果糖和二硫蘇糖醇對(duì)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞凍存后活性及多能性的影響

1、www.CRTER.org鄭欣桐，等. 果糖和二硫蘇糖醇對(duì)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞凍存后活性及多能性的影響果糖和二硫蘇糖醇對(duì)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞凍存后活性及多能性的影響鄭欣桐，劉 欽，張璟霞，羅 慶，陳 哲，宋關(guān)斌(重慶大學(xué)，生物工程學(xué)院，生物流變科學(xué)與技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，重慶市 400044)引用本文：鄭欣桐，劉欽，張璟霞，羅慶，陳哲，宋關(guān)斌. 果糖和二硫蘇糖醇對(duì)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞凍存后活性及多能性的影響J.中國(guó)組織工程研究，2016，20(41):6085-6091.DOI: 10.3969/j.issn.2095-4344.2016.41.001 ORCID: 0000-0003-2511-5851

2、(鄭欣桐)文章快速閱讀：一種基于果糖及二硫蘇糖醇預(yù)處理的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞凍存方法鄭欣桐，女，1994年生，河北省邯鄲市人，漢族，2016年重慶大學(xué)畢業(yè)，主要從事分子生物學(xué)方向研究。通訊作者：宋關(guān)斌，博士，教授，重慶大學(xué)，生物工程學(xué)院，生物流變科學(xué)與技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，重慶市 400044中圖分類號(hào):R394.2文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼:A文章編號(hào):2095-4344(2016)41-06085-07稿件接受：2016-08-01MTTqPCR果糖及二硫蘇糖醇預(yù)處理細(xì)胞凍存骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞細(xì)胞復(fù)蘇干性標(biāo)志基因檢測(cè)成骨分化潛能檢測(cè)細(xì)胞活性檢測(cè)文題釋義：果糖和二硫蘇糖醇：果糖是一種常見的己酮糖，已有研究發(fā)現(xiàn)，果

3、糖預(yù)處理可以增加細(xì)胞堿性磷酸酶水平，提高凍存細(xì)胞的活性和能量狀態(tài)。二硫蘇糖醇是一種抗氧化物質(zhì)，可通過加速分解培養(yǎng)基中產(chǎn)生的H2O2防止細(xì)胞毒性，在細(xì)胞凍存中作為冷凍保護(hù)劑提高細(xì)胞的活性。低溫保存技術(shù)：是一種廣泛采用的長(zhǎng)時(shí)間保存生物樣本的方法。一般是將活的生物體采用特殊的方法冷卻至低溫(一般為-196 )，并長(zhǎng)期保存。待需要時(shí)，可將生物體按照特殊的方法加熱至正常溫度，仍可獲得存活的生物體。該方法是貯藏細(xì)胞及保存細(xì)胞特性的有效方法。摘要背景：凍存是保證干細(xì)胞臨床應(yīng)用的關(guān)鍵步驟之一，但現(xiàn)有凍存技術(shù)常導(dǎo)致細(xì)胞活性降低、多能性喪失及分化能力下降。目的：探究果糖及二硫蘇糖醇是否有助于維持凍存后骨髓間充質(zhì)干

4、細(xì)胞多能性及成骨分化潛能。方法：分離培養(yǎng)SD大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，在細(xì)胞凍存前分別用果糖(200 mol/L)，二硫蘇糖醇 (500 mol/L)及果糖(200 mol/L)+二硫蘇糖醇(500 mol/L)預(yù)處理1 h。凍存6個(gè)月后，復(fù)蘇細(xì)胞并用倒置顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)，MTT實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞活性，定量PCR檢測(cè)相關(guān)干性基因(Nanog，Oct4及Sox2)的表達(dá)，堿性磷酸酶活性測(cè)試及茜素紅染色檢測(cè)復(fù)蘇骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化能力。結(jié)果與結(jié)論：復(fù)蘇后各組細(xì)胞在形態(tài)上無明顯差別；果糖預(yù)處理及聯(lián)合預(yù)處理有助于骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞活性維持；二硫蘇糖醇預(yù)處理可顯著促進(jìn)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞多能性相關(guān)基因Nanog及

5、Sox2的表達(dá)；果糖、二硫蘇糖醇及聯(lián)合預(yù)處理皆有助于維持骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化潛能，但以二硫蘇糖醇及聯(lián)合預(yù)處理組效果最佳；結(jié)果表明，果糖預(yù)處理有助于維持凍存骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞活性，二硫蘇糖醇有助于維持凍存骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞多能性及成骨分化能力。關(guān)鍵詞：干細(xì)胞；骨髓干細(xì)胞；果糖；二硫蘇糖醇；骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞；細(xì)胞凍存；細(xì)胞活性；多能性；成骨分化；抗氧化主題詞：骨髓；間質(zhì)干細(xì)胞；冷凍；果糖；二硫蘇糖醇；組織工程3 P.O.Box 1200,Shenyang 110004 kf23385083Effect of fructose and dithiothreitol on cell viability

6、 and pluripotency of cryopreserved bone marrow mesenchymal stem cellsZheng Xin-tong, Liu Qin, Zhang Jing-xia, Luo Qing, Chen Zhe, Song Guan-bin (Key Laboratory of Biorheological Science and Technology, Ministry of Education, College of Bioengineering, Chongqing University, Chongqing 400044, China)Ab

7、stractBACKGROUND: Cell crypreservation is required for clinical use of stem cells, and the current process of cryopreservation however may be harmful to cell viability, pluripotency and differentiation capacity.OBJECTIVE: To explore the effect of fructose and dithiothreitol on pluripotency and osteo

8、genesis of cryopreserved bone marrow mesenchymal stem cells.METHODS: Bone marrow mesenchymal stem cells were isolated from the bone marrow of Sprague-Dawley rats and pretreated with fructose (200 mol/L), dithiothreitol (500 mol/L) or combined components before cry-preservation. Then the cells were c

9、ryopreseved for 6 months and the morphology of cells was observed by inverted microscopy. The cell viability was evaluated by MTT, and real-time PCR was used to detect the mRNA expression of Nanog, OCT4 and Sox2. Alkaline phophatase activity assay and alizarin red staining were utilized to detect th

10、e osteogenic capacity of bone marrow mesenchymal stem cells. RESULTS AND CONCLUSION: Images captured by inverted microscopy showed no significant difference in cell morphology between groups. The MTT results indicated that fructose and combined pretreatment could promote the cell viability of bone m

11、arrow mesenchymal stem cells after cryopreservation, while the real-time PCR results demonstrated that dithiothreitol significantly facilitated the expression of Naogo and Sox2 in bone marrow mesenchymal stem cells. Moreover, ALP activity assay and alizarin red staining confirmed the positive effect

12、s of fructose, dithiothreitol and combined pretreatment on osteogenic capacity of bone marrow mesenchymal stem cells after cryopreservation, and the best effects were found after pretreatment with dithiothreitol and combined components. Overall, these findings indicate that fructose pretreatment is

13、beneficial for cell viability of cryopreseved bone marrow mesenchymal stem cells, and dithiothreitol contributes to maintaining the pluripotency and osteogenesis capacity of cryopreseved bone marrow mesenchymal stem cells.Subject headings: Bone Marrow; Mesenchymal Stem Cells; Freezing; Fructose; Dit

14、hiothreitol; Tissue EngineeringCite this article: Zheng XT, Liu Q, Zhang JX, Luo Q, Chen Z, Song GB. Effect of fructose and dithiothreitol on cell viability and pluripotency of cryopreserved bone marrow mesenchymal stem cells. Zhongguo Zuzhi Gongcheng Yanjiu. 2016;20(41):6085-6091.Zheng Xin-tong, Ke

15、y Laboratory of Biorheological Science and Technology, Ministry of Education, College of Bioengineering, Chongqing University, Chongqing 400044, ChinaCorresponding author: Song Guan-bin, Doctor, Professor, Key Laboratory of Biorheological Science and Technology, Ministry of Education, College of Bio

16、engineering, Chongqing University, Chongqing 400044, China6089ISSN 2095-4344 CN 21-1581/R CODEN: ZLKHAH0 引言 Introduction骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞屬于中胚層的一類多能干細(xì)胞，在不同理化環(huán)境和細(xì)胞因子的誘導(dǎo)下，可向成骨、軟骨、脂肪和纖維細(xì)胞系等多方向分化1-2。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞具有易分離培養(yǎng)和體外擴(kuò)增、免疫原性弱、移植后不發(fā)生免疫排斥反應(yīng)和不涉及倫理等特點(diǎn)，是最具前景的組織工程種子細(xì)胞之一3-4。為廣泛開展骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞臨床治療，需長(zhǎng)期低溫保存骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞。如何在體外將骨髓間充質(zhì)干

17、細(xì)胞有效凍存，減少其冷凍損傷，是骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞臨床應(yīng)用的關(guān)鍵技術(shù)環(huán)節(jié)之一。細(xì)胞冷凍保存需要首先將細(xì)胞降溫，隨著溫度的下降，細(xì)胞內(nèi)外會(huì)結(jié)冰，所形成的冰晶會(huì)造成細(xì)胞膜和細(xì)胞器損傷5-8。如何最大限度提高冷凍復(fù)蘇后骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的細(xì)胞活性，并具有相當(dāng)?shù)脑鲋澈头只芰?，是目前仍需要解決的問題。細(xì)胞低溫凍存方法主要有2種，分別是慢速冷凍法及快速冷卻非晶態(tài)固化法(玻璃化法)9-11。玻璃化法雖然可在降溫過程中部分或者完全避免細(xì)胞內(nèi)外冰晶的形成，但其技術(shù)仍不成熟，諸多問題需要解決，例如玻璃化保護(hù)劑的選擇、反玻璃現(xiàn)象及低溫?cái)嗔驯苊獾?2-14。大多數(shù)慢速冷凍法的研究主要是探索最佳的冷凍速率、尋求高效低毒的

18、冷凍保護(hù)劑濃度和組合、凍存細(xì)胞的容器、復(fù)蘇方法等15-18，關(guān)于如何增強(qiáng)細(xì)胞抗冷凍損傷能力的研究較少。因此，實(shí)驗(yàn)擬對(duì)常規(guī)凍存體系進(jìn)行改進(jìn)，探究果糖及二硫蘇糖醇預(yù)處理是否有助于維持骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞凍存后的多能性及成骨分化潛能。1 材料和方法 Materials and methods 1.1 設(shè)計(jì) 細(xì)胞學(xué)體外實(shí)驗(yàn)。1.2 時(shí)間及地點(diǎn) 于2015年1至10月在重慶大學(xué)生物工程學(xué)院完成。1.3 材料1.3.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 雄性Sperague-Dawley(SD)大鼠6只，3周齡，體質(zhì)量150-200 g，SPF級(jí)，購(gòu)買于重慶醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心。1.3.2 主要試劑及設(shè)備 DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清、

19、胰蛋白酶(Gibco)；噻唑藍(lán)、RNA提取試劑盒、qPCR試劑盒(Bioteke)；地塞米松、維生素C、-甘油磷酸鈉、茜素紅S、果糖、二硫蘇糖醇(Sigma)；二甲基亞砜、堿性磷酸酶活檢測(cè)試劑盒(碧云天)；超凈工作臺(tái)(上海博訊實(shí)驗(yàn)有限公司)；細(xì)胞培養(yǎng)箱(Thermo fisher)；倒置顯微鏡(Olympus)；L530型低速常溫離心機(jī)(湖南湘儀)。1.4 實(shí)驗(yàn)方法1.4.1 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的分離培養(yǎng) 取SD大鼠，斷頸法處死，乙醇浸泡大鼠10 min。在超凈工作臺(tái)中提取大鼠后肢股骨和脛骨，去除周圍肌肉組織，用10 mL注射器吸取含體積分?jǐn)?shù)為10%胎牛血清的培養(yǎng)基，沖洗骨髓腔3-5次，輕輕吹打

20、培養(yǎng)基將細(xì)胞吹散，用移液槍吸取5 mL分別接種于2個(gè)25 cm2的細(xì)胞培養(yǎng)瓶， 24 h更換培養(yǎng)液1次，以后每2 d換液1次，待細(xì)胞生長(zhǎng)融合、鋪滿培養(yǎng)瓶底壁的80%-90%時(shí)，即可進(jìn)行傳代培養(yǎng)。1.4.2 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞預(yù)處理、凍存及復(fù)蘇預(yù)處理：取生長(zhǎng)良好的第2代大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，在超凈工作臺(tái)內(nèi)倒去舊的培養(yǎng)基，用移液管吸取少量PBS輕柔沖洗培養(yǎng)瓶底壁2遍，加入1 mL 0.25%胰蛋白酶-EDTA消化，加入5 mL完全培養(yǎng)基終止消化，并用滴管吹打制成單細(xì)胞懸液；用滴管將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)至1.5 mL離心管內(nèi)，置于離心機(jī)內(nèi)1 000 r/min離心 5 min，倒掉上清，分別加入完全培養(yǎng)基、完全

21、培養(yǎng)基+果糖(200 mol/L)、完全培養(yǎng)基+二硫蘇糖醇(500 mol/L)及完全培養(yǎng)基+果糖+二硫蘇糖醇，小心吹打制成細(xì)胞懸液，放置于孵箱預(yù)處理1 h。凍存：離心收集細(xì)胞，取剛配制好的含有10%二甲基亞砜及體積分?jǐn)?shù)為20%胎牛血清的培養(yǎng)基加入離心管內(nèi)，混勻并分裝至凍存管內(nèi)，用封口膜嚴(yán)格封口后，記號(hào)筆標(biāo)記凍存日期。將凍存管放入冰箱內(nèi)，4 保存10 min后轉(zhuǎn)入-20 保存30 min，轉(zhuǎn)至-80 冰箱內(nèi)隔夜，將含有骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的凍存管轉(zhuǎn)移入液氮罐中繼續(xù)保存，凍存時(shí)間為6個(gè)月。復(fù)蘇：從液氮罐取出凍存管，檢查凍存管蓋是否旋緊后，立即放入37 恒溫水浴箱快速解凍，復(fù)溫過程中輕輕搖冷凍管使其在

22、1 min內(nèi)全部融化解凍，用體積分?jǐn)?shù)為75%醫(yī)用乙醇擦拭凍存管，移入超凈工作臺(tái)繼續(xù)操作。用移液管將剛復(fù)蘇的細(xì)胞懸液移入離心管內(nèi)，離心去除上清，再用5 mL完全培養(yǎng)基制成細(xì)胞懸液并分裝至25 cm2的細(xì)胞培養(yǎng)瓶。1.4.3 細(xì)胞活性測(cè)定 將計(jì)數(shù)后的各組細(xì)胞懸液加入96孔板中，每孔5×103個(gè)細(xì)胞，待細(xì)胞貼壁24 h后，棄去96孔板內(nèi)培養(yǎng)基并用PBS清洗，加入含5 g/L MTT的DMEM培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)4 h，棄去培養(yǎng)液，加入100 L二甲基亞砜振蕩溶解結(jié)晶物。以630 nm為參照，測(cè)量570 nm處的吸光度，根據(jù)吸光度測(cè)定相對(duì)細(xì)胞活性。1.4.4 細(xì)胞多能性基因的檢測(cè) 分別收集各組細(xì)胞

23、，利用RNA提取試劑盒提取RNA并測(cè)濃度，A260/A280要求在1.8-2.0之間，利用反轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA合成為cDNA，通過實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀，在mRNA水平檢測(cè)Oct4、Sox2及Nanog 3種基因表達(dá)情況(引物見表1)，以GAPDH為內(nèi)參。循環(huán)程序采用兩步法：95 預(yù)變性 3 min，95 變性10 s，55 退火延伸30 s，反應(yīng)39個(gè)循環(huán)，每完成1次循環(huán)，采集1次熒光信號(hào)。表1 實(shí)時(shí)熒光PCR引物 Table 1 Primers for real-time PCR基因 引物序列 產(chǎn)物大小Oct4Sox2NanogGAPDH 5- CGA GGA GTC CCA GGA TAT

24、 GA-3 (F) 5- GGT TGT CTG GCT GAA CAC CT-3 (R)5- GTC AGC GCC CTG CAG TAC AA-3 (F)5- GCG AGT AGG ACA TGC TGT AGG TG-3(R)5- GCA AAG GTA CCT CAG CCT CCA-3 (F) 5- GTC AGG CCG TTG CTA GTC TTC A-3 (R)5- GGC ACA GTC AAG GCT GAG AAT G-3 (F)5- ATG GTG GTG AAG ACG CCA GTA-3 (R)151 bp82 bp150 bp143 bp1.4.5 成骨細(xì)胞

25、的誘導(dǎo) 取凍存6個(gè)月骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，復(fù)蘇后制成單細(xì)胞懸液，接種于6孔板內(nèi)(細(xì)胞數(shù)量1×105)，常規(guī)培養(yǎng)48 h后，換成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基(1×10-8 mol/L地塞米松、10 mmol/L -甘油磷酸鈉、50 mol/L抗壞血酸及含體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清的DMEM)，連續(xù)培養(yǎng)14 d，每隔3 d換液1次。1.4.6 堿性磷酸酶活性測(cè)定 成骨誘導(dǎo)至7 d，棄去培養(yǎng)液，PBS洗2次，室溫加0.2% Triton X-100裂解液1 h，倒置顯微鏡下觀察到細(xì)胞完全裂解后，利用堿性磷酸酶試劑盒檢測(cè)各組細(xì)胞堿性磷酸酶活性。1.4.7 茜素紅染色 成骨誘導(dǎo)至14 d，棄去培養(yǎng)液，PBS

26、洗2次，利用40 g/L多聚甲醛固定15 min，雙蒸水洗3次，0.1%茜素紅-Tris-HCl(pH 8.3)于37 下染色 30 min，棄去染色液，雙蒸水清洗3次，風(fēng)干，照相機(jī)拍照。1.5 主要觀察指標(biāo) 細(xì)胞活性；干性標(biāo)志基因mRNA相對(duì)表達(dá)量；堿性磷酸酶活性；鈣節(jié)點(diǎn)形成量。1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 使用SPSS 17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用±s表示，組間比較應(yīng)用方差分析，P < 0.05為差異有顯著性意義。2 結(jié)果 Results 2.1 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞復(fù)蘇后形態(tài)學(xué)觀察 復(fù)蘇細(xì)胞貼壁24 h后，倒置顯微鏡下觀察可見細(xì)胞仍呈長(zhǎng)梭態(tài)，符合骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞一般形態(tài)特征，見

27、圖1。進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)果糖、二硫蘇糖醇或果糖+二硫蘇糖醇聯(lián)合處理組細(xì)胞整體形態(tài)與對(duì)照組無明顯差別。2.2 復(fù)蘇骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞活性 利用MTT實(shí)驗(yàn)檢測(cè)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞凍存后細(xì)胞活性，結(jié)果顯示果糖或果糖+二硫蘇糖醇預(yù)處理有助于凍存后細(xì)胞活性維持，與對(duì)照組比較差異有顯著性意義，但保護(hù)程度有限。二硫蘇糖醇單獨(dú)預(yù)處理對(duì)凍存后細(xì)胞活性維持無明顯促進(jìn)作用，見圖2。2.3 復(fù)蘇骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞多能性基因表達(dá) 定量PCR結(jié)果顯示，二硫蘇糖醇預(yù)處理有助于骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞凍存后Nanog基因表達(dá)，而果糖預(yù)處理無明顯作用，見圖3A。果糖或二硫蘇糖醇預(yù)處理對(duì)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞凍存后Oct4基因的表達(dá)無顯著影響，見圖3B。二硫

28、蘇糖醇亦促進(jìn)了凍存骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞復(fù)蘇后Sox2基因的表達(dá)，見圖3C。2.4 復(fù)蘇骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化潛能 經(jīng)成骨誘導(dǎo)體系誘導(dǎo)7 d，檢測(cè)各組細(xì)胞堿性磷酸酶活性。與對(duì)照組相比，果糖、二硫蘇糖醇及果糖+二硫蘇糖醇預(yù)處理均可一定程度上調(diào)復(fù)蘇骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞堿性磷酸酶活性，其中果糖+二硫蘇糖醇預(yù)處理組效果最為明顯(P < 0.05)，見圖4。成骨誘導(dǎo)14 d時(shí)，茜素紅染色結(jié)果顯示，果糖、二硫蘇糖醇及果糖+二硫蘇糖醇預(yù)處理可明顯促進(jìn)鈣節(jié)點(diǎn)形成，體現(xiàn)為鈣節(jié)點(diǎn)數(shù)量增多、面積(團(tuán)塊狀)增大，其中二硫蘇糖醇及果糖+二硫蘇糖醇組尤為明顯，見圖5。因堿性磷酸酶活性及鈣節(jié)點(diǎn)分別是骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化的

29、早期及晚期標(biāo)志，故以上結(jié)果說明果糖+二硫蘇糖醇預(yù)處理可有效維持凍存骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化能力。3 討論 Discussion細(xì)胞凍存對(duì)各種細(xì)胞及組織都能引起破壞作用。細(xì)胞在凍存過程中經(jīng)歷包括液體溶液的固化過程和水分子通過細(xì)胞膜的滲透過程，在此過程中的溶液冰晶形成、生長(zhǎng)，高滲透壓和防凍劑都會(huì)對(duì)細(xì)胞造成損害19-20。已有研究亦證實(shí)隨著凍存時(shí)間的延長(zhǎng)，人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞活性會(huì)不斷降低21。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞作為成體干細(xì)胞，可分化為脂肪細(xì)胞、成骨細(xì)胞和肌細(xì)胞等多種細(xì)胞22。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞亦同時(shí)具有分泌多種細(xì)胞因子和參與免疫調(diào)節(jié)反應(yīng)的作用，因此常作為移植和治療的首選干細(xì)胞源性細(xì)胞23-24。果糖是一

30、種常見的己酮糖，已有研究發(fā)現(xiàn)，果糖預(yù)處理可以增加干細(xì)胞堿性磷酸酶水平，提高凍存干細(xì)胞的活性和能量狀態(tài)25。另有研究證實(shí)，二硫蘇糖醇是一種抗氧化物質(zhì)，可通過加速分解培養(yǎng)基中產(chǎn)生的H2O2防止細(xì)胞毒性，在干細(xì)胞凍存中作為冷凍保護(hù)劑提高干細(xì)胞的活性26。這些研究結(jié)果提示，果糖和二硫蘇糖醇對(duì)凍存細(xì)胞的活性和功能維持具有重要的保護(hù)作用。實(shí)驗(yàn)中采用果糖、二硫蘇糖醇及果糖+二硫蘇糖醇預(yù)處理骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞并凍存，復(fù)蘇后顯微拍照顯示細(xì)胞長(zhǎng)梭狀，并伴有漩渦生長(zhǎng)特點(diǎn)，符合一般骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞形態(tài)特征27，各組細(xì)胞形態(tài)無明顯變化。為進(jìn)一步探究各組細(xì)胞活性的差別，對(duì)復(fù)蘇骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞進(jìn)行MTT實(shí)驗(yàn)，結(jié)果顯示果糖及果

31、糖+二硫蘇糖醇聯(lián)合預(yù)處理皆促進(jìn)了骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞凍存后細(xì)胞活性，與對(duì)照組比較差異有顯著性意義，證實(shí)果糖在保護(hù)凍存骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞活性方面的積極作用，但果糖及果糖+ 二硫蘇糖醇處理組細(xì)胞活性上調(diào)程度很低，說明效能有限。Oct4、Sox2及Nanog是干細(xì)胞調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中的重要轉(zhuǎn)錄因子，它們之間復(fù)雜的相互作用維持干細(xì)胞多能性和自我更新能力。Oct4基因是POU轉(zhuǎn)錄因子家族中的一員，能夠抑制分化基因、促進(jìn)多能性基因的表達(dá)28。Sox2基因常被作為一種多能性細(xì)胞譜系的分子標(biāo)記，該基因在成體組織細(xì)胞中表達(dá)并具有廣泛的調(diào)節(jié)作用，特別是保護(hù)組織穩(wěn)定性的作用29。因此，Sox2可作為一個(gè)共同的干性基因，調(diào)控不同類

32、型干細(xì)胞和組織的自我更新。Nanog基因與Oct4及Sox2一樣，在早期胚胎發(fā)育和維持干細(xì)胞自我更新和多能性方面起著重要作用，其通過調(diào) 對(duì)照組 果糖組 二硫蘇糖醇組 果糖+二硫蘇糖醇組圖1 凍存大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞復(fù)蘇后形態(tài)(×40)Figure 1 Morphological appearance of rat bone marrow mesenchymal stem cells after crypreservation (×40)圖注：復(fù)蘇骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞24 h內(nèi)貼壁，細(xì)胞呈長(zhǎng)梭態(tài)，生長(zhǎng)狀態(tài)良好。細(xì)胞相對(duì)活性二硫蘇糖醇組對(duì)照組 果糖組 aa0.30

33、果糖+二硫蘇糖醇組a圖4 果糖及二硫蘇糖醇預(yù)處理對(duì)凍存骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞復(fù)蘇后堿性磷酸酶活性的影響Figure 4 The effect of fructose and dithiothreitol pretreatment on alkaline phophatase activity in bone marrow mesenchymal stem cells after crypreservation圖注：骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞復(fù)蘇貼壁48 h后換成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基培養(yǎng)7 d，二硫蘇糖醇及聯(lián)合處理組皆可明顯上調(diào)堿性磷酸酶活性，尤以聯(lián)合處理組效果最明顯(aP < 0.05)。對(duì)照組 果糖組 堿性磷

34、酸酶活性2.01.51.00.50二硫蘇糖醇組果糖+二硫蘇糖醇組圖2 果糖及二硫蘇糖醇預(yù)處理對(duì)凍存后細(xì)胞活性的影響Figure 2 The effect of fructose and dithiothreitol pretreatment on relative cell viability of bone marrow mesenchymal stem cells after crypreservation圖注：果糖、二硫蘇糖醇和果糖+二硫蘇糖醇預(yù)處理皆可促進(jìn)細(xì)胞活性，果糖預(yù)處理組及聯(lián)合預(yù)處理組與對(duì)照組比較差異有顯著性意義(aP < 0.05)，但二硫蘇糖醇預(yù)處理組與對(duì)照組比較差異無

35、顯著性意義。43210二硫蘇糖醇組果糖+二硫蘇糖醇組對(duì)照組 果糖組 Sox2基因相對(duì)表達(dá)Ca二硫蘇糖醇組果糖+二硫蘇糖醇組對(duì)照組 果糖組 Oct4基因相對(duì)表達(dá)2.52.01.51.00.50BAaNanog基因相對(duì)表達(dá)2.52.01.51.00.50果糖+二硫蘇糖醇組對(duì)照組 果糖組 二硫蘇糖醇組圖3 果糖及二硫蘇糖醇預(yù)處理對(duì)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞凍存后多能性基因表達(dá)的影響Figure 3 The effect of fructose and dithiothreitol treatment on expression of multipotent markers in bone marrow mes

36、enchymal stem cells after crypreservation圖注：圖中A為Nanog基因相對(duì)表達(dá)量，與對(duì)照組比較，aP < 0.05；B為Oct4基因相對(duì)表達(dá)量；C為Sox2基因相對(duì)表達(dá)量，與對(duì)照組比較，aP < 0.05。對(duì)照組 果糖組 二硫蘇糖醇組 果糖+二硫蘇糖醇組圖5 果糖及二硫蘇糖醇預(yù)處理對(duì)凍存骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞復(fù)蘇后鈣節(jié)點(diǎn)形成的影響Figure 5 The effect of fructose and dithiothreitol pretreatment on calcium node formation in bone marrow mesenc

37、hymal stem cells after crypreservation圖注：骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞復(fù)蘇貼壁48 h后換成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基培養(yǎng)14 d，茜素紅染色結(jié)果顯示果糖、二硫蘇糖醇及聯(lián)合預(yù)處理都可一定程度促進(jìn)凍存細(xì)胞復(fù)蘇后鈣節(jié)點(diǎn)形成，尤以二硫蘇糖醇組及果糖+二硫蘇糖醇預(yù)處理組最為明顯。節(jié)Gata6、Gata4、Oct4、Sox2及其他因子的表達(dá)來維持干細(xì)胞的自我更新30。為檢測(cè)果糖及二硫蘇糖醇預(yù)處理對(duì)凍存骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞復(fù)蘇后多能性及自我更新能力的影響，實(shí)驗(yàn)利用定量PCR檢測(cè)Nanog、Oct4及Sox2基因的表達(dá)，結(jié)果顯示，二硫蘇糖醇預(yù)處理可明顯上調(diào)凍存骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞復(fù)蘇后Nanog及So

38、x2基因的相對(duì)表達(dá)，果糖預(yù)處理沒有明顯作用，推測(cè)二硫蘇糖醇通過與自由基作用，防止脂質(zhì)過氧化或修復(fù)過氧化物，提高了凍存骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞復(fù)蘇后自我更新能力和多能性。為檢測(cè)凍存骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞復(fù)蘇后向成骨細(xì)胞分化的能力，對(duì)復(fù)蘇骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞進(jìn)行成骨誘導(dǎo)。目前認(rèn)為，堿性磷酸酶和鈣節(jié)點(diǎn)的形成是向成骨細(xì)胞分化的主要前期及后期標(biāo)志。實(shí)驗(yàn)針對(duì)上述指標(biāo)進(jìn)行驗(yàn)證，結(jié)果顯示二硫蘇糖醇及果糖+二硫蘇糖醇預(yù)處理可明顯促進(jìn)堿性磷酸酶活性及鈣節(jié)點(diǎn)的形成，其中以果糖+二硫蘇糖醇預(yù)處理組結(jié)果最為顯著，這些證據(jù)均表明果糖+二硫蘇糖醇預(yù)處理可有效促進(jìn)凍存骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞復(fù)蘇后向成骨分化的能力?？傊?，實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了果糖預(yù)處理有助于維持

39、凍存骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞活性，而二硫蘇糖醇可有效促進(jìn)凍存骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞多能性維持，果糖+二硫蘇糖醇聯(lián)合預(yù)處理可明顯增強(qiáng)凍存骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞復(fù)蘇后成骨分化能力，這為骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞凍存提供了一種新策略。作者貢獻(xiàn)：實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)為宋關(guān)斌，實(shí)驗(yàn)實(shí)施為鄭欣桐、劉欽、張璟霞、陳哲，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)分析為羅慶。利益沖突：所有作者共同認(rèn)可文章內(nèi)容不涉及相關(guān)利益沖突。倫理問題：實(shí)驗(yàn)過程中對(duì)動(dòng)物的處置符合2009 年Ethical issues in animal experimentation相關(guān)動(dòng)物倫理學(xué)標(biāo)準(zhǔn)的條例。文章查重：文章出版前已經(jīng)過CNKI反剽竊文獻(xiàn)檢測(cè)系統(tǒng)進(jìn)行3次查重。文章外審：文章經(jīng)國(guó)內(nèi)小同行外審專家雙盲外審

40、，符合本刊發(fā)稿宗旨。作者聲明：鄭欣桐、劉欽、張璟霞、陳哲對(duì)于研究和撰寫的論文中出現(xiàn)的不端行為承擔(dān)責(zé)任。論文中涉及的原始圖片、數(shù)據(jù)(包括計(jì)算機(jī)數(shù)據(jù)庫(kù))記錄及樣本已按照有關(guān)規(guī)定保存、分享和銷毀，可接受核查。文章版權(quán)：文章出版前雜志已與全體作者授權(quán)人簽署了版權(quán)相關(guān)協(xié)議。4 參考文獻(xiàn) References1 See EY, Toh SL, Goh JC. Multilineage potential of bone-marrow-derived mesenchymal stem cell cell sheets: implications for tissue engineering. Tissue

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