人類外周血淋巴細胞的培養(yǎng)及染色體標本制備

1、細胞與遺傳學教研室細胞與遺傳學教研室一、實驗目的一、實驗目的1.1.掌握人類染色體標本的制作方法掌握人類染色體標本的制作方法2.2.了解人類染色體形態(tài)結(jié)構(gòu)特征了解人類染色體形態(tài)結(jié)構(gòu)特征PHA37 68h秋水仙素秋水仙素至至72 h h三、實驗用品三、實驗用品 1.1.材料：人體外周血材料：人體外周血 2.2.器材：培養(yǎng)箱、培養(yǎng)瓶、離心機、刻度離心管、吸器材：培養(yǎng)箱、培養(yǎng)瓶、離心機、刻度離心管、吸管、恒溫水浴鍋等管、恒溫水浴鍋等 3.3.試劑：培養(yǎng)基、秋水仙素（試劑：培養(yǎng)基、秋水仙素（12.5gml12.5gml）、）、植物凝植物凝集素（集素（PHAPHA）、肝素、肝素、0.075Mkcl0.0

2、75Mkcl低滲液、甲醇、冰乙低滲液、甲醇、冰乙酸、酸、PH6.8PH6.8磷酸緩沖液、磷酸緩沖液、GiemsaGiemsa原液。原液。四、實驗方法四、實驗方法1.1.外周血細胞培養(yǎng)外周血細胞培養(yǎng)（1 1）采血：無菌，肝素抗凝。）采血：無菌，肝素抗凝。 用無菌注射器抽取肝素用無菌注射器抽取肝素0.2ml,0.2ml,潤濕針筒潤濕針筒, ,推出多推出多余肝素余肝素. .消毒后消毒后, ,抽取受試者靜脈血抽取受試者靜脈血2ml2ml。）（2 2）接種培養(yǎng)：每培養(yǎng)瓶加入）接種培養(yǎng)：每培養(yǎng)瓶加入0.30.5ml0.5ml（1010滴）滴）, , 接種種于裝有5ml培養(yǎng)養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶養(yǎng)瓶中，搖勻搖勻， 3

3、7培養(yǎng)養(yǎng)箱中培養(yǎng)養(yǎng)68小時時。 （2020滴）滴） （3 3）秋水仙素處理：）秋水仙素處理：0.050.4gml培養(yǎng)養(yǎng)基，輕搖輕搖混勻勻后，繼續(xù)繼續(xù)培養(yǎng)養(yǎng)至72小時時 。 實驗方法實驗方法2.2.染色體的制備染色體的制備（1）收獲細胞：用吸管吸取培養(yǎng)物，移至離心管中，以）收獲細胞：用吸管吸取培養(yǎng)物，移至離心管中，以1500轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)/分離心分離心10分鐘，棄去上清液，留下沉淀物約分鐘，棄去上清液，留下沉淀物約0.3ml。 （2）低滲處理：加入預溫）低滲處理：加入預溫37的低滲液至的低滲液至8ml，用吸管，用吸管輕輕吹吹打混勻，置于打混勻，置于37恒溫水浴鍋中低滲恒溫水浴鍋中低滲20分鐘分鐘 。低滲后

4、吹打要輕輕,以防細細胞破裂.（3）預固定：緩緩加入）預固定：緩緩加入1ml新配制的固定液（甲醇：冰乙酸新配制的固定液（甲醇：冰乙酸=3:1），立即用吸管輕吹打混勻。以），立即用吸管輕吹打混勻。以1500轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)/分離心分離心10分鐘分鐘，棄上清液，棄上清液， 留約留約0.3ml沉淀物。沉淀物。 （4）固定：加入新鮮固定液至）固定：加入新鮮固定液至8ml，吸管吹打混勻，室溫固，吸管吹打混勻，室溫固定定20分鐘分鐘， 1500轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)/分離心分離心10min，去上清液。依上述方法，去上清液。依上述方法再重復固定再重復固定1次。次。 實驗方法實驗方法（5）制備細胞懸液：）制備細胞懸液： 預留預留0.20.3ml固定液固定液 ，加2滴新配固定液制成細胞懸制成細胞懸液液 （6）滴片：）滴片： 吸取細胞懸液，滴吸取細胞懸液，滴23滴于冰鎮(zhèn)的載玻片上滴于冰鎮(zhèn)的載玻片上,于酒精燈火于酒精燈火焰上過火后，空氣干燥。焰上過火后，空氣干燥。(每組每組3張，只染張，只染1張）張） （7）染色：）染色： Giemsa染液染色10分鐘鐘，自來來水輕輕沖洗，晾晾干，鏡檢鏡檢。