完整版核酸檢測(cè)試劑生產(chǎn)及質(zhì)量控制技術(shù)指導(dǎo)原則

1、附件3:體外診斷試劑生產(chǎn)及質(zhì)量控制技術(shù)指導(dǎo)原則-核酸檢測(cè)試劑生產(chǎn)及質(zhì)量控制技術(shù)指導(dǎo)原則核酸擴(kuò)增檢測(cè)技術(shù)泛指以擴(kuò)增 DNA或RNA為手段，從而篩查特 定基因的檢測(cè)技術(shù)，如聚合酶鏈反應(yīng)（PCR、連接酶鏈反應(yīng)（LCR、 轉(zhuǎn)錄依賴的擴(kuò)增反應(yīng)（TMA）等。核酸檢測(cè)試劑是基于核酸擴(kuò)增檢測(cè) 技術(shù)的體外診斷試劑，目前已經(jīng)用于病原體檢測(cè)、特定疾病的早期診 斷和體內(nèi)物質(zhì)的型別鑒定等不同領(lǐng)域。為規(guī)范核酸檢測(cè)試劑的生產(chǎn)及 質(zhì)量控制，特制定本技術(shù)指導(dǎo)原則。國(guó)家藥品監(jiān)督管理部門將依據(jù)科 學(xué)技術(shù)發(fā)展的需要，適時(shí)組織修訂。一、基本要求（一）核酸類檢測(cè)試劑生產(chǎn)用的各種原料、輔料等應(yīng)制定其相應(yīng) 的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，并應(yīng)符合有關(guān)法規(guī)的要求

2、。（二）核酸類檢測(cè)試劑的生產(chǎn)企業(yè)應(yīng)具備相應(yīng)的專業(yè)技術(shù)人員、 儀器設(shè)備以及適宜的生產(chǎn)環(huán)境（實(shí)驗(yàn)室應(yīng)當(dāng)嚴(yán)格分區(qū)，人員和物品應(yīng) 當(dāng)單向流動(dòng)，以最大限度地防止實(shí)驗(yàn)過(guò)程中樣品之間的污染和避免擴(kuò) 增產(chǎn)物的污染），獲得醫(yī)療器械生產(chǎn)許可證；同時(shí)，應(yīng)按照體外 診斷試劑生產(chǎn)實(shí)施細(xì)則（試行）的要求建立相應(yīng)的質(zhì)量管理體系， 形成文件和記錄，加以實(shí)施并保持有效運(yùn)行；還應(yīng)通過(guò)體外診斷試 劑生產(chǎn)企業(yè)質(zhì)量管理體系考核評(píng)定標(biāo)準(zhǔn)（試行）的考核。企業(yè)應(yīng)對(duì) 試劑的使用范圍作出明確規(guī)定，并經(jīng)國(guó)家藥品管理部門批準(zhǔn)。（三）核酸類檢測(cè)試劑在研制時(shí)，應(yīng)當(dāng)遵循科學(xué)、規(guī)范的原則， 引物設(shè)計(jì)應(yīng)當(dāng)符合核酸檢測(cè)設(shè)計(jì)的要求，擴(kuò)增體系應(yīng)設(shè)定合理的內(nèi)標(biāo) 和外

3、標(biāo)，試劑須設(shè)置抗污染的特定措施，擴(kuò)增產(chǎn)物須進(jìn)行確證研究。（四）核酸類檢測(cè)試劑生產(chǎn)過(guò)程中所用的各種材料及工藝，應(yīng)充分考慮可能涉及的安全性方面的事宜。（五）生產(chǎn)和質(zhì)量控制的總體目標(biāo)：保證試劑使用安全、質(zhì)量穩(wěn) 定、工藝可控、檢測(cè)有效。二、原材料應(yīng)提供主要原材料如引物、探針、企業(yè)參考品或標(biāo)準(zhǔn)品等的選擇 與來(lái)源、制備過(guò)程、質(zhì)量分析和質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)等的相關(guān)研究資料。如果主 要原材料來(lái)自市場(chǎng)（從其他單位購(gòu)買），應(yīng)提供的資料包括：對(duì)物料 供應(yīng)商審核的相關(guān)資料、購(gòu)買合同、供貨方提供的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)、出廠檢 驗(yàn)報(bào)告，以及該原材料到貨后的質(zhì)量檢驗(yàn)資料。如果主要原材料（包 括工藝）或其供應(yīng)商有變更，應(yīng)依據(jù)國(guó)家相關(guān)法規(guī)的要求進(jìn)行變

4、更申 請(qǐng)。核酸類檢測(cè)試劑的包裝材料和耗材應(yīng)無(wú) DNase和RNase污染。1. dNTPs脫氧三磷酸核甘，核酸的組成成分，包括： dATR dUTR dGTR dCT可口 dTTR 應(yīng)為 HPLCM、PC顏，無(wú) DNase和 RNasW虧染。-20 C 保存。2. 引物由一定數(shù)量的核甘酸構(gòu)成的特定序列，通常采用DNA合成儀人工合成，合成后經(jīng)聚丙烯酰胺凝膠電泳或其他適宜方法純化凍干粉，合成量不低于試劑盒總測(cè)試樣品所需量。序列正確。純 度應(yīng)達(dá)到電泳級(jí)（PAGE或HPLCS,不含雜帶。應(yīng)提供合成機(jī)構(gòu)出 具的合成產(chǎn)物的質(zhì)檢證明，如 PAG曲泳結(jié)果或HPLC分析圖譜。應(yīng)作HPLC分析和紫外光吸收分析。以

5、紫外分光光度計(jì)測(cè)定 OD260nm/OD280nm的比值在1.6 2.0之間，可視為合格引物。-20 C 保存。3. 探針是指特定的帶有示蹤物（標(biāo)記物）的已知核酸片段（寡聚核甘酸 片段），能與互補(bǔ)核酸序列退火雜交，用于特定核酸序列的探測(cè)。通 常采用DNA合成儀人工合成，合成后經(jīng)聚丙烯酰胺凝膠電泳或其他 適宜方法純化，在5'-端標(biāo)記熒光素報(bào)告基團(tuán)或其他發(fā)光標(biāo)記物，在 3'-端標(biāo)記熒光素淬滅基團(tuán)，并經(jīng) HPLCK其他適宜方法純化。凍干粉，90D以上。純度應(yīng)達(dá)到HPLC純，不含雜帶。應(yīng)提供合 成機(jī)構(gòu)出具的合成產(chǎn)物的質(zhì)檢證明，如 HPLC分析圖譜；應(yīng)對(duì)探針的 核酸序列及標(biāo)記的熒光素或化

6、學(xué)發(fā)光物進(jìn)行核實(shí)，并作HPLC分析。應(yīng)以可見(jiàn)一紫外分光光度計(jì)進(jìn)行200 800nm掃描，在260nm處應(yīng)有 吸收峰。另外，根據(jù)標(biāo)記的熒光素的不同，還應(yīng)該在熒光素的激發(fā)波 長(zhǎng)處有吸收峰，如FAM熒光素在494nm、TET熒光素在521nm、TAMRA 熒光素在560nm處有特異的吸收峰，雜交探針在 493nm、625nm、 685nm處有特異的吸收峰，檢驗(yàn)合格后入庫(kù)。避光、-20C保存。4. Taq DN課合酶具有DNA聚合酶活性，無(wú)核酸內(nèi)切酶活性；具熱穩(wěn)定性，94C保溫1小時(shí)后仍保持50%活性。-20 C保存。5. UNG （尿喀咤糖基化酶）具有尿喀咤糖基化酶活性，無(wú)核酸外切酶及核酸內(nèi)切酶活性

7、，IUUNG在37c處理3分鐘后，103拷貝以下含U模版應(yīng)完全降解，不 能產(chǎn)生擴(kuò)增產(chǎn)物。-20 C保存。6. RT-PCfB （反轉(zhuǎn)錄擴(kuò)增酶）具逆轉(zhuǎn)錄酶活性和 DNA聚合酶活性，無(wú)核酸內(nèi)切酶活性；具熱 穩(wěn)定性，94 C 1小時(shí)后仍保持50%舌性，-20C保存。三、生產(chǎn)工藝核酸類檢測(cè)試劑的基本生產(chǎn)工藝通常包括： 配制工作液、半成品 檢驗(yàn)、分裝和包裝。配制工作液的各種原材料及其配比應(yīng)符合要求， 原材料應(yīng)混合均勻，配制過(guò)程應(yīng)對(duì) pH、電導(dǎo)率等關(guān)鍵參數(shù)進(jìn)行有效 控制。工藝研究的資料應(yīng)能對(duì)反應(yīng)體系涉及到的基本內(nèi)容如樣本類型、 樣本用量、試劑用量、反應(yīng)條件、校準(zhǔn)方法、質(zhì)控方法、臨界值的確 定、穩(wěn)定性和有效

8、期，提供確切的依據(jù)。四、質(zhì)量控制（一）半成品質(zhì)量控制1 .按批號(hào)抽取規(guī)定數(shù)量的半成品。2 .以參考品/對(duì)照品進(jìn)行半成品質(zhì)量控制。如果產(chǎn)品具有國(guó)家 標(biāo)準(zhǔn)品或參考品，應(yīng)以其進(jìn)行檢驗(yàn)。如果產(chǎn)品不具有國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)品或參考品，應(yīng)根據(jù)規(guī)定制備相應(yīng)的企業(yè)參考品進(jìn)行半成品檢驗(yàn)，企業(yè)參考品的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)不能低于國(guó)家藥品監(jiān)督管理部門已經(jīng)批準(zhǔn)的同類試劑 的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。3 .半成品檢驗(yàn)內(nèi)容包括：參考品符合率、靈敏度、特異性、精 密度。結(jié)果應(yīng)符合質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的要求。4 .半成品檢驗(yàn)合格后，按試劑盒組成及時(shí)進(jìn)行分裝和包裝。（二）成品質(zhì)量控制1 .每一批核酸類檢測(cè)試劑報(bào)批批量至少為 5000人份。2 .產(chǎn)品完成包裝后，應(yīng)根據(jù)生產(chǎn)量進(jìn)行抽樣和生產(chǎn)記錄審核。3 .以參考