實(shí)驗(yàn)二液泡系和線粒體的活體染色及觀察

1、實(shí)驗(yàn)二實(shí)驗(yàn)二液泡系和線粒體的活體染色及觀察液泡系和線粒體的活體染色及觀察College of Life Science and Technology, XINJIANG Univercity一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康囊?、?shí)驗(yàn)?zāi)康膎學(xué)習(xí)并了解線粒體和液泡系超活染色的基本原學(xué)習(xí)并了解線粒體和液泡系超活染色的基本原理、方法和注意事項(xiàng)；理、方法和注意事項(xiàng)；n學(xué)習(xí)如何觀察動(dòng)、植物活細(xì)胞內(nèi)線粒體、液泡學(xué)習(xí)如何觀察動(dòng)、植物活細(xì)胞內(nèi)線粒體、液泡系；系；n了解動(dòng)、植物活細(xì)胞內(nèi)線粒體、液泡系的形態(tài)、了解動(dòng)、植物活細(xì)胞內(nèi)線粒體、液泡系的形態(tài)、數(shù)量與分布；數(shù)量與分布；n學(xué)習(xí)并掌握線粒體和液泡系的超活染色技術(shù)。學(xué)習(xí)并掌握線粒體和液泡

2、系的超活染色技術(shù)。n了解植物細(xì)胞液泡系的發(fā)育過程。了解植物細(xì)胞液泡系的發(fā)育過程。二、實(shí)驗(yàn)原理二、實(shí)驗(yàn)原理 活體染色是指對(duì)生活有機(jī)體的細(xì)胞或活體染色是指對(duì)生活有機(jī)體的細(xì)胞或組織能著色但又無毒害的一種染色方法。組織能著色但又無毒害的一種染色方法。它的目的是顯示生活細(xì)胞內(nèi)的某些結(jié)構(gòu)，它的目的是顯示生活細(xì)胞內(nèi)的某些結(jié)構(gòu)，而不影響細(xì)胞的生命活動(dòng)和產(chǎn)生任何物理、而不影響細(xì)胞的生命活動(dòng)和產(chǎn)生任何物理、化學(xué)變化以致引起細(xì)胞的死亡?；钊炯夹g(shù)化學(xué)變化以致引起細(xì)胞的死亡?；钊炯夹g(shù)可用來研究生活狀態(tài)下的細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)和可用來研究生活狀態(tài)下的細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)和生理、病理狀態(tài)。生理、病理狀態(tài)。 根據(jù)所用染色劑的性質(zhì)和染色方法的

3、根據(jù)所用染色劑的性質(zhì)和染色方法的不同，通常把活體染色分為體內(nèi)活染與體不同，通常把活體染色分為體內(nèi)活染與體外活染兩類。體內(nèi)活染是以膠體狀的染料外活染兩類。體內(nèi)活染是以膠體狀的染料溶液注入動(dòng)、植物體內(nèi)，染料的膠粒固定、溶液注入動(dòng)、植物體內(nèi)，染料的膠粒固定、堆積在細(xì)胞內(nèi)某些特殊結(jié)構(gòu)里，達(dá)到易于堆積在細(xì)胞內(nèi)某些特殊結(jié)構(gòu)里，達(dá)到易于識(shí)別的目的。體外活染又稱超活染色，它識(shí)別的目的。體外活染又稱超活染色，它是由活的動(dòng)、植物分離出部分細(xì)胞或組織是由活的動(dòng)、植物分離出部分細(xì)胞或組織小塊，以染料溶液浸染，染料被選擇固定小塊，以染料溶液浸染，染料被選擇固定在活細(xì)胞的某種結(jié)構(gòu)上而顯色。在活細(xì)胞的某種結(jié)構(gòu)上而顯色。 二

4、、實(shí)驗(yàn)原理二、實(shí)驗(yàn)原理 活體染料之所以能固定、堆積在細(xì)胞內(nèi)某些特殊的部活體染料之所以能固定、堆積在細(xì)胞內(nèi)某些特殊的部分，主要是染料的分，主要是染料的“電化學(xué)電化學(xué)”特性起重要作用。堿性染料特性起重要作用。堿性染料的膠粒表面帶陽離子，酸性燃料的膠粒表面帶陰離子，而的膠粒表面帶陽離子，酸性燃料的膠粒表面帶陰離子，而被染的部分本身也是具有陰離子或陽離子，這樣，它們彼被染的部分本身也是具有陰離子或陽離子，這樣，它們彼此之間就發(fā)生了吸引作用。但不是任何染料皆可以作為活此之間就發(fā)生了吸引作用。但不是任何染料皆可以作為活體染色劑之用，應(yīng)選擇那些對(duì)細(xì)胞無毒性或毒性較小的染體染色劑之用，應(yīng)選擇那些對(duì)細(xì)胞無毒性或

5、毒性較小的染料，而且總是要配成稀淡的溶液來使用。一般是以堿性染料，而且總是要配成稀淡的溶液來使用。一般是以堿性染料最為適用，可能因?yàn)樗哂腥芙庠陬愔|(zhì)（如卵磷脂、料最為適用，可能因?yàn)樗哂腥芙庠陬愔|(zhì)（如卵磷脂、膽固醇等）的特性，易于被細(xì)胞吸收。膽固醇等）的特性，易于被細(xì)胞吸收。詹姆斯綠詹姆斯綠B B（Janus Janus green Bgreen B）和中性紅（）和中性紅（neutral redneutral red）兩種堿性染料是活體）兩種堿性染料是活體染色劑中最重要的染料，對(duì)于線粒體和液泡系的染色各有染色劑中最重要的染料，對(duì)于線粒體和液泡系的染色各有專一性。專一性。二、實(shí)驗(yàn)原理二、實(shí)驗(yàn)

6、原理n線粒體是細(xì)胞內(nèi)重要的細(xì)胞器，線粒體內(nèi)膜上線粒體是細(xì)胞內(nèi)重要的細(xì)胞器，線粒體內(nèi)膜上分布有細(xì)胞色素氧化酶，該酶能使詹姆斯綠分布有細(xì)胞色素氧化酶，該酶能使詹姆斯綠B B保持在氧化狀態(tài)，呈現(xiàn)藍(lán)綠色從而使線粒體顯保持在氧化狀態(tài)，呈現(xiàn)藍(lán)綠色從而使線粒體顯色，而細(xì)胞質(zhì)中的染料被還原成無色。色，而細(xì)胞質(zhì)中的染料被還原成無色。n液泡是細(xì)胞內(nèi)濃縮產(chǎn)物的主要場所，有十分重液泡是細(xì)胞內(nèi)濃縮產(chǎn)物的主要場所，有十分重要的功能。中性紅是液泡的特殊染色劑，將液要的功能。中性紅是液泡的特殊染色劑，將液泡染成紅色。在活細(xì)胞中，細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核不泡染成紅色。在活細(xì)胞中，細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核不著色。如果細(xì)胞死亡，染料會(huì)彌散開來，使核著

7、色。如果細(xì)胞死亡，染料會(huì)彌散開來，使核著色。著色。二、實(shí)驗(yàn)原理二、實(shí)驗(yàn)原理三、實(shí)驗(yàn)用品三、實(shí)驗(yàn)用品（一）器材（一）器材顯微鏡、恒溫水浴鍋、解剖盤、剪刀、鑷顯微鏡、恒溫水浴鍋、解剖盤、剪刀、鑷子、雙面刀片、載玻片、凹面載玻片、蓋子、雙面刀片、載玻片、凹面載玻片、蓋玻片、表面皿、吸管、牙簽、吸水紙等。玻片、表面皿、吸管、牙簽、吸水紙等。（二）試劑（二）試劑1 1、Ringer Ringer 溶液溶液 氯化鈉氯化鈉0.85g0.85g（變溫動(dòng)物用（變溫動(dòng)物用0.65g0.65g） ；氯化鉀；氯化鉀 0.25g 0.25g ； 氯化鈣氯化鈣 0.03g 0.03g ；蒸餾水；蒸餾水100ml100ml

8、2 2、10%10%、1/30001/3000中性紅溶液中性紅溶液 稱取稱取0.50.5中性紅溶于中性紅溶于50ml Ringer50ml Ringer溶液，稍加熱（溶液，稍加熱（30403040度）使之很快溶解，用濾紙過濾，裝入棕色瓶于暗處保度）使之很快溶解，用濾紙過濾，裝入棕色瓶于暗處保存，否則易氧化沉淀，失去染色能力。存，否則易氧化沉淀，失去染色能力。 臨用前，取已配制的臨用前，取已配制的1%1%中性紅溶液中性紅溶液1ml1ml，加入，加入29ml 29ml RingerRinger溶液混勻，裝入棕色瓶備用。溶液混勻，裝入棕色瓶備用。31%1%、1/50001/5000詹姆斯綠詹姆斯綠B

9、 B溶液溶液 稱取稱取50mg50mg詹姆斯綠詹姆斯綠B B溶于溶于5ml Ringer5ml Ringer溶液中，稍加溶液中，稍加 微微熱（熱（30403040度）使之溶解，用濾紙過濾后，即為度）使之溶解，用濾紙過濾后，即為1%1%原液。原液。取取1%1%原液原液1ml1ml加入加入49ml Ringer49ml Ringer溶液，即成溶液，即成1/50001/5000工作液，工作液，裝入瓶中備用。最好現(xiàn)用現(xiàn)配，以保持它的充分氧化能裝入瓶中備用。最好現(xiàn)用現(xiàn)配，以保持它的充分氧化能力。力。 （三）材料（三）材料n人口腔上皮細(xì)胞人口腔上皮細(xì)胞n洋蔥鱗莖內(nèi)表皮細(xì)胞洋蔥鱗莖內(nèi)表皮細(xì)胞n黃豆幼根根尖黃

10、豆幼根根尖四、實(shí)驗(yàn)步驟四、實(shí)驗(yàn)步驟（一）線粒體的超活染色與觀察（一）線粒體的超活染色與觀察1 1、線粒體是細(xì)胞進(jìn)行呼吸作用的場所，其形態(tài)和、線粒體是細(xì)胞進(jìn)行呼吸作用的場所，其形態(tài)和數(shù)量雖不同物種、不同組織器官和不同的生理數(shù)量雖不同物種、不同組織器官和不同的生理狀態(tài)而發(fā)生變化。狀態(tài)而發(fā)生變化。1 1）人口腔粘膜上皮細(xì)胞線粒體的超活染色與觀察）人口腔粘膜上皮細(xì)胞線粒體的超活染色與觀察 取清潔載玻片放在取清潔載玻片放在3737恒溫水浴鍋的金屬板恒溫水浴鍋的金屬板上，滴上，滴2 2滴滴1/50001/5000詹納斯綠詹納斯綠B B染液。染液。實(shí)驗(yàn)者用牙簽寬頭在自己口腔頰部粘膜處稍用實(shí)驗(yàn)者用牙簽寬頭在自

11、己口腔頰部粘膜處稍用力刮取上皮細(xì)胞，將第一次刮下的粘液狀物洗力刮取上皮細(xì)胞，將第一次刮下的粘液狀物洗去，將第二次刮下的粘液狀物放入載玻片的染液去，將第二次刮下的粘液狀物放入載玻片的染液滴中，染色滴中，染色101015min15min（注意不可使染液干燥，（注意不可使染液干燥，必要時(shí)可再加滴染液），蓋上蓋玻片，用吸水紙必要時(shí)可再加滴染液），蓋上蓋玻片，用吸水紙吸去四周溢出的染液，置顯微鏡下觀察。吸去四周溢出的染液，置顯微鏡下觀察。在低倍鏡下，選擇平展的口腔上皮細(xì)胞，換高在低倍鏡下，選擇平展的口腔上皮細(xì)胞，換高倍鏡或油鏡進(jìn)行觀察?？梢姳馄綘钌掀ぜ?xì)胞的核倍鏡或油鏡進(jìn)行觀察?？梢姳馄綘钌掀ぜ?xì)胞的核周圍

12、胞質(zhì)中分布著一些被染成藍(lán)綠色的顆粒狀或周圍胞質(zhì)中分布著一些被染成藍(lán)綠色的顆粒狀或短棒狀的結(jié)構(gòu)，即線粒體。短棒狀的結(jié)構(gòu)，即線粒體。 四、實(shí)驗(yàn)步驟四、實(shí)驗(yàn)步驟口腔頰部上皮細(xì)胞示線粒體口腔頰部上皮細(xì)胞示線粒體 2 2）植物細(xì)胞線粒體的活體染色與觀察）植物細(xì)胞線粒體的活體染色與觀察（洋蔥鱗莖內(nèi)表皮細(xì)胞）（洋蔥鱗莖內(nèi)表皮細(xì)胞）用吸管吸取用吸管吸取1/50001/5000詹納斯綠詹納斯綠B B染液，滴一滴在干染液，滴一滴在干凈的載波片上，然后用鑷子撕取洋蔥鱗莖內(nèi)表凈的載波片上，然后用鑷子撕取洋蔥鱗莖內(nèi)表皮一小塊，置于染液中，染色皮一小塊，置于染液中，染色101015min15min。吸去染液，加一滴吸去染

13、液，加一滴Ringer Ringer 液，注意使洋蔥內(nèi)表液，注意使洋蔥內(nèi)表皮展平，蓋上蓋片，顯微鏡觀察。皮展平，蓋上蓋片，顯微鏡觀察。在高倍鏡下，可見表皮細(xì)胞中央被一大液泡所在高倍鏡下，可見表皮細(xì)胞中央被一大液泡所占據(jù)，細(xì)胞核被擠至旁邊，在其周圍有線粒體占據(jù)，細(xì)胞核被擠至旁邊，在其周圍有線粒體被染成藍(lán)綠色，呈顆粒狀或線條狀。仔細(xì)觀察被染成藍(lán)綠色，呈顆粒狀或線條狀。仔細(xì)觀察細(xì)胞質(zhì)中線粒體的形態(tài)、數(shù)目和分布。細(xì)胞質(zhì)中線粒體的形態(tài)、數(shù)目和分布。 二、液泡系的超活染色與觀察二、液泡系的超活染色與觀察 中性紅為弱堿性染料，對(duì)液泡系（即高中性紅為弱堿性染料，對(duì)液泡系（即高爾基體）的染色有專一性，只將活細(xì)胞

14、中的爾基體）的染色有專一性，只將活細(xì)胞中的液泡系染成紅色，細(xì)胞核與細(xì)胞質(zhì)完全不著液泡系染成紅色，細(xì)胞核與細(xì)胞質(zhì)完全不著色，這可能是與液泡中某些蛋白質(zhì)有關(guān)。色，這可能是與液泡中某些蛋白質(zhì)有關(guān)。小麥或黃豆根尖細(xì)胞液泡系的中性紅染色小麥或黃豆根尖細(xì)胞液泡系的中性紅染色觀察觀察實(shí)驗(yàn)前，把黃豆培養(yǎng)在培養(yǎng)皿內(nèi)潮濕的濾紙上，使其實(shí)驗(yàn)前，把黃豆培養(yǎng)在培養(yǎng)皿內(nèi)潮濕的濾紙上，使其發(fā)芽，胚根生長到發(fā)芽，胚根生長到1 1以上備用。以上備用。 用雙面刀片把黃豆幼苗根尖（約用雙面刀片把黃豆幼苗根尖（約1 12cm2cm長）小心切一長）小心切一縱切面，放入載玻片上的縱切面，放入載玻片上的1/30001/3000中性紅染液滴

15、中，染色中性紅染液滴中，染色5 510min10min。吸去染液，滴一滴吸去染液，滴一滴RingerRinger液，蓋上蓋玻片，并用鑷子液，蓋上蓋玻片，并用鑷子輕輕地下壓蓋玻片，使根尖壓扁，利于觀察。輕輕地下壓蓋玻片，使根尖壓扁，利于觀察。在高倍鏡下，先觀察根尖部分的生長點(diǎn)的細(xì)胞，可見在高倍鏡下，先觀察根尖部分的生長點(diǎn)的細(xì)胞，可見細(xì)胞質(zhì)中散在很多大小不等的染成玫瑰紅色的圓形小泡，細(xì)胞質(zhì)中散在很多大小不等的染成玫瑰紅色的圓形小泡，這是初生的幼小液泡。然后，由生長點(diǎn)向延長區(qū)觀察，這是初生的幼小液泡。然后，由生長點(diǎn)向延長區(qū)觀察，在一些已分化長大的細(xì)胞內(nèi)，液泡的染色較淺，體積增在一些已分化長大的細(xì)胞內(nèi)

16、，液泡的染色較淺，體積增大，數(shù)目變少。在成熟區(qū)細(xì)胞中，一般只有一個(gè)淡紅色大，數(shù)目變少。在成熟區(qū)細(xì)胞中，一般只有一個(gè)淡紅色的巨大液泡，占據(jù)細(xì)胞的絕大部分空間，將細(xì)胞核擠到的巨大液泡，占據(jù)細(xì)胞的絕大部分空間，將細(xì)胞核擠到細(xì)胞一側(cè)貼近細(xì)胞壁處。細(xì)胞一側(cè)貼近細(xì)胞壁處。 黃豆根尖細(xì)胞液泡系的中性紅染色觀察黃豆根尖細(xì)胞液泡系的中性紅染色觀察 五實(shí)驗(yàn)結(jié)果五實(shí)驗(yàn)結(jié)果 1.1.在人口腔粘膜上皮細(xì)胞制片中，可見扁平狀上在人口腔粘膜上皮細(xì)胞制片中，可見扁平狀上皮細(xì)胞的核周圍胞質(zhì)中分布著一些被染成藍(lán)綠皮細(xì)胞的核周圍胞質(zhì)中分布著一些被染成藍(lán)綠色的顆粒狀或短棒狀的結(jié)構(gòu)，即線粒體。色的顆粒狀或短棒狀的結(jié)構(gòu)，即線粒體。2.

17、2. 在洋蔥鱗莖內(nèi)表皮細(xì)胞制片中，可見表皮細(xì)胞在洋蔥鱗莖內(nèi)表皮細(xì)胞制片中，可見表皮細(xì)胞中央被一大液泡所占據(jù)，細(xì)胞核被擠至旁邊，中央被一大液泡所占據(jù)，細(xì)胞核被擠至旁邊，在其周圍有線粒體被染成藍(lán)綠色，呈顆粒狀或在其周圍有線粒體被染成藍(lán)綠色，呈顆粒狀或線條狀。線條狀。3. 3. 在蟾蜍胸骨劍突軟骨細(xì)胞制片中，可見軟骨細(xì)在蟾蜍胸骨劍突軟骨細(xì)胞制片中，可見軟骨細(xì)胞為橢圓形，細(xì)胞核及核仁清楚易見，在細(xì)胞胞為橢圓形，細(xì)胞核及核仁清楚易見，在細(xì)胞核的上方胞質(zhì)中，有許多被染成玫瑰紅色大小核的上方胞質(zhì)中，有許多被染成玫瑰紅色大小不一的泡狀體。不一的泡狀體。（示（示線粒體線粒體）2009年攝于新大生科院數(shù)碼互動(dòng)顯微

18、鏡室年攝于新大生科院數(shù)碼互動(dòng)顯微鏡室 4. 4. 在黃豆根尖細(xì)胞制片中，可見細(xì)胞質(zhì)中在黃豆根尖細(xì)胞制片中，可見細(xì)胞質(zhì)中散在很多大小不等的染成玫瑰紅色的圓形散在很多大小不等的染成玫瑰紅色的圓形小泡，這是初生的幼小液泡。然后，由生小泡，這是初生的幼小液泡。然后，由生長點(diǎn)向延長區(qū)觀察，在一些已分化長大的長點(diǎn)向延長區(qū)觀察，在一些已分化長大的細(xì)胞內(nèi)，液泡的染色較淺，體積增大，數(shù)細(xì)胞內(nèi)，液泡的染色較淺，體積增大，數(shù)目變少。在成熟區(qū)細(xì)胞中，一般只有一個(gè)目變少。在成熟區(qū)細(xì)胞中，一般只有一個(gè)淡紅色的巨大液泡，占據(jù)細(xì)胞的絕大部分淡紅色的巨大液泡，占據(jù)細(xì)胞的絕大部分空間，將細(xì)胞核擠到細(xì)胞一側(cè)貼近細(xì)胞壁空間，將細(xì)胞核擠到細(xì)胞一側(cè)貼近細(xì)胞壁處。處。 五實(shí)驗(yàn)結(jié)果五實(shí)驗(yàn)結(jié)果 黃豆根尖細(xì)胞液泡系的中性紅染色觀察黃豆根尖細(xì)胞液泡系的中性紅染色觀察小麥根尖液泡系（小麥根