基因多態(tài)性分析

1、人基因多態(tài)性分析一、實驗目的1. 了解基因多態(tài)性在闡明人體對疾病、毒物的易感性與耐受性、疾病臨床 表現(xiàn)的多樣性以及對藥物治療的反應性中的重要作用。2. 了解分析基因多態(tài)性的基本原理和研究方法。二、實驗原理基因多態(tài)性(gene polymorphism)是指在一個生物群體中，同時存在兩種及 以上的變異型或基因型或等位基因， 也稱為遺傳多態(tài)性(genetic polymorphism)。 人類基因多態(tài)性對于闡明人體對疾病的易感性、毒物的耐受性、藥物代謝差異及遺傳性疾病的分子機制有重大意義；與致病基因連鎖的多態(tài)性位點可作為遺傳病 的診斷標記，并為分離克隆致病基因提供依據(jù)；病因未知的疾病與候選基因多態(tài)

2、 性的相關(guān)性分析，可用于輔助篩選致病易感基因。聚合酶鏈反應-限制性片段長度多態(tài)性(polymerase chain reaction Restriction Fragment Length Polymorphism, PCR-RFLP)分析是一種常用的 DNA 分子標記。 原理是通過PCR擴增獲得目的基因。若目的基因存在等位變異(多態(tài)性)，且變 異正好發(fā)生在某種限制性內(nèi)切酶識別位點上，使酶切位點增加或者消失，則酶切結(jié)果就會產(chǎn)生大小不同的片段，即片段長度多態(tài)性，再利用瓊脂糖凝膠電泳分離， 可呈現(xiàn)出多態(tài)性電泳圖譜。若將患者與正常的多態(tài)性圖譜比較，可確定是否變異。 應用PCR-RFLP，可檢測某一致

3、病基因已知的點突變，進行直接基因診斷，也可 以此為遺傳標記進行連鎖分析進行間接基因診斷。三、器材與試劑1. 器材離心機。DNA擴增儀。電泳儀。水平電泳槽。紫外檢測儀。移液器。2試劑口腔拭子DNA抽提試劑盒。瓊脂糖。1XTAE電泳緩沖液：980ml蒸餾水中加入50XTAE母液20ml。50XTAE 母液：Tris 121g, 0.5M EDTA (pH8.0) 50ml，冰醋酸 28.55ml, 定容至500ml o上樣緩沖液(6X) ： 30mM EDTA, 40%(V/V)甘油，0.05% (W/V)二甲 苯青FF, 0.05% (W/V )溴酚藍。(6) 10 mg/ml 溴化乙錠(EB)

4、。(7) DNA Marker。四、實驗方法1. 基因組DNA抽提細胞采集：口腔拭子(消毒后的棉簽)擦拭兩側(cè)臉頰各10次，采集口腔粘膜脫落細胞， 將拭子轉(zhuǎn)置于2mL離心管中，用剪刀將棉簽部分剪下，加入DNA抽提試劑盒中 的400 Z緩沖液GA o注意：為了保證樣本不被食物或者飲料污染， 取樣前30分鐘內(nèi)請勿進食和飲水。DNA提?。簠⒄赵噭┖姓f明書操作。樣品保存：DNA產(chǎn)物應保存在-20T，以防DNA降解。下次實驗再用。2. DNA濃度及純度檢測可用瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度計檢測 DNA樣品的濃度與純度。瓊脂糖凝膠電泳法定性檢測DNA參照實驗16 DNA瓊脂糖電泳。紫外分光光度法定量檢測DN

5、A濃度及純度參照實驗20動物肝臟DNA的提取和檢測。測定濃度后，稀釋至0.25ug/uL 備用。3. 聚合酶鏈反應-限制性片段長度多態(tài)性(PCR-RFLP)分析查找基因序列選擇你感興趣的目的基因，首先查閱文獻，如果已有報道并提供了該基因在Gen ba nk中的ID號，可直接在美國國立生物技術(shù)信息中心（ Natio nal Ce nter for Biotech no logy In formatio n） 中搜索。登陸 http:/www. ncbi. nlm.n ，先選擇 核酸數(shù)據(jù)庫，點擊下拉框選擇Nucleotide，再把Genbank ID號輸入搜索框，點 擊 Search

6、如（圖 25-1）:2 媲 ResourcesvHowTo%NCBINat onai Center (or viCal3：asiSb*圖25-1查找目的基因步驟1如果只是知道基因的名字，貝U搜索框中輸入基因名稱，點擊 seared通常會 產(chǎn)生大量的搜索結(jié)果，例如搜索人乙醛脫氫酶基因， search后進入如下界面（圖 25-2），共有700余條結(jié)果：圖25-2查找目的基因步驟2真核生物基因通常是斷裂基因，含有大量間隔區(qū)，序列龐大，若查看全基因 序列，可點擊Geno mic，如果只想獲取轉(zhuǎn)錄區(qū)，點擊 Tran script查看轉(zhuǎn)錄本，點 擊后進入如下界面（圖25-3）:Lirnitft|>&

7、#171;,l艸Sn-Jinirirj Sn ltttof(r*-i土丄辿hir font r&tiJB Xajno.aamm litithif Ja ttehlraiMUM金 tamiklmihichQiidriilif*m*?i. tMaaict Hiint工 tnRHA ' i 935 ftp Inear *nRNAAccKskn NMnQD104flS9 i Ql 32$9lQK舸rEFK FAST舛 QrgpMEM 貝刖atM 軒碁即:聊辿芻世丼h應豈奪也cmw站負2 d3!：忙只©訝甘址削.丄丄<3?.Wn>t冷“幕1丄27 0?3 ba in

8、eiintfiMAcciicn NM_0Q069O 3 G) 325910W2百期日刁* MT A Gf3t>h csSlAiMaj¥ C3 Eadtedc 0 ll.SDCiflei nRh*応)AndhtheseHjr ±l_吐'圖25-3查找目的基因步驟 3些基因通過轉(zhuǎn)錄后加工，通常不止一個轉(zhuǎn)錄本，例如此處的ALDH2就有2個，根據(jù)你所查閱的文獻和這些序列中的解釋綜合考慮選擇你所需要的序列點擊后進入（圖25-4）:%RE30Ur«3 -卜 CWlONucl&ntideNucletid-s 二;Li ；it= -ilMan d0呂口1山&

9、#165; £電址1 口:G&nBinkHomo sapiens 創(chuàng)口ehyde dliydrogeFiase 2 ramily (mitochondrial) (ALDH24 trantcripl variant 2, mRNANC6FRBiK(BflU W旳u*陽 NU W1：0-tfia； 1F朗T=WSend; 9Change ireginn -CU$lDml£6 VIL LKVS1W5 1 山陽l込，討FIT lHWLT-IMMH 肝甲=¥】也h芳蛀 4drdr;-c<»-u« E fur air 加譏 xhwdrgU&

10、#39;)II, li-iu.script v-i»-lizit 2 iKNa,WUJElLlMIJJU 膽 IM 出 0VTJUr-!KEOFJS50WE.血承JH0NT?ljDnJ2D4ffl9- 1 GI 昭羽liTTBlilTfl £ipj ZILE (twin)Hut «工Anfltyre in s sec Rur BLASTPiO.Pilmsfshi; "liht Eeq _eEnd in :his S<qi去i tic le勺 dL joL LIn<.i-a±04Cr ari nt i;/ftirl abj nt A;

11、 EutqLq d£ ion l :圖25-4查找目的基因步驟 4此頁面中有關(guān)于該基因信息的詳盡描述，可直接到頁面底部查看基因序列(圖 25-5)161 131 211 3U1 3&1- - - - * - 11 a a - - - r - - - a - - - - X E - -3< & 284O6204OB2S445667789900 1223341 1 1 1153115&11621168117411801ta&itazigit ggctgcc getctegtc 姿卯uc的 a*ccage age gtcigrijga get g包握龍

12、Mtsc eecggga «ira«irt ctgggcccag ctc&ccgcce a：c att-gtgc gic aa習七耳耳 ac aguacu tua詐tgctg g£CC4gtget gljeaECa acc£&gcag£ au莒召百孕廻u tc ttcatcc teg tttggagCCQ gagtaeggge aactcaitaac eticaaiaatc fetgagggla. atgatttt la. egattt tacaacc tgegegeggggcg cgctcgctgt t竜麻甫EU當UE耳 cc

13、gaggtctl aa&caltcce acaaggee ill tgg&catggt aaaccatcc fcccfcaf at ccttggc&ac tctatgtggc ctgeattlgg catt cacagg t caaga-gagit at it gEfctte gctgtgsegg gCEttgeecg ggccgcaggt aagagggggc agcccactgt ggscagt&t attccasgta tgtsssigge agteaccett tgcaggcata aatcat£C0孕 e霍yg：迂色毎*n tattgggtc

14、sgggagcgggg ccgctagccc CGtGttgtG c tgcaa.ccag ciccglcaal gagaccetg Cictca.aatgt c&ttg&cgga ctttccgtgj tgaaaegtg c&acc .gatc ccccacgge t ctccactgag ucct七呂理a玉 ggucitfC" CtCCQgg4CC £<CCliELet ggatgaaact 番wage tgctf gtttggagtc«ee= teecc ?stes iggsg tg£tggotac cactg&

15、;agtg ecttcctccc tgatGCttg igaiigttctaigasgtattg aacett < aaaaalagat ggggaagaaa tttgtattct uaaat c aaa.t gt g t aigct attgt fgctaasattcg.gctca£t getgegatgt 卒強匸隧 at tttc ccg-tectctg gacaaLt ggca ctccggtatt gaettettea latttcccfc gttgtgatga iagmgctg ggggecgcca 注t tggccgcg ut聲昶需孕 ua首理c&ut tt

16、egtgegg cEaUrtc u述tltafl織gtgcagutgCCigetgtct ggs&fft烈烈 siag&tgtcgg aaaactgt匚直 tcagcc-attct4aegaea.A tatcct c t.c:t tt aciia.tt&tggccct當宜匡程 tgc gegetge GGGtggCCgt ac&atga&tg Eagaggteat agccctatgt atgeeggetg getacacacg tcctfat gu竈 aggt&gctga gelt Heeccc ttgeetecca taatccaggtaga

17、gccc ca tagccct £tt aggacatcta ggiacccctt agatcctegg gcattgctgcgcatgacc&t ccat毎耳京gga L皀m亡魚 gggteetg ggagtggccg cagtcaaagtatceaaagttttgatasfteft eaLitaetget ctgaaac get atcaecattctagctgctcccct粗匡ctct cgcccgcttcgebe gatgee ctgtcagglfi cate Leetacggetgataag ccat gaacct gC8t 話ayccagacaccc tg6tEK

18、EKte t&iggatgtg tgetgctggg cate atcatg cttcaaecftg tgfttgagttt t£*ttgcatg ctac atcaactgaccgtggt cgcc&aggag 龍It寸1$龍 Utccaca<e "譏 gatgtg gSSttgggC! gcctcaaag cage 陰口 tut酩t£g£ttS ttcagg tcct ataact 礙字Aaetgc ttacttaca圖25-5查找目的基因步驟 5設計引物設計引物的常用軟件有 Primer Premier 5.0, Oligo 6.22等，以及在線設計程 序女口 /cgi-bin/web-primer及 NCBI 上的 Primer Blast 等。 這些軟件能根據(jù)引物設計基本原則以及你的需求，設計并推