭氧菌和結(jié)核分

35、枝桿菌的體外抗菌藥物敏感試驗(yàn)1厭氧菌的體外抗菌藥物敏感試驗(yàn)：以下情況應(yīng)考慮進(jìn)行厭氧菌的體外藥敏試驗(yàn)：明確系厭氧菌引起的嚴(yán)重感染，如敗血癥、心內(nèi)膜炎、腦膿腫等，已確診的厭氧菌感染，但根據(jù)經(jīng)驗(yàn)選藥治療效果不好；需長(zhǎng)期用藥治療的厭氧菌感染，如骨髓炎等。目前臨床實(shí)驗(yàn)室所開(kāi)展的厭氧菌體外藥敏試驗(yàn)分為稀釋法和擴(kuò)散法兩類，前者包括瓊脂稀釋法和肉湯稀釋法，后者主要為E試驗(yàn)。 （1）稀釋法：肉湯稀釋法和瓊脂稀釋法。除培養(yǎng)基、操作環(huán)境和培養(yǎng)條件等根據(jù)厭氧菌的特定需要有所變化外，其基本原理和方法與需氧菌稀釋法藥敏實(shí)驗(yàn)相同。（2）E試驗(yàn)法：祥見(jiàn)本章第一節(jié)。 2結(jié)核分枝桿菌藥物敏感試驗(yàn)（1）NCCLS關(guān)于臨床實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行結(jié)核分枝桿菌體外抗菌藥物敏感試驗(yàn)的指征（2）體外藥敏試驗(yàn)抗分枝桿菌藥物的選擇一線抗癆藥：異煙肼、乙胺丁醇、利福平、吡嗪酰胺、二線抗癆藥主要有：鏈霉素、阿米卡星、環(huán)丙沙星、環(huán)絲氨酸等二線抗癆藥物的藥敏試驗(yàn)僅在測(cè)試菌對(duì)一線藥物耐藥時(shí)方考慮進(jìn)行。（3）培養(yǎng)基： Middlebrook和Cohn7H10和7H11瓊脂。（4）結(jié)核分枝桿菌體外藥敏試驗(yàn)方法：比例法，絕對(duì)濃度法和耐藥率法是結(jié)核分枝桿菌體外藥敏試驗(yàn)的種經(jīng)典方法。（5