靶向聚合物納米磁共振納米探針的初步研究

1、科研訓(xùn)練報(bào)告書項(xiàng)目名稱：靶向聚合物納米磁共振納米探針的初步研究學(xué)生姓名： 張渤學(xué)號(hào)：2014211923專業(yè)班級：高分子14-2班指導(dǎo)教師：何濤2016年 6月 20 日靶向聚合物納米磁共振納米探針的初步研究摘要：當(dāng)前，惡性腫瘤嚴(yán)重威脅著人類的健康，如何攻克癌癥頑疾成為一個(gè)亟待解決的問題。其中，陽離子聚合物由于顯而易見的優(yōu)勢已經(jīng)逐漸受到人們的密切關(guān)注，可望今后在腫瘤的早期診斷和治療上發(fā)揮重大作用。本文的主要基于聚乙二醇-聚乙烯亞胺與超順磁性氧化鐵的前列腺癌靶向核磁共振顯像納米探針的研究。關(guān)鍵詞：聚乙二醇-聚乙烯亞胺，磁共振成像基礎(chǔ)，分子探針，納米科技，癌癥的早期診斷科研訓(xùn)練報(bào)告正文（附參考文獻(xiàn)

2、）一、研究現(xiàn)狀及意義1.1磁共振成像基礎(chǔ)20世紀(jì)40年代磁共振作為一種物理現(xiàn)象就應(yīng)用于物理學(xué)、化學(xué)和醫(yī)學(xué)領(lǐng)域。1946年美國斯坦福大學(xué)的Bloch等用感應(yīng)法和哈佛大學(xué)的Purcell等用吸收法同時(shí)分別獨(dú)立測得水和石蠟的核磁共振吸收。由于Purcell和Bloch在探索物質(zhì)微觀結(jié)構(gòu)領(lǐng)域做出了重大貢獻(xiàn)，1952年榮獲諾貝爾物理學(xué)獎(jiǎng)。在核磁共振成像領(lǐng)域，美國紐約州立大學(xué)Lauterbur于1973年在Nature雜志上首先發(fā)表一種叫“Zeugmatography”核磁共振成像方法的論文，緊接著在Mansfield又發(fā)表了“選擇激發(fā)序列”的成像方法，從此核磁共振成像得到了空前的發(fā)展，如今已成為臨床診斷

3、的重要方法，使人們長期以來設(shè)法用無損傷的方法既能取得活體器官的詳細(xì)診斷圖像，又能監(jiān)測活體器官和組織中的化學(xué)成分和化學(xué)反應(yīng)的夢想得以實(shí)現(xiàn)。Lauterbur和Mansfield也在2003年榮獲諾貝爾生理醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)【1】。磁共振是物質(zhì)原子核磁矩在外磁場的作用下能級發(fā)生分裂，并在外加射頻磁場的能量條件下產(chǎn)生的能級躍遷的核物理現(xiàn)象。電子、質(zhì)子、中子等都具有自旋和磁距的特性。質(zhì)子和中子的數(shù)目是奇數(shù)或兩者都是奇數(shù)時(shí)，例如1H、13C、19F、23Na、31P等，這些原子的原子核就具有自旋和磁距。H是人體內(nèi)數(shù)量最多的元素，且原子核只含一個(gè)質(zhì)子，是人體內(nèi)最活躍、最易受外界磁場影響的原子核，被磁化的氫原子數(shù)越多，

4、散發(fā)的能量越大，磁共振信號(hào)就越強(qiáng)。故目前設(shè)計(jì)的磁共振成像系統(tǒng)大多數(shù)是采用氫質(zhì)子成像的。在常態(tài)狀況，各磁距是相互抵消的，當(dāng)有一外加磁場存在時(shí)，體內(nèi)質(zhì)子或中子的自旋被磁化(magnetization)，使原來的自旋軸依據(jù)外磁場的方向旋轉(zhuǎn)，這種旋轉(zhuǎn)動(dòng)作稱進(jìn)動(dòng)(precession)，或順外磁場方向處于低能態(tài)，或逆外磁場方向處于高能態(tài)。在此情況下，用一個(gè)頻率與進(jìn)動(dòng)頻率相同的射頻脈沖(radiofrequencepulse，RF)激發(fā)欲檢查的原子核，將引起共振，即磁共振。當(dāng)RF終止時(shí)，原子核將其所吸收的能量以電磁波的形式(射頻信號(hào))向外釋放，直至完全恢復(fù)到沿順外加靜電磁場方向排列的平衡狀態(tài)，這個(gè)過程為弛

5、豫(relaxation)。所需的時(shí)間稱弛豫時(shí)間(relaxationtime)，一般都很短，以毫秒(ms)計(jì)。弛豫時(shí)間分兩種：T1弛豫時(shí)間和T2弛豫時(shí)問。T1或縱向弛豫時(shí)間，其定義是平行于主磁場Z軸的磁化矢量當(dāng)其恢復(fù)到最后最大量的63時(shí)所需的時(shí)間。因其能量的交換是由自旋質(zhì)子傳遞給周圍環(huán)境(晶格)，故也稱為自旋-晶格弛豫時(shí)間。T2或橫向弛豫時(shí)間：是指在xy軸上的磁化矢量由最初最大值逐漸衰減到37時(shí)所需的時(shí)間。此期間的能量交換是自旋質(zhì)子傳遞給其周圍的自旋質(zhì)子，故又稱為自旋-自旋弛豫時(shí)間。T1和T2具有特異性，每種正常和病變組織的T1、T2值均不相同，1H的T1、T2值可反映其周圍的化學(xué)或磁環(huán)境。

6、在MR成像中，質(zhì)子密度(單位體積內(nèi)1H的數(shù)量，用Pd表示)也是一種成像參數(shù)，但不如T1、T2重要。在實(shí)際應(yīng)用中，往往要通過調(diào)整重復(fù)激發(fā)時(shí)間(TR)和回波時(shí)間(TE)來突出T1、T2和Pd成分的成像，分別稱T1加權(quán)成像(T1WI)、T2加權(quán)成像(T2WI)和Pd加權(quán)成像(PdWI)。由于射頻脈沖之形式、時(shí)間、序列的變化和對所接收的信號(hào)分析處理方式不同，因此同一標(biāo)本MRI可獲得許多不同的結(jié)果，即不同密度分布。且各序列對結(jié)構(gòu)顯示的側(cè)重面和清晰度也各異，更易從不同角度了解病變過程和定性【2】。1.2分子探針分子探針指對某特定生物分子（如蛋白質(zhì)）具有特異性靶向、并能進(jìn)行體內(nèi)或體外示蹤的標(biāo)記物分子，這些分

7、子能夠在體或離體反映其靶生物分子的量和功能【3】。MR分子成像的原理是借助分子探針，通過靶向結(jié)合或酶激活的原理及適當(dāng)策略放大信號(hào)，用高分辨力的成像系統(tǒng)檢測相應(yīng)的信號(hào)改變，間接反映分子或基因的信息。分子成像的關(guān)鍵在于正確選擇靶位。超順磁性氧化鐵納米粒子是一種高順磁性、高特異性及高生物相容性的分子探針，在血管成像、鑒別良惡性淋巴結(jié)、診斷早期腫瘤等方面有著良好應(yīng)用前景【4】。1.3 研究意義隨著腫瘤發(fā)病率的不斷提高，腫瘤給人類帶來的痛苦越來越大。早期發(fā)現(xiàn)腫瘤較困難，待確診后，一些原本有效的治療方法已不能完全發(fā)揮作用，因此對惡性腫瘤的早期診斷以及治療已經(jīng)成為目前臨床急待解決的問題?！霸\斷及治療納米藥物

8、”可以同時(shí)實(shí)現(xiàn)對腫瘤的靶向診斷及藥物輸送，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)癌癥的同步診斷和治療。人類健康是一個(gè)永恒的課題，隨著人類經(jīng)濟(jì)社會(huì)的發(fā)展，健康問題越來越受到人們的重視。當(dāng)前，癌癥是對人類健康危害最嚴(yán)重的疾病之一，發(fā)病率持續(xù)上升，造成嚴(yán)重的社會(huì)和經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。由于缺乏高靈敏度診斷及低毒副作用治療方法，癌癥的早期診斷和治療仍然是當(dāng)今醫(yī)學(xué)的難題之一【5】。納米科技的發(fā)展給癌癥治療提供了新手段，納米載體將抗癌藥物靶向釋放到病灶部位，增加病灶處局部藥物濃度，不僅能顯著提高療效，且可降低抗癌藥物對正常組織的傷害【6-11】。而納米科學(xué)、高分子科學(xué)和分子影像學(xué)的有機(jī)結(jié)合，發(fā)展出了“診斷及治療納米藥物”(theranostic

9、nanomedicine)，給癌癥的診斷和治療開辟了一片新天地12-17。其中，MRI “診斷及治療納米藥物”可以克服MRI造影劑及抗癌藥物靶向性、穩(wěn)定性差等缺點(diǎn)，提高疏水性藥物的水溶性，延長藥物和MRI造影劑在血液中的循環(huán)時(shí)間，同時(shí)對腫瘤具有靶向作用，降低對正常細(xì)胞和組織的毒副作用5,18,19。二、項(xiàng)目方案 2.1 立項(xiàng)依據(jù)：惡性腫瘤嚴(yán)重威脅著人類的健康，如何攻克癌癥成為一個(gè)亟待解決的問題。目前，MRI對由于其顯而易見的優(yōu)點(diǎn)被廣泛用于腫瘤的早期診斷，但是其半衰期過短及缺乏足夠靈敏度限制了其應(yīng)用范圍，因此如何實(shí)現(xiàn)用高靈敏度磁底物劑對腫瘤部位的靶向性傳輸引起了人們的廣泛興趣。本文從腫瘤的早期診

10、斷和基因治療著手合成了聚乙二醇-聚乙烯亞胺，通過配體交換的方法包裹超順磁性四氧化三鐵納米粒子(SPIO)，再通過功能化的聚乙二醇與活化的前列腺干細(xì)胞抗原(PSCA)單克隆單鏈抗體結(jié)合，得到前列腺癌細(xì)胞靶向核磁共振顯像納米探針。研究表明，這種抗體連接的負(fù)載超順磁性四氧化三鐵納米粒子的聚乙二醇接枝聚乙烯亞胺能夠顯著提高對前列腺癌細(xì)胞的特異性輸送效率，從而顯著地降低前列腺癌細(xì)胞的核磁共振成像(MRI)T2信號(hào)強(qiáng)度，增強(qiáng)對前列腺癌的識(shí)別效率。2.2創(chuàng)新點(diǎn)：通過在聚合物表面連接特異性抗體并在內(nèi)部負(fù)載超順磁性納米粒子(SPIO)，得到了一種潛在的前列腺癌MRI早期診斷新型納米探針。2.3實(shí)驗(yàn)方案及實(shí)驗(yàn)結(jié)果

11、表征2.3.1實(shí)驗(yàn)材料單甲基醚聚乙二醇(mPEGOH 2kDa),支化聚乙烯亞胺(hy-PEI 25 kDa), 2-巰基乙胺(97), N一羥基琥珀酰亞胺(NHS)(98) ,N-甲氧基羰基馬來酰亞胺 (>97) ,N,N-羰基二咪唑(CDI),丁二酸酐,乙二胺四乙酸(EDTA),二環(huán)己基碳酰亞胺(DCC)(98),四氫呋喃(THE)和三氯甲烷(CHCl3)預(yù)先用CaH2干燥一周備用；預(yù)先配置pH=7.4磷酸鹽緩沖溶液(PBS)備用；超順磁性四氧化三鐵納米粒子(SPIO)按Sun報(bào)道的方法合成【28】,平均粒徑為6nm；-羥基-w-氨基聚乙二醇按Tromsdorf報(bào)道的方法合成【29】

12、。2.3.1儀器產(chǎn)物的化學(xué)結(jié)構(gòu)通過Varian INOVA 500NB超導(dǎo)核磁共振儀進(jìn)行分析鑒定；聚合物SPIO含量用Z-2000型偏振塞曼原子吸收分光光度計(jì)測量；粒徑和電位采用Brooken Haven ZetaPlus電位粒徑儀進(jìn)行測定，入射激光波長=532 nm，入射角90度，溫度為25；LSM 510 META型激光共聚集顯微鏡；Carl ZeissAviox-I型倒置熒光顯微鏡；Signa EXCITE II Twinspeed超導(dǎo)型核磁共振掃描儀；Tecan Infinite F200 Multimode plate reader Tecan多功能酶標(biāo)儀。2.3.2 實(shí)驗(yàn)方案2.3

13、.2.1聚乙二醇接枝聚乙烯亞胺(mPEG-g-PEI)的合成稱取4.0 g單甲基醚聚乙二醇(Mn=2 kDa)于干燥兩121瓶中，60真空干燥5h，冷卻后Ar保護(hù)下加入30 mL已干燥THF中充分溶解。稱取CDI 2.27 g置于另一干燥兩口瓶中，加保護(hù)下將溶有mPEG-OH的THF溶液緩慢滴加到兩口瓶中，室溫下繼續(xù)攪拌反應(yīng)12 h。加入0.216 mL水使過量的CDI失活，反應(yīng)進(jìn)行0.5 h。用大量無水乙醚沉淀2次，過濾后干燥得白色粉末狀固體。再稱取3.O g支化聚乙烯亞胺(Mn=25 kDa)和2.4 g上述白色粉末分別溶于10mL CHCl3，并將溶有白色粉末的CHCl3溶液加入到hy-

14、PEG的CHCl3溶液中，攪拌反應(yīng)過夜。用大量無水乙醚沉淀3次，干燥得白色粉末狀固體，產(chǎn)率為70。反應(yīng)路線見下圖。2.3.2.2負(fù)載SPIO的聚乙二醇一聚乙烯亞胺的制備參考Tromsdorf等報(bào)道的方法【29】制備mPEG-g-PEI-SPIO。稱取450mg mPEG一g一PEI和30 mg SPIO(6nm)共溶解予5 mL CHCl3中，室溫下攪拌過夜并用氬氣吹干到約2 mL，向其中加入約10 mL正己烷，震蕩3小時(shí)并吸層清液，重復(fù)上述操作3次。將溶劑揮發(fā)干，向其加入約5 mL雙蒸水，超聲攪拌30分鐘使其充分溶解，以轉(zhuǎn)速12000 r/min離心1.5小時(shí)，取清液用220 am針頭過濾器

15、過濾樣品，在4下放置備用。采用原子吸收法測定mPEG-g-PEI-SPIO中SPIO的含量。將已知重量的PEG-g-PEI-SPIO分散到l M HCI溶液中，使SPIO分解為鐵離子并溶解在溶液中。根據(jù)已經(jīng)建立的標(biāo)準(zhǔn)曲線，測定248.3 nm處的吸收，計(jì)算出鐵含量。用氧化鐵的質(zhì)量除以膠束的總質(zhì)量，得到SPIO的負(fù)載率。2.3.2.3 -羧基-馬來酰亞胺聚乙二醇報(bào)合成參考Shen等報(bào)道的辦法合成mal-PEG-OH【30】，首先將3.0g NH2-PEGOH(Mn=3.6 kDa)溶解于15mL NaHC03飽和溶液，施過冰鹽浴使其冷卻至0，向兌中加入O.42 gN-甲氧基羰基馬來酰亞胺并攪拌l

16、O分鐘，向其中加入30mL蒸餾水并繼續(xù)攪拌45分鐘，用0.5M的硫酸溶液調(diào)節(jié)pH到3.0。以二氯甲烷萃取三次并用硫酸鈉干燥，過濾并將濾液加入到大量冷乙醚中，過濾干燥得白色粉末狀固體。參考Shuai等報(bào)道的方法臺(tái)成mal-PEG-COOHl2【31】，將300 mg上述白色粉末加入三口瓶中，室溫下真空干燥5h，加入20 mLCHCl3，待其溶解后再加入50mg丁二酸酐，70攪拌引流反應(yīng)48小時(shí)，減壓除掉部分CHCl3，沉淀至大量無水乙醚中，過濾收集粗產(chǎn)物，再用少量CHCl3溶解粗產(chǎn)物，沉淀至大量無水己醚中，過濾干燥得白色粉末狀產(chǎn)物。合成路線見下圖。2.3.2.4單鏈單克隆抗體-聚乙二醇-聚乙烯亞

17、胺負(fù)載SPIO合成按文獻(xiàn)【32】方法先準(zhǔn)備好有游離巰基的單克隆單鏈抗體。50L的AbpscA加EDTA溶液(10 pL O.5 M)；60 mg 2-巰基乙胺溶解在O.5 mL PBS(含10L 0.5 M)中，4預(yù)冷孵育15 min，然后加入到上述含AbPSCA的溶液中。在37孵育90min。用脫鹽柱(PD-10 Desalting Columns，GE Healthcare，MWCO=5000)除掉過量的2-巰基乙胺，把打開了雙鏈的抗體立即與含有malPEG-COOH(10g)的PBS(500L含10 L 0.5 M EDTA，預(yù)冷)溶液混和，在4放置過夜。再用脫鹽柱(MWCO=5000)

18、脫去多余mal-PEG-COOH，產(chǎn)物中加入EDC和NHS各5g孵育20 min。把上述產(chǎn)出與lOg mPEGgPEISPIO溶液混和，4放置過夜。為了檢驗(yàn)抗體是否成功的連接上mPEG-g-PEI-SPIO，按操作方法，用羊抗鼠lgG-FITC二抗與mPEG-g-PEI-SPIO抗體復(fù)合物孵育，然后離心復(fù)合物溶液，棄上清液，用PBS重懸，與PC3M細(xì)胞37孵育20分鐘，在熒光顯微鏡下觀察熒光情況。2.4 實(shí)驗(yàn)預(yù)期成果用于疾病早期診斷的聚合物納米探針是目前非常熱門的研究領(lǐng)域，聚合物納米探針在腫瘤組織中可獲得獨(dú)特的被動(dòng)性的靶向聚集效應(yīng)。此外，利用腫瘤細(xì)胞的特定受體，在納米粒子中引入相應(yīng)的配體以獲得

19、受體介導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)吞作用，己經(jīng)證明是能增強(qiáng)納米粒子的腫瘤細(xì)胞靶向性和胞吞作用，避免正常細(xì)胞胞吞的有效途徑。靶向腫瘤納米診斷探針研究是疾病早期診斷研究中的熱點(diǎn)領(lǐng)域，在諸多腫瘤胞主動(dòng)配體靶向技術(shù)中，抗體靶向性一致受到極大的關(guān)注，主要是因?yàn)榭贵w和原性受體結(jié)合具有高特異性、高選擇性、親和力強(qiáng)及生物效應(yīng)明顯的特點(diǎn)。抗體是由相同性質(zhì)的雙鏈構(gòu)成，分解成單鏈不僅可減小其體積和重量，同時(shí)仍然保留原來的抗體特征，更使經(jīng)其修飾過的納米粒子易于透過胞吞作用進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)。PSCA是前列腺瘸上高表達(dá)的膜抗原蛋白，與相應(yīng)的單克隆抗體特異性結(jié)合，是前列腺癌一種潛在的靶離診斷與治療的靶點(diǎn)膜蛋自。利用單克隆單鏈抗體scAbpscA與

20、PSCA的特異性結(jié)合原理，產(chǎn)生主動(dòng)靶向作用，有望開發(fā)出一種新型高效的前列腺癌早期診斷的MRI納米探針。三、 年度計(jì)劃2016.072016.08查閱相關(guān)文獻(xiàn)資料，設(shè)計(jì)具體實(shí)驗(yàn)方案，撰寫開題報(bào)告2016.08開題報(bào)告2016.082016.12實(shí)驗(yàn)研究、數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)、處理與分析2017.012017.03填寫結(jié)題表，撰寫研究論文和總結(jié)報(bào)告2017.05課題結(jié)題答辯四、 參考文獻(xiàn)1熊本欣，李立本，核磁共振成像原理北京：科學(xué)出版社2沈鼎烈，王學(xué)峰，臨床癲癎學(xué)（第二版）上海：科學(xué)技術(shù)出版社3申寶忠分子影像學(xué)北京：人民衛(wèi)生出版社，2010:61-63.4劉國華超微超順磁性氧化鐵納米粒及其在腫瘤磁共振成像中的

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