外周血造血干細(xì)胞的檢測及凍存技術(shù)

1、外周血造血干細(xì)胞的檢測及凍存技術(shù)作者：斯曉明黃若宇黃穎王九花張亮 【關(guān)鍵詞】外周血干細(xì)胞 關(guān)鍵詞:外周血干細(xì)胞;檢測;凍存 0引言 化療是治療惡性腫瘤的有效方法1，2，自體外周血干細(xì)胞移植（APBSCT）治療實(shí)體瘤是技術(shù).利用流式細(xì)胞術(shù)（FACS）檢測采集的自體外周血干細(xì)胞（APBSC）中CD34+細(xì)胞及其亞群，對準(zhǔn)確及時判斷干/祖細(xì)胞數(shù)量有重要意義3，分離液的凍存更是APBSCT中的關(guān)鍵技術(shù).我們通過對臨床24例腫瘤患者APBSCT中干細(xì)胞的檢測及凍存技術(shù)的研究，制定標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)方法，穩(wěn)定臨床治療效果. 1對象和方法 1.1對象腫瘤患者24例，男13例，女11例;年齡2973（中位49）歲.腫瘤

2、類型:乳腺癌8例，肺癌9例，精原細(xì)胞癌2例，睪丸癌1例，喉癌1例，非霍奇金淋巴瘤1例，胰腺癌1例，卵巢癌1例.泰索帝（法國羅那普郎克.安樂公司產(chǎn)品），惠爾血（日本麒麟公司產(chǎn)品）.血細(xì)胞分離機(jī)為BCT-spectra（美國COBE公司），流式細(xì)胞儀為FACSCalibur（美國BD公司）CD34-PE熒光單克隆抗體（美國BD公司）. 1.2方法24例患者一次性靜滴泰索帝180200mg，710d白細(xì)胞降至1×109L-1，皮下注射重組人粒細(xì)胞集落刺激因子（rhG-CSF）惠爾血300g每日1次，連續(xù)使用34d，經(jīng)過動員后，外周血白細(xì)胞達(dá)到3×109L-1、血小板達(dá)到50

3、15;109L-1以上時，進(jìn)行外周血干細(xì)胞的采集（PBSCC），總循環(huán)血量800010000mL，采集時間為4h左右，最終采集物為100mL，24例患者都進(jìn)行2次PBSCC.經(jīng)血細(xì)胞分離機(jī)分離的細(xì)胞液，直接取樣進(jìn)行檢測，采用識別CD34分子類抗原表位581（Beckman-conter，Miami，F(xiàn)L）的單抗進(jìn)行標(biāo)記，用溶血法處理細(xì)胞液，細(xì)胞液與CD34-PE熒光單克隆抗體室溫暗處反應(yīng)20min，細(xì)胞裂解液溶解紅細(xì)胞，應(yīng)用流式細(xì)胞儀檢測CD34+細(xì)胞占所有白細(xì)胞的百分率.在超凈臺內(nèi)將分離出的細(xì)胞液加入一定比例的200gL-1白蛋白和cp-1（二甲基亞砜+羥乙基淀粉），混勻，分裝到冷藏袋內(nèi)，熱

4、合封口.冷藏袋平鋪在兩塊大小相同的有機(jī)玻璃板中間，兩板間隔1cm，用繃帶將其裹緊，使細(xì)胞液均勻地夾在兩板之間，水平地放置在-80冰箱里，注意保護(hù)好袋口的管子. 2結(jié)果 24例患者經(jīng)過2次采集，CD34+細(xì)胞總計(jì)都在2×106kg-1以上.經(jīng)過預(yù)處理后，白細(xì)胞降至0.1×109L-1血小板最低降至10×109L-1，開始回輸干細(xì)胞，9d后血象開始回升，12d左右白細(xì)胞數(shù)達(dá)到正常值，無1例發(fā)生意外. 3討論 取樣未加過cp-1的細(xì)胞液進(jìn)行CD34+細(xì)胞的檢測，因?yàn)閏p-1中的羥乙基淀粉在檢測時往往會堵塞流式細(xì)胞儀的針孔而失敗.在緩慢推入cp-1時，將裝有干細(xì)胞的袋子放

5、入冰水槽中不停搖動，cp-1與細(xì)胞液混合過程中，產(chǎn)生熱量，會對細(xì)胞功能造成損害.細(xì)胞液應(yīng)均勻地分布在冷藏袋內(nèi)，其體積不能超過容器容納能力的一半，在凍存/復(fù)蘇時可使細(xì)胞液全面均勻受凍/解凍.經(jīng)過80機(jī)械冰箱的儲存，冷藏袋既硬又脆，在拿取過程中要防止碰裂或碰斷暴露于有機(jī)玻璃板外的冷凍袋口的管子.總之我們的體會是只要注意上述事項(xiàng)，就可順利完成干細(xì)胞移植治療中的關(guān)鍵步驟而達(dá)到治療目的. 參考文獻(xiàn): 1侯麗宏，孫秉中，喬慶大.Gm-CSF對惡性血液病患者化療后骨髓造血抑制的治療作用J.第四軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報，1998;19（5）:584-585. 2陳江浩，王執(zhí)民，吳道澄.阿霉素脂質(zhì)體經(jīng)肝動脈給藥治療大鼠肝腫瘤J.第四軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報，1998;20（1）:51-52. 3韓曉