林千順-研究生學位論文開題報告(終)

1、研究生學位論文開題報告研 究 生： 林千順 學 號： 2013301110082 學 院： 植物科學技術學院 專 業(yè)： 作物遺傳育種 學位級別： 碩士 學位類型： 學術型 研究方向： 水稻雜種優(yōu)勢利用 課題名稱：分子標記輔助選擇改良水稻恢復系R666的褐飛虱抗性 導 師： 牟同敏教授 指導小組： 曾漢來教授 沈金雄教授 肖本澤副教授 聯(lián)系電-MAIL407167229入學年月2013年9月課題來源863計劃課題性質(zhì)縱向1、 摘要褐飛虱是水稻的重要害蟲之一，對水稻生產(chǎn)造成嚴重危害?；謴拖礡666是高度抗倒伏的優(yōu)良恢復系，為提高其對褐飛虱的抗性，便于培育更好的雜交水稻，本

2、研究利用分子標記輔助選擇技術，將抗褐飛虱基因Bph14和Bph15導入到R666的背景中，通過抗性鑒定，組合測配等，選育出優(yōu)質(zhì)、高產(chǎn)的兩系雜交水稻新組合。關鍵詞：水稻；褐飛虱；抗褐飛虱基因；分子標記輔助選擇二、立論依據(jù)（研究問題的由來，與選題有關的國內(nèi)外研究綜述，選題的目的與意義，擬解決的關鍵問題）1 選題的目的與意義褐飛虱是水稻的主要蟲害之一，每年對我國南方稻區(qū)的水稻生產(chǎn)造成嚴重的危害。兩系法雜交稻是我國南方秈稻產(chǎn)區(qū)的主要栽培類型之一。R666是安徽華韻生物科技有限公司選育的抗倒伏兩系雜交水稻恢復系，所配組合Y58S/R666表現(xiàn)抗倒伏、優(yōu)質(zhì)、高產(chǎn)，但是不抗褐飛虱。本研究的目標是，運用分子標

3、記輔助選擇技術，通過雜交、回交和表型選擇，將抗褐飛虱基因Bph14和Bph15導入到R666的背景中，期望培育出基本保持R666原有特性、同時褐飛虱抗性明顯提高的新恢復系，再通過組合測配，培育抗褐飛虱的兩系雜交水稻新組合。其意義在于提高水稻的褐飛虱抗性，減少農(nóng)藥使用量，保護環(huán)境。2 國內(nèi)外研究進展水稻是人類的重要糧食作物之一，同時也是我國的第一大糧食作物,約占糧食總產(chǎn)量的40%。在中國，從事稻作生產(chǎn)的農(nóng)戶接近農(nóng)戶總數(shù)的50%，全國有60%以上的人口以稻米為主食。除食用外，稻米還有多種用途。水稻生產(chǎn)不僅擔負確保我國糧食安全的重任，還肩負實現(xiàn)種糧增效、稻農(nóng)增收和全面推進新農(nóng)村建設的重大使命。預計到

4、2030年，我國人口將達到16億，我國農(nóng)作物的單產(chǎn)需在現(xiàn)有的基礎上提高60 %以上才能滿足糧食的安全供給。蟲害歷來是影響水稻生產(chǎn)的一個重要因素，每年因為蟲害而造成的含量損失高達15%左右，對我國的糧食生產(chǎn)產(chǎn)生重大影響。目前，對水稻害蟲的防治措施主要以施用化學農(nóng)藥為主，但化學農(nóng)藥的使用，不僅增加了生產(chǎn)成本，降低生產(chǎn)收益，更造成了環(huán)境污染，農(nóng)藥殘留等，對生態(tài)平衡嚴重破壞。因此，水稻蟲害生物防治的方法日益得到重視，其中，培育抗蟲品種是控制水稻蟲害，降低生產(chǎn)損害的最經(jīng)濟有效的手段。水稻作為遭受蟲害最多的糧食作物，在各個生育期均可受到害蟲侵害。同時，水稻害蟲種類繁多，有鉆蛀莖桿的二化螟、三化螟，刺吸、銼

5、吸莖葉的褐飛虱、白背飛虱、灰飛虱，食害葉片的稻縱卷葉螟等（張啟發(fā) 2010）。而在蟲害中，褐飛虱的危害尤為嚴重。就近30年褐飛虱發(fā)生情況而言，其發(fā)生面積及范圍逐漸擴大，暴發(fā)頻率增加，危害程度增加，造成嚴重損失。所以選育優(yōu)質(zhì)抗褐飛虱水稻品種十分重要。2.1褐飛虱的生物特性褐飛虱屬同翅目、飛虱科，有遠距離遷飛習性，為單食性害蟲，只能在栽培稻和普通野生稻上取食與繁殖后代。褐飛虱的生命周期分為卵、若蟲、成蟲三個時期(祝莉莉等 2004)。褐飛虱的卵主要產(chǎn)在葉脈和葉片組織內(nèi)，排列成一條，稱為“卵條”。卵粒長1.0mm，寬0.22mm，初產(chǎn)時乳白色，漸變褐色，并出現(xiàn)紅色眼點，同時初產(chǎn)及前期香蕉形，中后期彎

6、曲程度更加明顯。若蟲階段分為5個時期：1-5齡，體長卵圓形，體色分深淺兩種，深色型腹部背面斑紋暗褐色，淺色型體淡黃色，背面斑紋不明顯，其中2-3齡若蟲危害最大。成蟲分為短翅型和長翅型，短翅型翅長短于腹部，繁育能力強，壽命長；長翅型翅長長于腹部，有較強的遷飛能力，能借助風力向周圍擴散，對更多的稻區(qū)產(chǎn)生危害（程遐年等 2003）。褐飛虱生育的最適溫度是2228，相對濕度80%以上。盛夏不熱、晚秋不涼，涼夏暖秋、多雨濕潤是褐飛虱種群增殖和危害的有利條件。夏季日最高溫度33.5，或日平均溫度30對褐飛虱有抑制作用，高溫持續(xù)時間越長抑制作用越強。但在稻田中因水稻群體生長量大，植株下部的株間溫度比大氣溫度

7、低3左右，相應地，稻田生存的褐飛虱種群在大氣溫度更高的條件下才受抑制。而秋季日平均溫度低于17.5，嚴重影響褐飛虱的生存和為害（楊榮明 2014）。2.2褐飛虱的生物型由于昆蟲與寄主植物的協(xié)同進化，害蟲種群分化為不同的生物型。褐飛虱的生物型是指具有不同致害性的褐飛虱群體，當它們?yōu)楹哂胁煌瓜x基因的水稻品種時，表現(xiàn)出不同的致害反應。根據(jù)褐飛虱種群對具有不同抗性基因的標準鑒定品種的致害性反應, 已有、及Mindano6等種生物型被國際水稻研究所正式命名, 以后陸續(xù)又在菲律賓的棉蘭老島、孟加拉、印度、尼泊爾、澳大利亞以及越南的九龍江等地發(fā)現(xiàn)新的褐飛虱致害種群。除以上這些危害水稻的生物型外, 198

8、4年在菲律賓和印度尼西亞還發(fā)現(xiàn)一種能危害李氏禾而不能危害水稻的褐飛虱種群,稱之為李氏禾生物型（周亦紅等 2003）。在東亞地區(qū)主要以、四種褐飛虱生物型為主。生物型不能危害具有任何抗蟲基因的水稻品種；生物型可以危害具Bph1抗蟲基因的品種，但不能危害具Bph2抗蟲基因的品種；生物型可以危害具bph2抗蟲基因的水稻品種；生物型可以同時危害具Bph1抗蟲基因和bph2抗蟲基岡的水稻品種（張啟發(fā) 2010）。研究發(fā)現(xiàn)，不同稻區(qū)由于水稻品種的不同，其褐飛虱的生物型也差異較大。就我國而言，上個世紀80年代，褐飛虱群體主要以生物型為主，但進入90年代后逐漸轉化為生物型，各地褐飛虱群體為生物型、的混合型（巫國

9、瑞等 1983）。21世紀以來，在褐飛虱致害類型的鑒定中發(fā)現(xiàn)，其生物型由、的混合型逐漸轉化為生物型（呂麗萍等 2009）。關于褐飛虱生物型問題長期存在爭論，主要圍繞其生物型是否存在穩(wěn)定的遺傳性(姜人春 1999；周亦紅等 2003)。肖英方等（1997）將在抗性品種Mudgo上長期飼養(yǎng)的生物型接回感蟲品種上，連續(xù)培養(yǎng)8代以后，該群體轉變成了生物型。王桂榮等（1999）將在ASD7上連續(xù)飼養(yǎng)30代的褐飛虱種群(生物型)飼養(yǎng)于TN1 上，飼養(yǎng)7代以后，該種群就不再能適應ASD7，表現(xiàn)出不能致害的特性。研究結果表明，褐飛虱生物型的致害性經(jīng)品種“誘導”后可發(fā)生明顯變異，而且褐飛虱在抗性水稻品種上的適應

10、性的增加是一個漸進的過程，世代間表現(xiàn)出可遺傳的積累（呂亮等 2011）。褐飛虱生物型的形成是一個非常復雜的過程，不僅受其生物學特性的影響，還受到抗性水稻品種的脅迫，以及環(huán)境因素的影響，隨著研究的進一步廣泛和深入，褐飛虱致害性的分子遺傳學機制, 品種抗性及品種-害蟲互作機制等亟待深入研究。2.3褐飛虱對水稻的危害褐飛虱作為水稻的主要害蟲，對水稻生產(chǎn)產(chǎn)生嚴重危害，其危害行為主要有以下三種：一是產(chǎn)卵為害。褐飛虱在稻株葉鞘等莖葉組織中產(chǎn)卵，形成大量傷口，使水分由傷口散失，同時破壞輸導組織，同化作用減弱，導致稻株葉片發(fā)黃，易倒癱。二是刺吸取食危害。褐飛虱成蟲、若蟲群集于稻叢基部，刺吸莖葉組織汁液，消耗稻

11、株養(yǎng)分，使谷粒不飽滿，千粒重減輕，癟谷串增加，刺吸取食時分泌的凝固性唾液形成“口針鞘”，阻礙稻株體內(nèi)水分和養(yǎng)分輸導。蟲量多、受害重時引起稻株下部變黑、腐爛發(fā)臭、癱瘓倒狀，稱為“冒穿”、“透天”，導致嚴重減產(chǎn)或失收。三是傳播水稻病害。褐飛虱在刺吸水稻時，會傳播草狀叢矮病和齒葉矮縮?。▍呛蜕?1994），導致水稻植株矮小，嚴重影響水稻生產(chǎn)，降低水稻產(chǎn)量。褐飛虱在刺吸或產(chǎn)卵時，在水稻表皮組織產(chǎn)生傷口，此時水稻紋枯病、小球菌核病病菌通過傷口感染致病。同時，褐飛虱排泄的“蜜露”富含糖類、氨基酸等，為煤煙球菌提供滋生環(huán)境。1991 年我國褐飛虱為害發(fā)生面積達到2320萬hm2,損失稻166萬t;2005

12、年更是大暴發(fā), 為近十年之最, 僅長江中下游稻區(qū)就發(fā)生面積777.8萬hm2 ,損失稻谷近15億kg（傅強和張志濤 2005）。就褐飛虱為害對產(chǎn)量結構的影響，有學者的研究發(fā)現(xiàn)，褐飛虱在抽穗期、乳熟期、灌漿期對水稻為害會使總產(chǎn)量明顯下降, 但以抽穗期的作用最明顯。說明在同等蟲口密度下, 受害期越早, 損失越重。而對于實粒數(shù)的下降，抽穗期和乳熟期兩個生育期褐飛虱連續(xù)為害的影響較強。對于千粒重下降，主要受灌漿期為害的影響。但水稻各生育期之間存在明顯的互作效應。抽穗期和乳熟期對千粒重的影響除直接效應外, 還通過對灌漿能力的影響降低千粒重。同時也說明抽穗和乳熟期降低結實率并不能提高千粒重, 說明水稻生育

13、后期的補償效應不大（黃方能和程遐年1990；郝樹廣等 1997）。2.4水稻抗褐飛虱基因的研究進展為降低褐飛虱為害對水稻產(chǎn)量的影響，在水稻生產(chǎn)中，通常會采用化學藥劑的噴灑，但此手段嚴重污染環(huán)境，不利于可持續(xù)發(fā)展，同時使生產(chǎn)成本增加。因此，培育抗褐飛虱水稻品種才是從根本上解決褐飛虱為害難題。作物的抗蟲性是一種可遺傳特性，可以由單基因調(diào)控，也可以由多基因調(diào)控。就水稻抗褐飛虱基因而言，20世紀70年代初，關于水稻抗褐飛虱基因的研究已出現(xiàn)，在通過多種遺傳學方法的不斷測定中，目前，經(jīng)國際注冊確認和報道的水稻抗褐飛虱基因共30個，顯性基因有17個，隱性基因13個，其中已定位的主效抗性基因達到26個。這些已

14、定位的基因分別分布在2、3、4、6、8、12號染色體，其中2號染色體上有1個，3號染色體上有4個，4號染色體上有9個，6號染色體上有3個，8號染色體上有1個，12號染色體上有8個。Athwal等（1971）在CO22, IR747B2-6, MTU15, Mudgo等供體材料中，鑒定了首個抗褐飛虱顯性基因Bph1，同時發(fā)現(xiàn)品種ASD7的褐飛虱抗性受單一隱性基因控制，并命名為bph2，且Bph1和bph2緊密連鎖。Sharma等（2002）精確地將Bph1定位到第12 染色體上兩標記em5814 和R2708 之間的5.8 cM 內(nèi)，孫立宏等（2006）利用簡單序列重復標記將bph2定位至第12

15、 染色體上RM7102 和RM463 之間，其遺傳距離分別為7.6 cM和7.2 cM。Lakshminarayana 等（1977）在來自斯里蘭卡的栽培品種Rathu Heenati和Babawee中分別鑒定出顯性基因Bph3 和隱性基因bph4；Jairin（2010）等通過研究，將Bph3和bph4定位在水稻第6染色體短臂上的同一區(qū)間內(nèi)，同時確定Bph3和bph4等位或緊密連鎖。Klush等（1985）在ARC10550中發(fā)現(xiàn)新的隱性基因，命名為bph5。Kabis等（1988）在Swaranalatha品種中發(fā)現(xiàn)新的顯性基因，命名為Bph6，在T12品種中發(fā)現(xiàn)新的隱性基因bph7?；?/p>

16、bph5，Bph6，bph7均只對生物型表達抗性，其中Qiu等（2010）利用STS標記將Bph6精細定位在第4染色體上Y19和Y9之間大約25kb的區(qū)間內(nèi)。Nemoto 等（1989）研究發(fā)現(xiàn)Chinsaba品種對褐飛虱的抗性受新隱性基因bph8的控制，而斯里蘭卡農(nóng)家品種Kaharamana的抗性則由另一個顯性抗性基因Bph9 控制。其中，Bph9被定位于第12號染色體上RM463和RM5341之間，分別相距6.8cM和9.7cM（蘇昌潮等 2006）。Ishii等（1994）從帶有澳洲野生稻背景的基因滲入系IR65482-4-136-2-2中鑒定出一對新的顯性抗性基因，命名為Bph10，并

17、定位在第12染色體上，與RG457相距3.68cM。Hirabayashi（1999）從藥用野生稻中鑒定出兩個新的隱性基因bph11和bph12，其中將bph11定位于第3染色體長臂上，與G1318相距12.4cM，bph12定位于第4染色體的G271和R93之間，遺傳距離分別為2.4cM 和4cM。Yang等（2002）在闊葉野生稻中發(fā)現(xiàn)顯性基因Bph12(t)，并將其定位于第4染色體上C946和RM261之間，和RM261之間距離為1.8cM。Renganayaki 等（2002）也發(fā)現(xiàn)，源自藥用野生稻的一對新基因對生物型具有抗性，命名為Bph13(t)，并利用重組自交系( RILs) 和

18、RAPD 標記將其定位到第3染色體上。但與之不同的是，劉國慶等（2001）在緊穗野生稻發(fā)現(xiàn)一對顯性主效基因,位于第2染色體,在兩個微衛(wèi)星標記RM240和RM250之間,遺傳距離分別為6.1和5.5cM,暫時定名為Bph13(t)，對生物型、表達抗性。Huang等（2001）從帶有藥用野生稻背景的基因滲入系B5中鑒定了兩個新的顯性抗性基因，并運用RFLP技術，采用集團分離分析法將其中一個命名為Bph14(原名Qbp1)的基因定位于第3 染色體的G1318和R1925之間，2個分子標記相距3.2cM，另一個命名為Bph15(原名Qbp2)的基因定位于第4染色體的C820和S11182之間，2個分子

19、標記相距1.2cM。Sun等（2005）通過連鎖作圖和QTL分析發(fā)現(xiàn)"Rathu Heenati"攜帶抗褐飛虱的主效基因Bph17，并將其定位到4號染色體短臂上，與2個SSR標記RM8213和RM5953的遺傳距離分別為3.6cM和3.2cM。Jena等（2006）從帶有澳洲野生稻遺傳背景的基因滲入系IR65482-7-216-1-2中鑒定出一對與Bph10不等位的新抗性基因Bph18(t)，定位在第12染色體長臂末端的兩標記RM463和S15552之間。Chen等（2006）在秈稻品種AS20-1中發(fā)現(xiàn)抗褐飛虱隱性主效基因bph19(t)，并將bph19(t)精細定位到水

20、稻第3染色體上標記RM6308和RM3134之間約60kb的區(qū)間內(nèi)，兩標記的遺傳距離約1cM。另外，Li等（2006）從1200余份普通野生稻 Griff種質(zhì)中編號2183的種質(zhì)存在2對隱性抗性基因，分別定位于4號染色體和12號染色體上，這兩對基因很可能是新發(fā)現(xiàn)的基因，也暫命名為bph18(t)和bph19(t)，bph18(t)被定位在水稻4號染色體上RM6506和RM273之間，遺傳距離分別為11.0cM和6.0cM，bph19(t)被定位在水稻12號染色體上距RM17標記16.7cM的位置。Rahman等（2009）在小粒野生稻中發(fā)現(xiàn)了抗水稻褐飛虱的主效QTLBph20(t)和

21、Bph21(t)，并將Bph20(t)定位在水稻第4染色體短臂上193.4kb的區(qū)間內(nèi)，將Bph21(t)定位在水稻第12染色體長臂上194.0 kb 的區(qū)間內(nèi)。侯麗媛等（2010）在海南普通野生稻中檢測到2個隱性褐飛虱抗性QTL,，暫命名為bph22(t)和bph23(t)，并將bph22(t)定位在第4染色體上RM8212和RM261之間，將bph23(t)定位在第8染色體RM2655和RM3572之間。Bph24(t)同樣來自與野生稻中，但目前并未被定位（RAM et al 2010）。Yara等（2010）在ADR52中鑒定了Bph25(t)和Bph26(t)，并分別定位于第6染色體和

22、第8染色體上。He等（2012）在栽培品種Balamawee中鑒定出Bph27(t)，并將其精細定位在第4染色體上標記Q52和Q20之間,約63Kb的區(qū)間內(nèi)。在所有的已定位褐飛虱抗性基因中，只有Bph14已被克隆。Bph14 cDNA 全長9576bp，包含有3個外顯子，編碼一個由1323氨基酸組成的蛋白產(chǎn)物，產(chǎn)物包含卷曲螺旋結構域、核苷酸結合結構域和富亮氨酸重復序列。Bph14在水稻的根、葉片和葉鞘的維管束中表達，而這些部位正是褐飛虱的攝食部位。Bph14不是通過排拒作用而是通過抗生作用來發(fā)揮抗稻飛虱的作用（范峰峰等 2014）。含Bph14基因的水稻在褐飛虱侵染后能激活水楊酸信號

23、傳導通路，誘導韌皮部細胞的胼胝質(zhì)沉積以及胰蛋白酶抑制劑的產(chǎn)生，從而降低褐飛虱的取食、生長速率和壽命（Bo等 2009）。2.5水稻抗褐飛虱基因的利用1973年，國際水稻研究所首次推出含抗褐飛虱基因Bph1的品種，后在1976年推出含bph2的抗性品種，有效的遏制了褐飛虱的大爆發(fā)，大大降低了水稻生產(chǎn)損失，但在種植多年后，這些品種的抗性消失，褐飛虱為害再次大爆發(fā)，農(nóng)業(yè)生產(chǎn)受到嚴重影響。我國自上個世紀70年代以來，也同樣育成了一系列的含抗褐飛虱基因的抗性品種，并在推廣生產(chǎn)中有效地抑制了褐飛虱的為害。同時，在常規(guī)育種的基礎上，采用分子標記輔助選擇等技術有目的地進行抗性基因的聚合，從而選育出更持久有效的

24、抗性品種。胡杰等（2010）通過MAS技術將抗褐飛虱基因Bph14、Bph15 同時導入到汕優(yōu)63的親本明恢63、珍汕97B中，以改良汕優(yōu)63的褐飛虱抗性。李進波等（2006）以藥用野生稻滲入系B5為供體親本，以9311、1826 為受體親本，獲得了目標基因Bph14、Bph15純合的穩(wěn)定株系。孫榮科等（2009）以攜帶bph2、Bph3 的水稻品系ME1為供體親本與雜交稻親本進行雜交、回交和自交，結合分子標記輔助選擇，成功獲得了雙基因純合的株系。就目前來看，抗褐飛虱品種選育的重點應是利用分子標記輔助選擇等技術，有效的將多抗性基因聚合，培育多抗性基因聚合品種。三、研究內(nèi)容（對擬開展的研究工作分

25、層次進行詳盡的描述）1、以攜帶褐飛虱抗性基因Bph14和Bph15的材料B5和華15為供體親本，分別與R666進行1次雜交、3次回交和2-3次自交，每個世代用分子標記對Bph14和Bph15基因進行檢測、同時進行農(nóng)藝性狀的表型選擇，培育主要農(nóng)藝性狀與R666相似、同時攜帶Bph14和Bph15基因的株系；2、將選育出的新株系進行褐飛虱抗性鑒定，選擇褐飛虱抗性3級（即抗級）的株系；3、 將抗褐飛虱的新株系與不育系Y58S等不育系進行組合測配，將配制的組合進行褐飛虱抗性和產(chǎn)量優(yōu)勢鑒定以及生育期、主要農(nóng)藝性狀、稻米品質(zhì)等的分析，選擇褐飛虱抗性強、產(chǎn)量高、稻米品質(zhì)優(yōu)、生育期適宜、主要農(nóng)藝性狀優(yōu)良的雜交

26、組合；4、在不同世代選擇攜帶Bph14和Bph15基因、表型不同于R666的單株，創(chuàng)建新的抗褐飛虱恢復系材料；5、以攜帶Pi2基因的抗稻瘟病材料YAQ10242與攜帶Bph14和Bph15基因的株系雜交，通過基因聚合創(chuàng)建同時抗褐飛虱和稻瘟病的新恢復系材料。四、研究對象（試驗材料）、研究方法（試驗方法）與技術路線1、試驗材料受體親本R666，由安徽華韻生物科技有限公司提供；攜帶Bph14和Bph15基因的褐飛虱抗性供體親B5由武漢大學提供、華15由華中農(nóng)業(yè)大學作物遺傳改良國家重點實驗室提供；攜帶Pi2基因的稻瘟病抗性親本YAQ10242是本課題前期創(chuàng)建的中間育種材料。2、研究方法2.1 分子標記

27、輔助選擇2011年3月在海南以R666為母本，分別與B5、華15和YAQ10242雜交，并獲得F1雜交種子；2011年5月在武漢種植雜種F1，經(jīng)分子檢測后，8月將真雜種與R666回交，獲得BC1F1的種子；2011年11月在海南種植BC1F1，經(jīng)分子檢測后，2012年3月選擇攜帶目標基因的單株與R666進行第二次回交，獲得BC2F1的種子；2012年5月在武漢種植BC2F1，經(jīng)分子檢測后，8月選擇攜帶目標基因的單株與R666進行第三次回交，獲得BC3F1的種子；2012年11月海南種植BC3F1，經(jīng)分子檢測后，3月選擇表型與R666相似、攜帶目標基因的單株自交，收獲BC3F2種子；2013年5

28、月種植BC3F2分離群體（此前工作由王笑見完成）。2013年8月本人接收以上材料，經(jīng)分子檢測后，9月選擇表型與R666相似、攜帶目標基因純合的單株，收獲BC3F3種子；2013年11月海南種植BC3F3家系，2014年3月繼續(xù)選擇單株，同時進行組合測配。2014年5月武漢種植BC3F4株系，苗期進行分子檢測，選擇目標基因純合的株系與Y58S等不育系配組。采用CTAB法提取DNA樣品用于實驗室分子標記檢測，具體步驟：水稻移栽后，取幼嫩葉尖2-3cm置于2ml離心管中，加入800l 1.5×CTAB、鋼珠，用Tissuelyser高通量研磨機研磨；后置于65恒溫水浴30min以上；取出后

29、加入與CTAB等體積的氯仿/異戊醇（241）混合液，置于搖床振蕩10-15min至下層液相深綠色止；后放入離心機中以10000rmp轉速離心5min，至上層溶液澄清，再提取400450l上清液于1.5ml滅菌離心管中，加入1ml預冷95%乙醇，搖勻置于-20環(huán)境靜置30min以上；后放入離心機中以12000rmp轉速離心8min，倒去離心管內(nèi)液體，用75%乙醇浸洗沉淀約10min，過夜自然干燥；最后加入100l滅菌純水溶解備用。 PCR反應體系總體積為20l，其組成為：DNA模板2l，滅菌水13.6l，dNTP(5mM) 1.8l，Buffer(10×) (Mg2+ plus) 2l

30、，正反引物各0.24l，rTaq酶0.12l，擴增前加入18l礦物油，用來保護反應體系。擴增程序：95預變性5min；然后每個循環(huán)：變性：94，30s，退火：55，30s，延伸：72，45s。循環(huán)數(shù) 35次，72延伸7min，25保溫。PCR產(chǎn)物在4%聚丙烯酰胺凝膠（PAGE）電泳中分離，后經(jīng)硝酸銀溶液、NaOH溶液染色顯影。用于分子標記選擇的引物如下：基因引物名稱引物序列(5-3)PCR擴增產(chǎn)物大小bp參考文獻Bph1476-2-FCTGCTGCTGCTCTCGTATTG170武漢大學提供76-2-RCAGGGAAGCTCCAAGAACAGRM5665-FCAAACCACTGTGAGTACG

31、GC180武漢大學提供RM5665-RTTCTCACTTTGCTGTCAGCGBph1515-6-FAGGTGAAGCTGATGTGCTTG175武漢大學提供15-6-RCGATACTTATTGCAACACACMS5-FTTGTGGGTCCTCATCTCCTC215武漢大學提供MS5-RTGACAACTTTGTGCAAGATCAAA2.2 褐飛虱抗性鑒定2014年5月初，將海南選擇的BC3F4株系和測配的部分組合在武漢播種，進行褐飛虱抗性鑒定。2015年，將BC3F6株系和測配的部分組合再次進行褐飛虱抗性鑒定，選擇褐飛虱抗性在抗級以上，農(nóng)藝性狀優(yōu)良的株系和組合。主要采用在苗期進行褐飛虱抗性鑒定

32、：每個待鑒定的材料準備30粒種子，浸種24小時后在30條件下催芽48小時，同時將浸泡后的泥土裝在邊長7cm、高8cm、底部4個小孔的方形小塑料盒中，泥土深度6.5cm。將催芽的種子均勻播種在方形小塑料盒泥土表面，覆蓋細土，每個小方盒播種1個材料，并插上標簽。然后將方形小塑料盒放置在長50cm、寬35cm、高8cm的大塑料盒中，每個大塑料盒放置35個方形小塑料盒中，將大塑料盒灌滿水。以抗褐飛虱的供體親本B5作抗蟲對照、以TN1和受體親本作感蟲對照，每個大塑料盒設置2套對照品種，均勻地放置在鑒定樣品中。待秧苗生長到3葉期，進行間苗，保持每個小方盒中有12-15株健康的秧苗，用飼養(yǎng)好的2-3齡褐飛虱

33、若蟲進行人工接蟲，平均每株秧苗接蟲10-12頭。評價方法分為單株觀察和集團觀察兩種方法。單株觀察方法是：在2盆TN1都全部死亡時一次性觀察，評價標準見表1-2，記錄每棵秧苗的抗級，以平均值表示該材料的抗性表現(xiàn)水平。集團鑒定法是：當2個感蟲對照TN1的死亡率達到95%時，記載鑒定材料的抗性反應，連續(xù)記載3天以上，直到TN1完全死亡為止，評價標準見表3。以連續(xù)記載的最高級別評價材料的抗性反應。表1 褐飛虱抗性單株評價記載方法抗性分數(shù)秧苗植株癥狀0植株健康，未受到傷害11葉片輕微發(fā)黃31-2片發(fā)黃或1片葉萎縮51-2片葉萎縮或1片葉枯萎73-4片葉萎縮或2-4片葉枯萎，但植株仍是活的9植株死亡表2

34、褐飛虱抗性單株評價平均數(shù)評價標準抗性分數(shù)抗性水平00.9免疫I1.01.9高抗HR2.03.9抗R4.05.9中抗MR6.07.9中感MS8.09.0高感HS表3 褐飛虱抗性苗期集團評價標準抗性分數(shù)癥狀抗性水平0沒有為害免疫I1非常輕的為害高抗HR3大部分植株的第1-2片葉部分發(fā)黃抗R5植株明顯發(fā)黃和矮縮，或10-25%的植株枯萎或死亡和其他植株嚴重矮縮或即將死亡中抗MR7一半以上植株死亡中感MS9全部植株死亡高感S2.3 組合測配和優(yōu)勢鑒定2014-2015年分別在海南和武漢對測配的每個組合，種植30苗，密度5×6寸（16.7×20cm），2次重復，以Y58S/R666和

35、湖北省區(qū)試對照組合作對照，進行產(chǎn)量、生育期、品質(zhì)和主要農(nóng)藝性狀鑒定，選擇與對照相似或更優(yōu)的組合。 2.4 農(nóng)藝性狀考察每個種植季節(jié)對所有材料記載見穗期（第一個稻穗抽出）、始穗期（10%稻穗抽出）、抽穗期（50%稻穗抽出）、齊穗期（80%稻穗抽出）和成熟期（80%稻谷成熟），計算播始歷期（播種的第二天到始穗的天數(shù)），并與對照進行比較。成熟時每個材料取樣3株，考察株高、有效穗數(shù)、平均穗長、每穗總粒數(shù)、每穗實粒數(shù)、結實率、千粒重和單株產(chǎn)量等8個主要農(nóng)藝性狀。為了比較準確地測定產(chǎn)量，將取樣后的小區(qū)混合收割、脫粒、曬干和稱重，再加上取樣單株的重量為小區(qū)的總產(chǎn)量，將總產(chǎn)量除以小區(qū)有效株數(shù)，計算小區(qū)的平均單

36、株產(chǎn)量。2.5 稻米品質(zhì)分析按照國家優(yōu)質(zhì)稻谷標準（GB/T17891-1999）測定方法，對育成株系、雜交組合及對照組合進行稻米品種分析。使用BLH-3250礱谷機和JMNJ-3精白機測定糙米率、精米率及整精米率，使用JMWT12大米外觀品質(zhì)檢測儀分析測定堊白粒率、堊白度、粒長及長寬比，最后將米粒打成米粉后過120目篩子，測定糊化溫度、膠稠度及直鏈淀粉含量。3、技術路線近等基因系創(chuàng)建新株系和聚合株系創(chuàng)建近等基因系創(chuàng)建R666/B5(或華15) R666/YAQ10242F1 F2F2 F1R666/F1 R666/F1BC1F1 BC1F2BC1F2 BC1F1R666/BC1F1MF1R66

37、6/BC1F1 R666/BC2F1MF2R666/BC2F1BC3F1MF3BC3F1BC3F2MF4BC3F2BC3F3BC3F4BC3F5BC3F6MF5MF6MF7BC3F3BC3F4BC3F5BC3F6組合測配、稻瘟病抗性鑒定，產(chǎn)量、生育期、農(nóng)藝性狀和稻米品質(zhì)等的評價4、可能存在的問題及應對措施1）選出的株系可能表型與受體親本有差異。這樣的株系將作為新材料使用。2）選出的株系，表型與受體將作為新材料使用。3）如果褐飛虱抗性沒有明顯提高或者不親本相似，但配合力不一樣。也能達到中抗以上、但表現(xiàn)表現(xiàn)優(yōu)良的株系，將用具有抗性的不育系進行配組。五、工作基礎和已有進展1)利用Bph14，Bph1

38、5的SSR引物多態(tài)性分析和分子標記的輔助選擇，篩選出了基因純和的株系，并進行褐飛虱抗性鑒定。2)將獲得的Bph14和Bph15雙基因純和的株系進行海南配組計劃，海南加代繁殖選擇農(nóng)藝性狀好的陽性單株。 六、計劃研究進度1、2013.8-10：進實驗室學習基本的試驗技術；2、2013.11-2014.1：海南播種、取樣分子檢測；3、2014.2-4：海南選擇單株和組合測配；4、2014.5-10：武漢播種、分子檢測、單株選擇、組合測配、褐飛虱抗性鑒定；5、2014.11-2015.4：海南播種、組合優(yōu)勢鑒定、繼續(xù)組合測配；6、2015.5-10：武漢播種、組合優(yōu)勢鑒定、株系農(nóng)藝性狀考察、稻米品質(zhì)分

39、析，繼續(xù)進行褐飛虱抗性鑒定；7、2015.11-2016.2：數(shù)據(jù)整理；8、2016.3-6：論文寫作、畢業(yè)答辯。七、預期目標及本研究創(chuàng)新之處1、選育出褐飛虱抗性明顯提高、表型和配合力與R666相似的恢復系株系2-4個；2、篩選出褐飛虱抗性明顯提高，產(chǎn)量、生育期、稻米品質(zhì)、主要農(nóng)藝性狀與Y58S/R666相似的組合1個；3、創(chuàng)建抗褐飛虱或多抗的恢復系新材料若干份；4、篩選出褐飛虱中抗以上、產(chǎn)量比區(qū)試對照組合顯著提高、稻米品質(zhì)優(yōu)的苗頭組合1-2個。八、主要參考文獻1. 傅強，張志濤.2005年稻飛虱暴發(fā)情況、成災原因及2006年控制對策A.中國科學技術協(xié)會,2006:42. 郝樹廣,程遐年,羅躍

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