赤芍總苷的提取純化與質(zhì)量檢查設(shè)計(jì)方案

1、赤芍總苷的提取純化與質(zhì)量檢查設(shè)計(jì)方案1文獻(xiàn)背景 赤芍為毛茛科植物芍藥 Paeonia lactiflora Pall. 或川赤芍 Paeonia veitchii Lynch 的干燥根，具有清熱涼血、散瘀止痛的功效，其主要有效成分為芍藥苷、芍藥內(nèi)酯苷、氧化芍藥苷、苯甲酰芍藥苷、芍藥花苷等單萜苷類化合物，總稱赤芍總苷，可改善機(jī)體微循環(huán)，抑制血小板凝聚，抗血栓形成，具有廣泛的藥理活性1-3，是一種可用于保健食品的中藥。1.1 赤芍總苷背景意義 在藥理學(xué)上，赤芍總苷對(duì)血液具有抗凝血、抗血栓以及抗內(nèi)毒素和改善微循環(huán)的作用。并且赤芍總苷對(duì)缺血性損傷如心肌缺血同樣具有保護(hù)作用4，正是這樣的良好使用療效，我

2、們需要對(duì)赤芍總苷進(jìn)行更多的研究，來(lái)保證臨床的使用療效。1.2提取研究現(xiàn)狀目前報(bào)道的赤芍總苷提取工藝文獻(xiàn)中，多采用正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)法5。即分別稱取赤芍藥材若干（通常800g），以不同的提取液（水、乙醇）分別按正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)表試驗(yàn)，濾過(guò)，合并濾液，量取體積，即得正交試驗(yàn)各試驗(yàn)的提取液。1.3純化研究現(xiàn)狀目前報(bào)道的赤芍總苷純化工藝文獻(xiàn)中，多采用正丁醇萃取法和大孔樹(shù)脂吸附法6。即將提取過(guò)程中，包括糖類、脂類等許多雜質(zhì)在內(nèi)的浸膏提取液，補(bǔ)充蒸餾水至藥材的2倍量，作為待純化樣品溶液。純化方法1（正丁醇萃取法）：取上述待純化樣品溶液200ml，取等量石油醚萃取3次，除去石油醚層，然后用水飽和后的正丁醇萃取3次，收

3、集正丁醇層，再用200ml蒸餾水洗1次，棄去水層，減壓回收正丁醇，所得浸膏于真空干燥器中干燥。純化方法2（大孔樹(shù)脂吸附法）：D101大孔吸附樹(shù)脂100g，經(jīng)95%乙醇浸泡12h，充分溶脹后裝柱，蒸餾水洗至無(wú)醇味，備用。上述待純化樣品溶液取200ml，上樹(shù)脂柱，3倍量蒸餾水洗，再用3倍量的乙醇洗脫，收集20%洗脫組分，減壓回收乙醇，剩余浸膏于真空干燥器中干燥。1.4質(zhì)量控制 赤芍中赤芍總苷質(zhì)量控制包括性狀鑒別（顏色、氣味）、薄層鑒別（藍(lán)紫色斑點(diǎn)）、以及對(duì)其進(jìn)行高效液相色譜的含量測(cè)定（檢測(cè)波長(zhǎng)為230nm，理論板數(shù)按芍藥苷峰計(jì)算應(yīng)不低于3000）以及水分、熾灼殘?jiān)?，重金屬等檢測(cè)。2 赤芍飲片的質(zhì)量

4、檢查2.1性狀: 本品應(yīng)呈圓柱形，稍彎。表面棕褐色，粗糙，有縱溝和皺紋，并有須根痕和橫長(zhǎng)的皮乳樣突起，有的外皮易脫落。質(zhì)硬而脆，易折斷，斷面粉白色或粉紅色，有的有裂隙。氣微香，味微苦、酸澀。2.2鑒別: 取本品粉末0.5g，加乙醇10ml，振搖5分鐘，濾過(guò)，濾液蒸干，殘?jiān)右掖?ml使溶解，作為供試品溶液。另取芍藥苷對(duì)照品，加乙醇制成每1ml含2mg的溶液，作為對(duì)照品溶液。照薄層色譜法（附錄B）試驗(yàn)，吸取上述兩種溶液各4l，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以三氯甲烷-乙酸乙酯-甲醇-甲酸（40：5：10：0.2）為展開(kāi)劑，展開(kāi)，取出，晾干，噴以5%香草醛硫酸溶液，加熱至斑點(diǎn)顯色清晰。供試品色譜中，

5、在與對(duì)照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同的藍(lán)紫色斑點(diǎn)。2.3含量測(cè)定：照高效液相色譜法（通則0512）測(cè)定。2.3.1 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn)以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；以甲醇-0.05mol/L磷酸二氫鉀溶液（40：65）為流動(dòng)相；檢測(cè)波長(zhǎng)為230nm。理論板數(shù)按芍藥苷峰計(jì)算應(yīng)不低于3000。2.3.2 對(duì)照品溶液的制備取經(jīng)五氧化二磷減壓干燥器中干燥36小時(shí)的芍藥苷對(duì)照品適量，精密稱定，加甲醇制成每1ml含0.5mg的溶液，即得。2.3.3 供試品溶液的制備取本品粗粉約0.5g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇25ml，稱定重量，浸泡4小時(shí)，超聲處理20分鐘，放冷，再稱定重量，用甲醇補(bǔ)

6、足減失的重量，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得。2.3.4 測(cè)定法分別精密吸取對(duì)照品溶液與供試品溶液各10l，注入液相色譜儀，測(cè)定，即得。本品含芍藥苷（C23H28O11）不得少于1.8%。參考文獻(xiàn)：2015版中國(guó)藥典3 赤芍總苷的提取工藝3.1 指標(biāo)成分的選擇及含量測(cè)定赤芍中所含豐富的苷類成分總稱赤芍總苷，為赤芍的主要活性部位，其中以芍藥苷的含量最高，選擇芍藥苷作為含量測(cè)定的指標(biāo)成分。3.1.1 HPLC色譜條件的優(yōu)化選擇色譜柱的選擇：考察Hypersil ODS(150mm*4.6mm,5m)和Hypersil BDS(200mm*4.6mm,5m)流動(dòng)相選擇：流動(dòng)相考察甲醇-水系統(tǒng)、甲醇-0.

7、05%磷酸溶液系統(tǒng)、乙腈-水及乙腈-0.05%磷酸溶液系統(tǒng)。流速選擇：流速考察0.6ml/min、0.8ml/min、1.0ml/min3.1.2 對(duì)照品溶液的制備精密稱取芍藥苷對(duì)照品10.63mg，置25ml量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得對(duì)照品貯備液(每lml含芍藥苷對(duì)照品425.2g）。3.1.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備分別精密量取對(duì)照品貯備液溶液(425.2g/ml)0.5ml、l.0ml、2.0ml、3.0ml、4.0ml、5.0ml置10ml容量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻。精密量取上述不同濃度對(duì)照品溶液各10l注入液相色譜儀，按前述色譜條件分別測(cè)定其峰面積。以對(duì)照品濃度X為橫坐

8、標(biāo)，峰面積積分值Y為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。3.1.4 供試品溶液的制備及測(cè)定取提取液，稀釋至一定體積，濾過(guò)，即得供試品溶液。分別精密吸取對(duì)照品溶液與供試品溶液各10l，注入液相色譜儀，測(cè)定，由外標(biāo)一點(diǎn)法計(jì)算即得芍藥苷含量。3.2 提取溶媒的篩選：赤芍中所含苷類成分極性較大，在水、乙醇等親水性溶劑中溶解度較好。本實(shí)驗(yàn)以芍藥苷的含量為評(píng)價(jià)指標(biāo)，考察水和不同濃度的乙醇對(duì)芍藥苷的提取效率，篩選赤芍藥材的最佳提取溶媒。見(jiàn)表1：表1 不同提取溶媒芍藥苷含量提取溶媒 水 50%乙醇 70%乙醇溶媒用量(倍)666提取次數(shù)(次)222提取時(shí)間(h)1.51.51.5芍藥苷含量(%)3.3 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)優(yōu)化提取

9、工藝3.3.1 因素水平設(shè)置溶劑法提取中影響提取效率的因素主要有溶媒用量、提取時(shí)間及提取次數(shù)等。根據(jù)實(shí)際情況，設(shè)置醇用量、提取時(shí)間及提取次數(shù)為3個(gè)考察因素，因素水平設(shè)置見(jiàn)表2。表2 因素-水平表因素-水平A提取溶媒（倍）B提取時(shí)間（h）C提取次數(shù)（次）1411261.5238233.3.2 實(shí)驗(yàn)安排及結(jié)果考察影響提取效能的主要因素乙醇用量、提取時(shí)間、提取次數(shù)及相應(yīng)水平，選取正交表L9(34)作正交試驗(yàn)，所選因素一水平見(jiàn)表2。稱取川赤芍藥材約50g，按L9(34)正交試驗(yàn)表按排試驗(yàn)，以芍藥苷含量(芍藥苷含量=提取液中芍藥苷質(zhì)量/稱取的藥材量*100%)為評(píng)價(jià)指標(biāo)。試驗(yàn)方案見(jiàn)表3表3 3L9(34

10、)正交試驗(yàn)表表頭 A B C D 芍藥苷含量 （%）列號(hào) 1 2 3 41 1 1 1 12 1 2 2 23 1 3 3 34 2 1 2 35 2 2 3 16 2 3 1 27 3 1 3 28 3 2 1 39 3 3 2 1IIIIIISS 3.3.3 驗(yàn)證試驗(yàn)以優(yōu)化工藝條件重復(fù)試驗(yàn)3次，驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表4表4 驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果試驗(yàn) 試驗(yàn)號(hào) 投料量 固形物 固形物 RSD 芍藥苷 芍藥苷 RSD 方案 （kg） 得率 平均得率 含量 平均含量 （%） （%） （%） （%） （%） （%）1234 赤芍總苷（TPG）的純化工藝的優(yōu)化4.1上樣液預(yù)處理赤芍醇提液減壓濃縮至無(wú)醇味，加水適量分

11、散溶解、過(guò)濾定容，制成每毫升含0.2g生藥(0.2g·ml-1)的溶液，備用。4.2 大孔吸附樹(shù)脂型號(hào)篩選取AB-8型和D-101型大孔吸附樹(shù)脂各20ml，裝于樹(shù)脂柱中(徑高比為1:8)，取樣液40ml上樣。先用3BV蒸餾水，再用5BV 20%乙醇洗脫，合并乙醇洗脫液，測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)表5。從芍藥苷吸附解析率和殘液中芍藥苷含量綜合考慮，選擇樹(shù)脂種類。表5 樹(shù)脂動(dòng)態(tài)吸附實(shí)驗(yàn)結(jié)果樹(shù)脂型號(hào)上樣液含量(mg)吸附-解吸率(%)殘液中含量(%)D101207.31AB-8207.314.3上樣濃度考察取AB- 8型大孔吸附樹(shù)脂3份，每份20ml，裝柱(徑高比為1:8)，分別取含生藥濃度為0.1g&

12、#183; ml-1、0.2g· ml-1、0.3g·ml-1樣品液上樣，吸附流速為1.0ml·min-1。然后用3BV水洗脫，再以5BV 20%乙醇洗脫，按4.3色譜條件進(jìn)行測(cè)定醇洗脫液中芍藥苷含量，結(jié)果見(jiàn)表6。表6上樣濃度考察結(jié)果上樣濃度(g·ml-1)0.10.20.3芍藥苷洗脫量(mg)洗脫率(%)4.4 泄漏曲線考察取AB- 8型大孔吸附樹(shù)脂20ml，裝于樹(shù)脂柱中(徑高比1:8)，取樣品液60ml上樣，吸附流速為1.0ml·min-1。收集流出液，每5ml為一流分。按如下色譜條件測(cè)定，繪制泄漏曲線，確定最大上樣量。色譜條件：Diamo

13、nsil C18色譜柱(250mm× 4.6mm,5m)；乙腈為流動(dòng)相A，水為流動(dòng)相B，按表7進(jìn)行梯度洗脫；流速1.0ml·min-1；柱溫25；檢測(cè)波長(zhǎng)230nm。表7 流動(dòng)相梯度洗脫時(shí)間表時(shí)間/min流動(dòng)相A/%流動(dòng)相B/%01486209552514864.5 吸附流速的考察取AB- 8型大孔吸附樹(shù)脂3份，每份20ml，裝柱(徑高比為1:8)，取樣液60ml上樣，吸附流速分別為1.0ml·min-1、2.0ml·min-1、3.0ml·min-1。進(jìn)行動(dòng)態(tài)吸附后，先用3BV水洗脫，再用5BV 20%乙醇洗脫，按4.3色譜條件進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果

14、見(jiàn)表8表8 吸附流速考察結(jié)果吸附流速(ml·min-1)123芍藥苷洗脫量(mg)洗脫率(%)4.6 樹(shù)脂徑高比考察取直徑依次為1.4cm、1.5cm、1.6cm的樹(shù)脂柱3根，分別加入AB- 8型大孔吸附樹(shù)脂各20ml，裝柱(徑高比為1:6、1:8、1:10)，取樣液60ml上樣，吸附流速為1.0ml·min-1。然后用3BV水洗脫，再以5BV 20%乙醇洗脫，收集乙醇洗脫液，按4.3色譜條件進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)表9。表9 樹(shù)脂徑高比考察結(jié)果樹(shù)脂徑高比1:61:81:10芍藥苷洗脫量(mg)洗脫率(%)4.7 水洗除雜體積考察取AB- 8型大孔吸附樹(shù)脂四份，每份20ml，裝柱(

15、徑高比1:8)，取樣品液60ml上樣，吸附流速分別為1.0ml·min-1，進(jìn)行動(dòng)態(tài)吸附后，分別用1BV、2BV、3BV和4BV水洗，測(cè)定水洗脫液中芍藥苷的含量，計(jì)算損失率，結(jié)果見(jiàn)表10。表10水洗除雜體積考察結(jié)果·水洗脫體積(BV)1234水洗液中芍藥苷累積含量(mg)芍藥苷累積損失率(%)4.8 洗脫溶劑考察取AB- 8型大孔吸附樹(shù)脂4份，每份20ml，裝于樹(shù)脂柱中(徑高比為18)，60ml樣品液上樣，吸附流速分別為1.0ml·min-1。然后先以3BV水洗脫，再分別用20%、40%、60%和80%乙醇洗脫，按4.3色譜條件進(jìn)行測(cè)定醇洗脫液中芍藥苷含量，結(jié)果見(jiàn)

16、表11。表11洗脫溶劑考察結(jié)果洗脫劑乙醇(%)20406080芍藥苷洗脫量(mg)洗脫率(%)4.9 洗脫曲線取AB- 8型大孔吸附樹(shù)脂20ml，裝于樹(shù)脂柱中(徑高比為1:8)，60ml樣品液上樣，吸附流速分別為1.0ml·min-1。然后先以3BV水洗脫，再用20%乙醇洗脫，每10ml收集一份，洗脫液減壓至干，以10ml甲醇復(fù)溶，按4.3色譜條件進(jìn)行測(cè)定醇洗脫液中芍藥苷含量，繪制洗脫曲線，確定洗脫劑用量。5 赤芍中赤芍苷提取物的質(zhì)量控制5.1 性狀：棕褐色粉末，氣微香，味微苦、酸澀。5.2 鑒別：取本品粉末0.2g，加乙醇10ml，振搖5分鐘，濾過(guò)，濾液蒸干，殘?jiān)右掖?ml使溶解

17、，作為供試品溶液。另取芍藥苷對(duì)照品，加乙醇制成每1ml含2mg的溶液，作為對(duì)照品溶液。照薄層色譜法（通則0502）試驗(yàn)，吸取上述兩種溶液各4l，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以三氯甲烷-乙酸乙酯-甲醇-甲酸（40：5：10：0.2）為展開(kāi)劑，展開(kāi)，取出，晾干，噴以5%香草醛硫酸溶液，加熱至斑點(diǎn)顯色清晰。供試品色譜中，在與對(duì)照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同的藍(lán)紫色斑點(diǎn)。5.3 含量測(cè)定：照高效液相色譜法（通則0512）測(cè)定。5.3.1 色譜條件以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；以甲醇-0.05mol/L磷酸二氫鉀溶液（40:65）為流動(dòng)相；檢測(cè)波長(zhǎng)為230nm。理論板數(shù)按芍藥苷峰計(jì)算應(yīng)不低于3000。5

18、.3.2 對(duì)照品溶液的制備取經(jīng)五氧化二磷減壓干燥器中干燥36小時(shí)的芍藥苷對(duì)照品適量，精密稱定，加甲醇制成每1ml含0.5mg的溶液，即得。5.3.3 供試品溶液的制備取本品粉末約0.2g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇25ml，稱定重量，浸泡4小時(shí)，超聲處理20分鐘，放冷，再稱定重量，用甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得。5.3.4 測(cè)定法分別精密吸取對(duì)照品溶液與供試品溶液各10l，注入液相色譜儀，測(cè)定，即得。將提取物中芍藥苷含量換算成藥材中芍藥苷含量，對(duì)比藥典，檢查提取純化工藝是否合適。2015版中國(guó)藥典中規(guī)定赤芍藥材中含芍藥苷（C23H28O11）不得少于1.8%。5.

19、3.5 系統(tǒng)適用性試驗(yàn)線性關(guān)系考察 吸取上述對(duì)照品溶液1.0ml、1.5ml、2.0ml、2.5ml、3.0ml，分別置25ml量瓶?jī)?nèi)，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，分別精密吸取10l注入液相色譜儀分析。以進(jìn)樣量（g）為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線并進(jìn)行線性回歸，結(jié)果見(jiàn)表12：表12 線性關(guān)系考察結(jié)果芍藥苷對(duì)照品（ug)峰面積12345精密度試驗(yàn) 精密量取已知濃度的芍藥苷對(duì)照品溶液10l，按液相色譜條件，進(jìn)樣測(cè)定6次，結(jié)果見(jiàn)表13：表13 精密度試驗(yàn)結(jié)果峰面積值平均值RSD(%)123456穩(wěn)定性試驗(yàn) 取本品，制備供試品溶液，測(cè)定芍藥苷于0、2、4、6、8、10小時(shí)內(nèi)峰面積，結(jié)果見(jiàn)表14：表

20、14穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果時(shí)間（小時(shí)）峰面積值平均峰面積值RSD(%)0246810重復(fù)性試驗(yàn) 取本品，一式6份，制備供試品溶液，測(cè)定樣品中芍藥苷含量，結(jié)果見(jiàn)表15：表15重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果樣品量（g）芍藥苷含量（mg/g）平均含量（mg/g）RSD(%)123456加樣回收率試驗(yàn) 取已知含量芍藥苷的本品6份，每份約10mg，精密稱定，分別按樣品中芍藥苷含量精密加入芍藥苷對(duì)照品，按供試品溶液制備方法制得供試品溶液，精密量取續(xù)濾液10l，經(jīng)HPLC分析，測(cè)定芍藥苷含量，計(jì)算回收率，結(jié)果見(jiàn)表16：表16加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果取樣量（g）樣品中芍藥苷量（mg）芍藥苷對(duì)照品加入量（mg）芍藥苷測(cè)得量（mg）回收率（%

21、）平均回收率RSD(%)5.4 水分按中國(guó)藥典2015年版四部通則0832的第二法項(xiàng)下操作，取本品粉末約1g，平鋪于恒重的扁形稱量瓶中，厚度5mm，精密稱定，打開(kāi)瓶蓋100105，烘5小時(shí)，蓋好，移至干燥器中冷卻30分鐘，精密稱定，同樣溫度下在烘1小時(shí)移至干燥器中冷卻30分鐘，精密稱定。直至連續(xù)兩次稱定重量之差5mg為止。按減失重量和稱樣量計(jì)算供試樣品中水分含量（%）見(jiàn)表17。表17 水分含量樣品編號(hào)水分含量/%平均含量/%1235.5 熾灼殘?jiān)?按中國(guó)藥典2015年版四部通則0841進(jìn)行熾灼殘?jiān)臋z測(cè)，取本品粉末約1g，置已熾灼至恒重的坩堝中，精密稱定，緩緩織灼至完全炭化，放冷至室溫；加硫酸0.5ml使?jié)駶?rùn)，低溫加熱至硫酸蒸汽除盡后，在500600熾灼使完全灰化，移置干燥器內(nèi)，放冷至室溫，精密稱定后，再在500600熾灼至恒重。表18 熾灼殘?jiān)鼧悠肪幪?hào)熾灼殘?jiān)?%平均值/%1235.