蛋白質(zhì)的測定方法

1、蛋白質(zhì)的測定方法測定食物中的蛋白質(zhì)含量有二種方法，一是凱氏微量法，二是自動(dòng)定氮分析法。一凱氏微量法有手工滴定定氮和自動(dòng)定氮儀定氮，實(shí)驗(yàn)者可根據(jù)經(jīng)濟(jì)條件設(shè)備而定。1 .原理蛋白質(zhì)是含氮的有機(jī)化合物。食品與硫酸和催化劑一同加熱消化，使蛋白質(zhì)分解，分解的氨與硫酸結(jié)合生成硫酸銨。然后堿化蒸餾使氨游離，用過量硼酸吸收后再以硫酸或鹽酸標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定，根據(jù)酸的消耗量乘以換算系數(shù)，即為蛋白質(zhì)含量。2NH2 （ CH2） 2COOH+13H2SO4 （ NH4） 2SO4+6CO2+12SO2+16H2O（ NH4） 2SO4+2NaOH 2NH3+2H2O+Na2SO42 .方法本法參照GB 5009.5 -8

2、5適用于各類食品及飼料中蛋白質(zhì)的測定3 .試劑所有試劑均用不含氨的蒸餾水配制。試劑均為分析純。3.1 硫酸銅3.2 硫酸鉀3.3 濃硫酸3.4 2%硼酸溶液（或1%的硼酸）3.5 混合指示劑：1 份 0.1%甲基紅乙醇溶液與5 份 0.1%溴甲酚綠乙醇溶液臨用時(shí)混合。也可用 2 份 0.1%甲基紅乙醇溶與 1 份 0.1%次甲基藍(lán)乙醇溶液臨用時(shí)混合。3.6 飽和氫氧化鈉：500g 氫氧化鈉加入500ml 水中，攪拌溶解，冷卻后放置數(shù)日，澄清后使用。3.7 0.01mol/L 或 0.05mol/L 鹽酸標(biāo)準(zhǔn)溶液：需標(biāo)定后使用（配制及標(biāo)定方法見附錄）4 .儀器消化爐 凱氏定氮蒸餾裝置萬分之一電子

3、天平凱氏定氮蒸餾裝置：如圖所示5 . 操作步驟5.1 樣品處理：精密稱取0.12.0g 固體樣品或25g 半固體樣品或吸取液體樣品520ml ， 放入 100ml 或 500ml 凱氏燒瓶中，加入0.2g 硫酸銅，0.3g 硫酸鉀及320ml 濃硫酸，放置過夜后小心加熱，待內(nèi)容物全部炭化，泡沫完全停止后，加強(qiáng)火力，并保持瓶內(nèi)液體微沸，至液體呈藍(lán)綠色澄清透明后，取下放冷后用約210ml蒸儲(chǔ)水沖洗瓶壁，混勻后繼續(xù)加熱至液體呈藍(lán)綠透明，取下放冷，小心加 1020ml 水混勻 ， 放冷后，移入 100ml 容量瓶中，并用少量水洗定氮瓶，洗液并入容量瓶中，再加水至刻度，混勻備用。取與處理樣品相同量的硫酸

4、銅、硫酸鉀、硫酸按同一方法做試劑空白實(shí)驗(yàn)。5.2 按圖裝好定氮裝置，于水蒸氣發(fā)生瓶內(nèi)裝水至約2/3 處，加甲基紅指示液數(shù)滴及數(shù)毫升硫酸，以保持水呈酸性，加入數(shù)粒玻璃珠以防暴沸，加熱煮沸水蒸氣發(fā)生瓶內(nèi)的水。5.3 向接收瓶內(nèi)加入10ml ,12% 硼酸溶液及混合指示液1 滴，并使冷凝管的下端插入液面下，吸取10ml 樣品消化稀釋液由小玻璃杯流入反應(yīng)室，并以10ml 水洗滌小燒杯使之流入反應(yīng)室內(nèi)，塞緊小玻璃杯的棒狀玻璃塞。將310ml 飽和氫氧化鈉溶液倒入小玻璃杯中，提起玻璃塞使其緩緩流入反應(yīng)室，立即將玻璃塞蓋緊，并加水于小玻璃杯中以防漏氣。加緊螺旋夾，開始蒸餾。蒸氣通入反應(yīng)室使氨通過冷凝管而進(jìn)入

5、接收瓶內(nèi)，蒸餾2min ，移動(dòng)接收瓶，使冷凝管下端離開液面，然后用少量中性水沖洗冷凝管下端外部，再蒸餾1min 取下接收瓶，以0.01 或 0.05mol/L 鹽酸標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定至灰色或藍(lán)紫色為終點(diǎn)。同時(shí)吸取10ml 試劑空白消化液按5.3 操作。6 . 計(jì)算X = (V-V0 ) XCX 0.014 B/m 100 XF 式中：X 一 樣品中蛋白質(zhì)含量，g 100g；V 一 樣品消耗鹽酸標(biāo)準(zhǔn)液的體積，ml;V0 - 空白消化液消耗鹽酸標(biāo)準(zhǔn)液體積，ml;C 一 鹽酸標(biāo)準(zhǔn)液摩爾濃度,mol/L;0. 014 一 1mol/L 鹽酸標(biāo)準(zhǔn)液1 ml 相當(dāng)?shù)藬?shù).B 一 定容體積/取液量m 一樣品的質(zhì)量

6、，g;F 一氮換算為蛋白質(zhì)計(jì)算因子。蛋白質(zhì)的氮素含量不同，故換算因子不同。詳見下表。蛋白質(zhì)計(jì)算因子食 物 計(jì)算因子蛋，魚，肉及制品，禽類，玉米，高粱，豆類，水果和蔬菜類6.25乳及乳制品6.38大米 5.95小麥面 普通粉 5.70全麥，大麥，燕麥，裸麥,小米，小麥面全麥5.83小麥5.80黃豆5.71花生5.46芝麻，向日葵，核桃和榛子5.30麩皮6.317. 舉例設(shè)取樣品0.1000g,消化后稀釋至100 ml;。取10 ml樣品稀釋液，標(biāo)準(zhǔn)鹽酸為 0.01 mol/L ,空白滴定為0.12 ml; ，樣品滴定用去的標(biāo)準(zhǔn)鹽酸為3.21 ml; ，測得樣品中蛋白質(zhì)百分率為：(3.21-0.1

7、2 ) X0.01 X 0.014 X 10/0.01 義 100 X 6.25=(3.21-0.12 ) X 8.75 = 27.0%8. 附錄：( 1)標(biāo)準(zhǔn) HCl 溶液( 0.1 mol/L HCl )配制及標(biāo)定：配制：量取9毫升HCl,加適量水稀釋至1000毫升。標(biāo)定：精確稱取約0.15克左右在270300c干燥至恒重的基準(zhǔn)無水碳酸鈉，加50毫升水使之溶解，加 10 滴溴甲酚綠-甲基紅混合指示液，(量取30ml 0.2%溴甲酚綠乙醇溶液，加入20ml 0.1%甲基紅乙醇溶液，混勻)用配制的鹽酸滴定至溶液由綠色變紫紅色，煮沸 2min,冷卻至室溫，繼續(xù)滴定至溶液由綠色變?yōu)榘底仙?。同時(shí)做試

8、劑空白實(shí)驗(yàn)。( 2)計(jì)算：C = m(v-v0 ) X 0.0530C - HCl 標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液的實(shí)際濃度,mol/Lm - 基準(zhǔn)無水碳酸鈉的質(zhì)量,g;v - HCl 標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液用量,ml;vo - 試劑空白HCl 標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液用量,ml;0.0530-1.00 ml HCl 標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液C (HCl) =1mol/L相當(dāng)基準(zhǔn)無水碳鈉 g。0. 01mol/L HCl ：精確吸取標(biāo)定過的0.1mol/L HCl 10 ml ，準(zhǔn)確稀釋至100 毫升。必要時(shí)重新標(biāo)定濃度。9. 注意事項(xiàng):9.1 干樣用稱量紙稱重連紙一同消化，空白管同樣放稱量紙消化。9.2 含糖量高和油脂高的樣品消化時(shí)容易溢出，

9、加熱要緩慢。9.3 稀釋樣品時(shí)消化液過熱，加水反應(yīng)猛烈使樣品損失；消化液過冷，加水后鹽析不溶解。二、自動(dòng)定氮分析法1. 原理本方法為凱氏微量定氮法，將蛋白質(zhì)的氮素轉(zhuǎn)化成氨，與硫酸化合成硫酸銨，然后測定氨量。由此計(jì)算出氮素含量，再乘以相應(yīng)的系數(shù)即為蛋白質(zhì)含量?；瘜W(xué)反應(yīng)式如下：2NH2（CH22COOH+13 H2SO4（NH4）2 SO4+6CO2+12 SO2+16H2O（NH4）2 SO4+2NaOH2 NH3+2H2O + Na2SO42. 方法來源GB/T 6432-94 本法適用于各種食物和飼料的測定3. 儀器KJELTEC AUTO 1030 ANALYZE瑞典特卡托公司）40孔消化

10、爐4. 試劑本實(shí)驗(yàn)所用試劑皆為分析純，所用水皆為蒸餾水（ 1）濃硫酸98% H2SO4（ 2）凱氏片（催化劑）K2SO4 + Se（ 3） 40%氫氧化鈉溶液（NaOH） W/V（ 4）無水硫酸鈉Na2SO4（5） 1%月酸（H3BO4吸收液 稱取100g硼酸溶于10L水中。加入100ml澳鉀酚綠溶液，再加入 70ml 甲基紅溶液，最后加入3ml 4%氫氧化鈉溶液。（6） 0.1mol/L鹽酸（HCL標(biāo)準(zhǔn)溶液，標(biāo)定后使用。5. 操作步驟5.1 樣品消化：稱取一定量的樣品于消化管中（半固體樣品用稱量紙稱取），加一粒凱氏片于消化管中，然后加入5ml 濃硫酸，放置過夜，同時(shí)做樣品空白管。在消化過程中

11、，先用低溫消化（防止高溫消化時(shí)樣品溢出），低溫消化1 小時(shí)后，將溫度升到最高檔，至消化液無色透明。待消化液冷卻后，加入少量水沖洗消化管內(nèi)壁，振搖，以免內(nèi)壁粘有樣品以致消化不完全。然后于消化爐上再消化，直至液體無色透明。放置室溫后，加水至25ml,待測。5.2 樣品定氮：開啟1030自動(dòng)分析儀電源，輸入測定時(shí)的參數(shù)，打開STEAMK鈕，產(chǎn)生蒸氣5分鐘，同時(shí)調(diào)節(jié)蒸氣表，使蒸氣表的指針指到 NORMAL最后將消化管裝入，關(guān)閉安全門，開始自動(dòng) 定氮。當(dāng)CYCLE OVER亮?xí)r，記錄滴定結(jié)果，打開安全門，進(jìn)行下一個(gè)樣品測定。6. 計(jì)算蛋白質(zhì)（g/100g） = （V-V0） X 0.01401 X NX f/m X100V:樣品消耗鹽酸標(biāo)準(zhǔn)液的體積，ml;V0:試劑空白消耗鹽酸標(biāo)準(zhǔn)液的體積，ml ;N:鹽酸標(biāo)準(zhǔn)溶液的摩爾濃度，mol ;0.01401: 1mol鹽酸標(biāo)準(zhǔn)溶液1ml相當(dāng)于氮克數(shù)f ： 氮換算為蛋白質(zhì)的系數(shù)（一般樣品的系數(shù)為6.25）；m樣品的質(zhì)量，g;7. 注意事項(xiàng)7.1 對含糖高的樣品或油脂樣品在消化過程中必須先低溫消化，防止樣品溢出，消化所需時(shí)間較長。7.2 樣品的稱樣量不宜過多