院感細(xì)菌培養(yǎng)操作

1、1. 目的: 醫(yī)院是病原微生物較集中 , 抵抗力低的人群密集的地方 , 加之化療、 放療等手段的采用，影響病人免疫機(jī)能下降，大量使用抗生素，引起耐藥菌株增多，菌群失調(diào)，以及先進(jìn)醫(yī)療儀器廣泛應(yīng)用等原因， 增加消毒滅菌的難度， 致使院內(nèi)感染已成為當(dāng)前醫(yī)療實(shí)踐的嚴(yán)重障礙， 直接影響醫(yī)療效果。進(jìn)一步規(guī)范院內(nèi)感染監(jiān)測(cè)標(biāo)本的程序， 更好、更快檢測(cè)病原微生物的生長(zhǎng)情況，預(yù)防醫(yī)院感染的發(fā)生。2. 設(shè)備、試劑與材料2.1 VITEK 2 compact 鑒定藥敏分析系統(tǒng)2.2 VITEK 32 鑒定藥敏分析系統(tǒng)2.3 美國(guó) FORMA 級(jí)生物安全柜2.4 顯微鏡2.5 酒精燈2.6 接種環(huán)2.7 恒溫培養(yǎng)箱2.

2、8 各種培養(yǎng)基2.9 革蘭氏染色液2.10 觸酶試劑2.11 氧化酶試劑2.12 移液器2.13 無(wú)菌吸嘴3. 院感標(biāo)本采集31 空氣的采樣311 采樣時(shí)間 選擇消毒處理后與進(jìn)行醫(yī)療活動(dòng)之前期間采樣。312 采樣高度 與地面垂直高度 80-150CM。313 布點(diǎn)方法 室內(nèi)面積 30m2，設(shè)一條對(duì)角線上取三點(diǎn)，即中心一點(diǎn)，兩端各距墻 1m處各取一點(diǎn)；室內(nèi)面積 30m2，設(shè)東、西、南、北、中 5 點(diǎn)，其中東、西、南、北點(diǎn)均距墻1 m。314 采樣方法 用 9cm直徑普通營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板在采樣點(diǎn)暴露 5min 后送檢。32 物體表面采樣321 采樣時(shí)間 選擇消毒處理后 4 小時(shí)內(nèi)進(jìn)行采樣。2 2 23

3、22 采樣面積 被采表面 100cm，取全部表面；被采表面 100cm，則取 100cm。323 采樣方法 用 5×5 cm2 的標(biāo)準(zhǔn)來(lái)滅菌規(guī)格板，放在被檢物體表面，用無(wú)菌規(guī)格板，放在被檢物體表面， 用浸有無(wú)菌生理鹽水采樣液的棉拭子 1 支，在規(guī)格板內(nèi)橫豎往返各涂抹5 次，并隨之轉(zhuǎn)動(dòng)棉拭子，連續(xù)采樣 1-4 個(gè)規(guī)格板面積，剪支手接觸部位，將棉拭子放入裝10ml 采樣液的試管中送檢。門(mén)把手等小型物體則采用棉拭子直接涂抹物體的方法采樣。33 醫(yī)護(hù)人員手采樣331 采樣時(shí)間 在接觸病人、從事醫(yī)療活動(dòng)前進(jìn)行采樣。332 采樣面積及方法 被檢人五指并攏，將浸有無(wú)菌生理鹽水采樣液的棉拭子一枝在雙

4、手指曲面從指跟到指端來(lái)回涂擦各兩次（一只手涂擦面積 30 cm 2），并隨之轉(zhuǎn)動(dòng)采樣棉拭子，剪去手接觸部位， 將棉拭子放入裝有 10ml 采樣液的試管內(nèi)送檢。 采樣面積按平方厘米 （cm 2）計(jì)算。34 醫(yī)療用品采樣341 采樣時(shí)間 在消毒或滅菌處理后，存放有效期內(nèi)采樣。342 采樣方法 右用破壞性方法取樣的醫(yī)療用品，如輸液 （血）器、 注射器和注射針等，取其中的一部分放培養(yǎng)液中培養(yǎng)。 對(duì)不能用破壞性方法取樣的特殊醫(yī)療用品， 可用浸有無(wú)菌生理鹽水采樣液的棉拭子在被檢物體表面涂抹采樣，被采表面 100cm 2，取全部表面；被采表面 100cm 2，取 100cm2。35 使用中消毒劑的采集351

5、 采樣時(shí)間 采取使用中的消毒劑。352 采樣方法 在無(wú)菌條件下，用無(wú)菌注射器抽取 1ml 被檢樣品，加入 10ml 稀釋液混勻。（對(duì)于醇類(lèi)與酚類(lèi)消毒劑稀釋液用滅菌生長(zhǎng)鹽水；對(duì)于含氯消毒劑、含碘消毒劑、過(guò)氧化物消毒劑，需在滅菌生理鹽水中加入 0.1%硫代硫酸鈉；對(duì)于洗必泰、季銨鹽類(lèi)消毒劑，需在滅菌生理鹽水中加入 3 %（w/v）吐溫 80 和 0.3%卵磷脂；對(duì)于醛類(lèi)消毒劑，需在滅菌生理鹽水中加入 0.3%甘氨酸；對(duì)于含有表面活性劑的各種消毒劑，需在滅菌生理鹽水中加入3%（w/v）吐溫 80，以中和被檢樣液的殘效作用。 ）36 內(nèi)鏡的采樣361 咽喉鏡、支纖鏡 用 10ml 戊二醛中和液沖洗內(nèi)鏡

6、后，送檢實(shí)驗(yàn)室。362 胃鏡、消化鏡、宮腔鏡 用 10ml0.1%硫代硫酸鈉中和液沖洗內(nèi)鏡后，送檢實(shí)驗(yàn)室。363 鼻咽鏡、過(guò)氧化氫消毒的腔鏡類(lèi) 用 10ml 生理鹽水中和液沖洗內(nèi)鏡后，送檢實(shí)驗(yàn)室。37 透析液的采樣 用滅菌的空試管取透析液 10ml 送檢。4. 院感標(biāo)本的運(yùn)送及交接簽收41 標(biāo)本的采集411 空氣標(biāo)本的采集由臨床科室負(fù)責(zé)完成，標(biāo)本采集完畢，由臨床各科在規(guī)定的時(shí)間內(nèi)將標(biāo)本安全送回實(shí)驗(yàn)室。412 物體表面、醫(yī)務(wù)人員手、消毒劑、內(nèi)鏡等由院感科負(fù)責(zé)組織采樣，在規(guī)定時(shí)間內(nèi)將標(biāo)本安全送達(dá)實(shí)驗(yàn)室。42 采樣后必須盡快對(duì)樣品進(jìn)行相應(yīng)指標(biāo)的檢測(cè)，送檢時(shí)間不得超過(guò) 6 小時(shí)，若樣品保存于 0-4

7、條件時(shí)，送檢時(shí)間不得超過(guò) 24 小時(shí)。43 標(biāo)本收回實(shí)驗(yàn)室后 , 將標(biāo)本的信息登記在“院感監(jiān)測(cè)登記本”上。44 微生物室工作人員的驗(yàn)收 根據(jù)微生物室院感標(biāo)本拒收標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行檢查，對(duì)不符合要求的，將拒收，立即退回給送檢人員，指出問(wèn)題，告知標(biāo)本重取，所有拒收標(biāo)本均需在標(biāo)本拒收記錄本上登記。拒收情況如下：441 空氣培養(yǎng)平板數(shù)目擊者不正確（房間小于 30 平方米做 3 個(gè)平板培養(yǎng)，房間大于 30平方米做 5 個(gè)平板培養(yǎng)） 。442 未注明標(biāo)本采集科別、來(lái)源和培養(yǎng)目的。443 標(biāo)本明顯受污染。5. 檢測(cè)步驟 見(jiàn)本文件末面流程圖51 空氣標(biāo)本的檢測(cè)511 細(xì)菌室收到標(biāo)本后，將標(biāo)本編寫(xiě)當(dāng)日日期，用平板壓住驗(yàn)單

8、，直接放入 35培養(yǎng)箱培養(yǎng) 48 小時(shí)后，觀察結(jié)果。512 有菌生長(zhǎng)，則挑取可疑菌落進(jìn)行鑒定，排除金黃色葡萄球菌、溶血鏈球菌、銅綠假單胞菌等致病微生物的檢出。513 結(jié)果計(jì)算及菌落換算 空氣細(xì)菌菌落總數(shù)（ cfu/m3）=50000N/AT，式中 A平板面積， cm2；T平板暴露時(shí)間， min；N平均菌落數(shù)， cfu/ 平皿。即平皿上 1 個(gè)菌落等于空氣中菌落數(shù)為 157 cfu/m3 ，如果標(biāo)本為 3 個(gè)點(diǎn)時(shí)換算 =平皿上的菌落數(shù)× 157÷點(diǎn)數(shù)。52 物體表面樣本檢測(cè)521 細(xì)菌室收到標(biāo)本后，將標(biāo)本編號(hào)，振搖 80 次后，吸 500ul 于普通瓊脂平板中，把平板搖均勻，

9、放入 35培養(yǎng)箱培養(yǎng) 48 小時(shí)后，觀察結(jié)果。522 有菌生長(zhǎng)，則挑取可疑菌落進(jìn)行鑒定，排除金黃色葡萄球菌、溶血鏈球菌、銅綠假單胞菌等致病微生物的檢出，如為兒科、愛(ài)嬰?yún)^(qū)、新生兒科、兒科 ICU 的標(biāo)本時(shí)，還要排除沙門(mén)氏菌的檢出。523 結(jié)果計(jì)算及菌落換算 物體表面細(xì)菌菌落總數(shù)（ cfu/c m2 ）=平皿上菌落數(shù)×采樣液稀釋倍數(shù) （A）/ 采樣面積 （cm2）。采樣液稀釋倍數(shù)即是采集液總量與接種的采集液量之比值，2。即平皿上 1 個(gè)菌落等到于物體表面上菌落數(shù)為 0.2cfu/cm53 醫(yī)護(hù)人員手樣本檢測(cè)531 將標(biāo)本編號(hào)，振搖 80 次后，吸 500ul 于普通瓊脂平板中，如為兒科、

10、愛(ài)嬰?yún)^(qū)、新生兒科、兒科 ICU 的標(biāo)本時(shí)，加做一個(gè) HE平板，以監(jiān)測(cè)沙門(mén)氏菌的檢出。把平板搖均勻，放入 35培養(yǎng)箱培養(yǎng) 48 小時(shí)后，觀察結(jié)果。532 有菌生長(zhǎng)，則挑取可疑菌落進(jìn)行鑒定，排除金黃色葡萄球菌、溶血鏈球菌、銅綠假單胞菌等致病微生物的檢出。533 結(jié)果計(jì)算及菌落換算 手細(xì)菌菌落總數(shù)（ cfu/c m2）=平皿上菌落數(shù)×采樣液稀釋倍數(shù)（A）/30 ×2（cm 2），即平皿上 1 個(gè)菌落等到于物體表面上菌落數(shù)為 0.33cfu/cm2），即平皿上 1 個(gè)菌落等到于物體表面上菌落數(shù)為 0.33cfu/cm2。54 滅菌或一次性醫(yī)療用品樣本檢測(cè)541 樣本采集完成后，接種

11、于肉湯培養(yǎng)基，置 35培養(yǎng)箱培養(yǎng) 7 天，每天觀察一次，培養(yǎng)基有混濁則轉(zhuǎn)種普通平板繼續(xù)培養(yǎng)，觀察最后結(jié)果。542 有菌生長(zhǎng)，則挑取可疑菌落進(jìn)行鑒定，結(jié)果報(bào)告是否檢出細(xì)菌。55 使用中消毒劑551 細(xì)菌室收到標(biāo)本后，將標(biāo)本編號(hào)，振搖 80 次后，吸 500ul 于普通瓊脂平板中，如為兒科、愛(ài)嬰?yún)^(qū)、新生兒科、兒科 ICU 的標(biāo)本時(shí)，加做一個(gè) HE平板，以監(jiān)測(cè)沙門(mén)氏菌的檢出。把平板搖均勻，放入 35培養(yǎng)箱培養(yǎng) 48 小時(shí)后，觀察結(jié)果。另接種于 1 個(gè)沙保勞培養(yǎng)基，置 28培養(yǎng)箱培養(yǎng) 7 天，每天觀察一次，觀察最后結(jié)果。552 有菌生長(zhǎng)，則挑取可疑菌落進(jìn)行鑒定，結(jié)果報(bào)告是否檢出細(xì)菌及真菌。553 結(jié)果

12、計(jì)算及菌落換算 使用中消毒劑細(xì)菌菌落總數(shù)（ cfu/ ml ）=平皿上菌落平均數(shù)×采樣液稀釋倍數(shù) （A）/ 采樣體積（1ml），即平皿上 1 個(gè)菌落等于消毒劑中菌落數(shù)為 10 cfu/ml。56 滅菌效果監(jiān)測(cè)561 壓力蒸汽滅菌效果監(jiān)測(cè) 采用嗜熱脂肪芽胞桿菌菌片，放于溴甲酚紫蛋白胨水指示劑中，標(biāo)本送檢后，把里面的玻璃壓碎，置于 56培養(yǎng)箱培養(yǎng) 48 小時(shí)，如指示劑顏色為紫色，說(shuō)明無(wú)嗜熱脂肪芽胞桿菌生長(zhǎng)；如指示劑顏色為黃色則說(shuō)明有嗜熱脂肪芽胞桿菌生長(zhǎng)。562 氣體滅菌效果監(jiān)測(cè) 采用枯草芽胞桿菌菌片，放于溴甲酚紫蛋白胨水指示劑中，標(biāo)本送檢后， 置于 35培養(yǎng)箱培養(yǎng) 48 小時(shí)， 如指示劑

13、顏色為紫色， 說(shuō)明無(wú)枯草芽胞桿菌生長(zhǎng)；如指示劑顏色為黃色則說(shuō)明有芽枯草胞桿菌生長(zhǎng)。57 內(nèi)鏡標(biāo)本檢測(cè)571 將標(biāo)本編號(hào)，用旋渦器充分震蕩（振搖 80 次），取 0.5ml ，加入直徑 9CM的普通瓊脂平板上，把平板搖均勻，放入 35培養(yǎng)箱培養(yǎng) 48 小時(shí)后計(jì)數(shù)，觀察結(jié)果。572 有菌生長(zhǎng)，則挑取可疑菌落進(jìn)行鑒定，排除金黃色葡萄球菌、溶血鏈球菌、銅綠假單胞菌等致病微生物的檢出。573 結(jié)果計(jì)算及菌落換算 細(xì)菌菌落數(shù) / 鏡=平皿菌落數(shù)× 2058 透析液樣本檢測(cè)581 將標(biāo)本編號(hào)， 振搖 80 次后， 吸 200ul 于普通瓊脂平板中， 反平板搖均勻， 放入 35培養(yǎng)箱培養(yǎng) 48 小時(shí)

14、，觀察結(jié)果。582 有菌生長(zhǎng)，則挑取可疑菌落進(jìn)行鑒定，排除金黃色葡萄球菌， 、溶血鏈球菌、銅綠假單胞菌等致病微生物的檢出。583 結(jié)果計(jì)算：透析液細(xì)菌菌落總數(shù) =平皿菌落數(shù)× 56. 質(zhì)量控制61 做好培養(yǎng)基及樣本采集液的質(zhì)量控制，確保其無(wú)菌以及適宜于細(xì)菌的生長(zhǎng)。62 標(biāo)本采集嚴(yán)格按照采集要求進(jìn)行。63 做好培養(yǎng)箱的溫度控制。7. 各類(lèi)環(huán)境空氣、物體表面、醫(yī)護(hù)人員手細(xì)菌菌落總數(shù)衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)，見(jiàn)下表標(biāo)準(zhǔn)類(lèi)別 范圍 空氣 物體表面 醫(yī) 護(hù) 人員 手2 3 cfu/cm2cfu/m cfu/cm類(lèi) 層流潔凈手術(shù)室、層流潔凈病房 10 5 5類(lèi) 普通病房、產(chǎn)房、嬰兒室、早產(chǎn)兒 200 5 5室、

15、普通保護(hù)性隔離室、供應(yīng)室無(wú)菌室、燒傷病房、重癥監(jiān)護(hù)病房類(lèi) 兒科病房、 婦產(chǎn)科檢查室、 注射室、 500 10 10換藥室、治療室、供應(yīng)室清潔室、急診室、化驗(yàn)室、各類(lèi)普通病房和房間類(lèi) 傳染病科及病房 - 15 1572 致病性微生物 不得檢出金黃色葡萄球菌， 、溶血鏈球菌及其他致病性微生物。在可疑污染情況下進(jìn)行相應(yīng)指標(biāo)的檢測(cè)， 母嬰同室、早產(chǎn)兒室、嬰兒室、新生兒及兒科病房的物體表面和醫(yī)護(hù)人員手上，不得檢出沙門(mén)氏菌。73 醫(yī)療用品衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)731 進(jìn)入人體無(wú)菌組織、器官或接觸破損皮膚、粘膜的醫(yī)療用品必須無(wú)菌。732 接觸粘膜的醫(yī)療用品 細(xì)菌菌落總數(shù)應(yīng) 20cfu/g 或 100 cm2，致病性微生物

16、不得檢出。733 接觸皮膚的醫(yī)療用品 細(xì)菌菌落總數(shù)應(yīng) 200cfu/g 或 100 cm2，致病性微生物不得檢出。74 使用中消毒劑衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn) 使用中消毒劑：細(xì)菌菌落總數(shù)應(yīng) 100 cfu/ml ；致病性微生物不得檢出。75 內(nèi)鏡消毒后的衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn) 細(xì)菌菌落總數(shù)應(yīng) 20cfu/ 件；致病性微生物不得檢出。76 透析液消毒后的衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)761 入水口細(xì)菌菌落總數(shù)應(yīng) 200cfu/ml ；致病性微生物不得檢出。762 出水口細(xì)菌菌落總數(shù) 2000cfu/ml ；致病性微生物不得檢出。8. 院感標(biāo)本報(bào)告的錄入81 在電腦點(diǎn)擊“院感系統(tǒng)” ，進(jìn)入“院內(nèi)檢測(cè)” ，在“環(huán)境衛(wèi)生學(xué)及消毒滅菌效果監(jiān)測(cè)結(jié)果”中根據(jù)檢

17、測(cè)的結(jié)果輸入相關(guān)的項(xiàng)目。輸入抽檢科別、標(biāo)本類(lèi)別、抽檢項(xiàng)目、報(bào)告結(jié)果 /細(xì)菌總數(shù)、標(biāo)本單位、檢出細(xì)菌、送檢日期、報(bào)告日期、檢驗(yàn)者、院感受辦抽查、次數(shù)。結(jié)果輸完后按保存鍵， 審核無(wú)誤后按審核鍵。 按錄入鍵繼續(xù)下一標(biāo)本的錄入。 錄入完畢退出系統(tǒng)。82 陰性院內(nèi)感染監(jiān)測(cè)標(biāo)本的報(bào)告方式821 空氣、物體表面、消毒液、滅菌生物監(jiān)測(cè)菌片培養(yǎng)結(jié)果陰性發(fā)報(bào)告為“無(wú)菌生長(zhǎng)” 。822 無(wú)菌物品培養(yǎng)結(jié)果陰性發(fā)報(bào)告為“無(wú)細(xì)菌生長(zhǎng)” 。83 陽(yáng)性院內(nèi)感染監(jiān)測(cè)標(biāo)本的報(bào)告方式831 空氣培養(yǎng)結(jié)果陽(yáng)性發(fā)報(bào)告為“ XX cfu/m3”。832 物體表面培養(yǎng)結(jié)果陽(yáng)性發(fā)報(bào)告為“ XX cfu/cm2”。833 消毒液培養(yǎng)結(jié)果陽(yáng)性發(fā)報(bào)告為“ XX cfu/ml ”。834 生物監(jiān)測(cè)菌片培養(yǎng)結(jié)果陽(yáng)性發(fā)報(bào)告為“檢出枯草芽胞桿菌 / 嗜熱脂肪芽胞桿菌” 。835 無(wú)菌物品陽(yáng)性發(fā)報(bào)告為“檢出細(xì)菌” 。9. 參考文獻(xiàn)1 中華人民共和國(guó)衛(wèi)生部，制定，醫(yī)院感染管理文件匯編，附錄 A：采樣及檢查方法。2 任南，主編， 實(shí)用醫(yī)院感染監(jiān)測(cè)方法與技術(shù)，湖南，湖南科學(xué)技術(shù)出版社， 2008.3.院感標(biāo)本處理流程圖手、臺(tái)面、物表震蕩標(biāo)本約 20 秒，吸 500ul 到普通平板上置 35培養(yǎng)箱培養(yǎng) 48 小時(shí)后看結(jié)果消毒液培養(yǎng)震蕩標(biāo)本約 20 秒，吸 500ul 到普通平板上置 35培養(yǎng)箱培養(yǎng) 48 小時(shí)后看結(jié)果另吸 500ul 到沙