熒光診斷技術(shù)在頭頸腫瘤早期診斷中的應(yīng)用

1、熒光診斷技術(shù)在頭頸腫瘤早期診斷中的應(yīng)用【摘要】 自身熒光診斷與光動(dòng)力學(xué)診斷是新型的腫瘤早期診斷方法，在各種腫瘤尤其是頭頸腫瘤的診斷和研究中，具有廣闊的發(fā)展前景及臨床意義?，F(xiàn)就其技術(shù)原理、組成、在腫瘤早期診斷中的運(yùn)用及發(fā)展前景作一綜述。 【關(guān)鍵詞】 光動(dòng)力學(xué)診斷 自身熒光 頭頸腫瘤 早期診斷 腫瘤嚴(yán)重威脅人類健康，早期診斷對(duì)提高患者的生存率和生活質(zhì)量有非常重要的意義。熒光診斷技術(shù)是淺表腫瘤早期診斷的一種方法，操作簡(jiǎn)單,靈敏度高，對(duì)確定手術(shù)切緣和發(fā)現(xiàn)重復(fù)癌有肯定的作用1。目前熒光診斷方法主要有兩種：自身熒光診斷法(autofluorescence，AF)，藥物熒光診斷法即光動(dòng)力學(xué)診斷 (photo

2、dynamic diagnosis，PDD) 。 1 AF/PDD系統(tǒng)的原理 AF是在一定波長(zhǎng)的激光激發(fā)下,處于激發(fā)態(tài)的分子在下降到基態(tài)的過程中,以光量子的形式釋放出它所吸收的能量即熒光。人體組織的蛋白質(zhì)、核酸和類脂化合物含有熒光團(tuán)，如FMN、NADH、NADPH、彈性蛋白、角蛋白等，光譜中的藍(lán)色光可激發(fā)熒光物質(zhì)發(fā)光。與相應(yīng)的正常組織相比,異常組織的物理、化學(xué)特性均發(fā)生變化，因而對(duì)應(yīng)的自體熒光光譜存在特異性差異，從而將腫瘤組織和正常組織區(qū)別開來25。 PDD是先向患者靜脈注射、吸入或局部灌注光敏劑，利用腫瘤組織對(duì)光敏劑的親和性，使原卟啉(protoporphyrin IX，PpIX)在腫瘤組織

3、中選擇性聚積68，一段時(shí)間后在病變組織和正常組織間形成顯著的濃度差，在特定波長(zhǎng)的激光照射下，病變組織發(fā)射出較強(qiáng)且具有特定波長(zhǎng)的熒光，而正常組織無此吸收峰或吸收峰很弱，而將腫瘤和正常組織區(qū)分開來。 1924年，Policard9首先認(rèn)識(shí)到腫瘤組織中存在的內(nèi)生性卟啉在紫外和藍(lán)光照射下產(chǎn)生熒光。1954年，Ronchese10在人類皮膚鱗癌的潰瘍面上觀察到了內(nèi)源性紅色熒光的存在。20HJ1.9mm世紀(jì)60年代早期，Ghadially等11發(fā)現(xiàn)了局限于腫瘤潰爛表面的亮紅色熒光，證實(shí)是由于微生物合成卟啉的結(jié)果，并且可以從腫瘤表面擦去，認(rèn)為在5ALA存在的情況下，壞死組織中的許多微生物能夠合成卟啉，產(chǎn)生紅

4、色熒光。1984年，Alfano等12首次用自身熒光系統(tǒng)將腫瘤組織與正常組織區(qū)別開來，隨著研究的深入，自身熒光逐漸應(yīng)用到臨床。 1942年，Auler等13觀察發(fā)現(xiàn)選擇性定位到細(xì)胞內(nèi)的熒光標(biāo)記物，并報(bào)道了卟啉對(duì)腫瘤組織的親和性和PDD用于提高惡性腫瘤診斷率的可能性。Leonard等14驗(yàn)證了靜脈內(nèi)應(yīng)用血卟啉混合物可診斷口腔、下咽和喉腫瘤，發(fā)現(xiàn)這種方法可以診斷黏膜癌，他們?cè)?9例黏膜癌中都觀察到特征性的紅色熒光；主要缺點(diǎn)是不能準(zhǔn)確判定腫瘤的邊界和用光敏劑后出現(xiàn)皮膚過敏。1972年，Dunn等15對(duì)54例上消化道腫瘤患者進(jìn)行四環(huán)素誘導(dǎo)熒光的有效性研究，表明四環(huán)素誘導(dǎo)的熒光能在腫瘤組織中有效聚集。1

5、990年，Kennedy等16首次提出用5ALA誘導(dǎo)PpIX熒光成像來診斷口腔黏膜的癌前病變和癌，認(rèn)為可能是具有腫瘤定位特性的熒光標(biāo)記物5ALA增加了血紅素合成酶的活性，導(dǎo)致PpIX在腫瘤組織的選擇性聚集。 1.1 光敏劑 光敏劑是進(jìn)行PDD的基礎(chǔ)，理想的光敏劑在腫瘤組織中特異性地聚積,而在正常組織中不蓄積或少蓄積。光敏劑可分三代:第一代為血卟啉類混合物(HpD), 是由8種成分組成的混合物，主要成分為雙血卟啉醚或酯，約占藥物總量的20% 30%，批準(zhǔn)上市的有光福啉(photofrin)和癌光啉(PSD)等。第一代光敏劑成分復(fù)雜，組織選擇性差，光動(dòng)力學(xué)效應(yīng)不穩(wěn)定，容易引起皮膚光過敏反應(yīng)，避光時(shí)

6、間長(zhǎng)，一般需1個(gè)月。第二代光敏劑為卟啉類衍生物或合成物，如二氫卟吩e6(chlorin e6)、間四羥基二氫卟酚（mTHPC）、血卟啉甲醚和5氨基乙酰乙酸(5ALA)等。與第一代相比其特點(diǎn)是成分均一，毒性??；在體內(nèi)代謝快，一般24?h代謝完畢；避光時(shí)間短，只需1?d左右，不易引起皮膚光敏反應(yīng)；組織選擇性較強(qiáng)，容易在腫瘤組織中聚集。第三代是一些修飾產(chǎn)物，如生物結(jié)合物（抗體結(jié)合物、脂質(zhì)體結(jié)合物等）和內(nèi)含光淬滅或光漂白特性的結(jié)合物，對(duì)腫瘤組織有更高的選擇性和特異性，處于實(shí)驗(yàn)研究階段。 理想的光敏劑應(yīng)該滿足以下幾個(gè)條件7：（1）成分單一；（2）在可見光的遠(yuǎn)紅外區(qū)有較大吸收峰；（3）能產(chǎn)生高的三重態(tài)的量

7、子場(chǎng)；（4）有很好的細(xì)胞毒素氧化酶生成能力；（5）對(duì)腫瘤組織有較強(qiáng)的選擇性；（6）沒有暗毒，所謂暗毒即在缺乏光線的情況下仍具有細(xì)胞毒性，對(duì)機(jī)體造成損害17,18。 1.2 光源和設(shè)備 AF激發(fā)光源系統(tǒng)為DLIGHTAF(Storz,德國(guó)),PDD光源系統(tǒng)為DLIGH(Storz,德國(guó))，二者均可用300?W短弧氙燈為光源，通過濾光片（=375 440?nm）過濾后以藍(lán)光源為激發(fā)光，攝像系統(tǒng)是高清晰度彩色三鏡片數(shù)碼系統(tǒng)（3CCD，Storz德國(guó)），內(nèi)鏡或熒光內(nèi)鏡，有的還需要顯微鏡設(shè)備?？赏ㄟ^一個(gè)腳踏開關(guān)來控制熒光和白光的切換。另外還需激光導(dǎo)光纖維等。 目前應(yīng)用的內(nèi)鏡熒光圖像系統(tǒng)主要是DLight

8、和LIFE系列。DLight系統(tǒng)（Storz, 德國(guó)）的激發(fā)波長(zhǎng)范圍為375 440?nm，通過特殊的濾波和處理可以獲得高彩色對(duì)比度的熒光圖像。在該系統(tǒng)中，熒光系統(tǒng)與常規(guī)白光系統(tǒng)可以轉(zhuǎn)換。LIFE系統(tǒng)（Xillix Corp,加拿大）以437?nm的藍(lán)光作為激發(fā)光源,熒光通過490 569?nm的綠色熒光和630?nm以上的紅色熒光這兩個(gè)隔離的通道檢測(cè)，經(jīng)處理后顯示圖像，在LIFE系統(tǒng)中，熒光檢測(cè)與常規(guī)內(nèi)鏡可以通過光源自由切換。 2 檢查方法及結(jié)果分析 進(jìn)行PDD之前,先對(duì)患者行光敏劑皮試，陰性后方可進(jìn)行，光敏劑溶液原則上現(xiàn)配現(xiàn)用，用不完的需避光保存。應(yīng)用方法有：（1）靜脈給藥，多用于頭頸、肺

9、、肝、腎等部位腫瘤的診斷，一般人的劑量10 36?mg/kg，動(dòng)物模型劑量為100 400?mg/kg，在給藥3?h后檢查；（2）口服給藥,多用于乳腺癌、肝癌及腦部腫瘤的診斷，用量為30 40?mg/kg，在用藥2 4?h后檢查；（3）霧化吸入，多用于咽喉、支氣管、肺等部位腫瘤的診斷，一般為1%的5ALA溶液，用藥30?min后檢查；（4）局部灌注，常用于膀胱腫瘤的檢查，一般為1% 3%的ALA溶液，多在用藥2?h后行熒光內(nèi)鏡檢查。AF系統(tǒng)可直接用熒光鏡檢查可疑部位。 結(jié)果分析主要分為熒光光譜技術(shù)和熒光圖像技術(shù)兩種，目前自身熒光診斷法以光譜分析為主，光動(dòng)力學(xué)診斷法采用圖像和非圖像處理方式。兩種

10、方法同時(shí)使用，可準(zhǔn)確地對(duì)病變定位，并根據(jù)檢查結(jié)果立即進(jìn)行活檢或治療, 操作十分方便。 3 AF/PDD系統(tǒng)在腫瘤早期診斷中的應(yīng)用 3.1 基底細(xì)胞癌 基底細(xì)胞癌是常見的皮膚惡性腫瘤，多發(fā)于頭頸部，靠活檢病理診斷。Ericson等192003年用5ALA誘導(dǎo)熒光診斷基底細(xì)胞癌，研究腫瘤組織和腫瘤周圍正常組織的熒光強(qiáng)度比值與光敏劑應(yīng)用時(shí)間的關(guān)系。40例患者被隨機(jī)分為4個(gè)不同光敏劑應(yīng)用時(shí)間組（1，2，3，4?h），將20%的光敏劑5ALA乳劑涂抹在腫瘤部位，厚約1?mm，光源為裝有濾光片水銀燈，提供波長(zhǎng)365 405?nm的激發(fā)光，照射時(shí)間4?s，總的照射強(qiáng)度0.5?mw/cm2。3?h后，腫瘤組織

11、和正常組織的熒光強(qiáng)度比值最大，此時(shí)行PDD最合適。Fritsch等20在光動(dòng)力學(xué)診斷的引導(dǎo)下成功切除了1例復(fù)發(fā)的多發(fā)性基底細(xì)胞癌，并獲得良好的美容效果。術(shù)后隨訪9個(gè)月無復(fù)發(fā)。 3.2 口腔癌 Chang等212005年局部應(yīng)用光敏劑光福啉（photofrin），通過光動(dòng)力學(xué)診斷口腔腫瘤。有20名患者（男19例，女1例， 30 82歲，平均53.7歲），用濃度為2.5?mg/ml Photofrin嗽口，3?h后進(jìn)行熒光和白光內(nèi)鏡檢查，每個(gè)患者在熒光內(nèi)鏡的指引下從4個(gè)不同的部位取活檢，立即行組織病理學(xué)檢查。結(jié)果表明，正常黏膜的熒光最弱，鱗癌的熒光最強(qiáng)，且正常黏膜與角化、鱗狀化生及鱗癌的熒光強(qiáng)度差

12、別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.000?1）；角化與鱗狀化生的熒光強(qiáng)度沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.027）,聯(lián)合應(yīng)用紅、綠、藍(lán)、灰4種成像模式，肉眼觀察的靈敏度為92.45%，特異度為95.65%，顯微觀察的靈敏度為93.75%，特異度為97.50%，認(rèn)為光動(dòng)力學(xué)是一種敏感、非侵襲、早期診斷口腔腫瘤的方法。 3.3 鼻咽癌 Ramaswamy等72005年將人類鼻咽癌細(xì)胞系CEN2移植到6 8周齡的balb/c雄性裸鼠，在實(shí)驗(yàn)前注入光敏劑，通過腫瘤細(xì)胞對(duì)光敏劑的聚積，能準(zhǔn)確區(qū)分腫瘤邊界。研究表明，光敏劑Fotolon(chlorin e6)能選擇性地停留在鼻咽癌中，它的熒光峰在注入光敏劑Fo

13、tolon 1?h后便在腫瘤組織中出現(xiàn)，在3?h和6?h時(shí)，F(xiàn)otolon在腫瘤組織的濃度分別是正常組織的8倍和28倍。有別于其他光敏劑之處是Fotolon能快速?gòu)捏w內(nèi)清除，在24?h內(nèi)有90% 98%的藥物從腫瘤和正常組織中清除，建議在用藥3?h后診斷。Qu等22用自身熒光診斷鼻咽癌，靈敏度和特異度分別為93%和92%，說明熒光內(nèi)鏡成像是診斷鼻咽癌的有效方法。 3.4 咽喉腫瘤 Csanády等62004年局部應(yīng)用5ALA后，用以短亞弧燈為光源的內(nèi)鏡照射檢查部位，被照射組織出現(xiàn)紅色熒光為陽性，綠色熒光為陰性。共檢查31例患者，包括13例喉癌，12例咽癌，4例黏膜白斑，2例聲帶息肉，

14、除1例慢性喉炎外，所有顯示紅色熒光的，經(jīng)病理學(xué)檢查均證實(shí)為鱗癌。聲帶息肉顯示綠色熒光。5ALA誘導(dǎo)PpIX熒光成像方法對(duì)腫瘤的靈敏度為96%，特異度為76%。13例喉癌在熒光內(nèi)鏡下用CO2激光切除，并用熒光內(nèi)鏡評(píng)估腫瘤切除邊界，術(shù)后只有1例復(fù)發(fā)，為T2期聲門癌。對(duì)4例癌前病變（喉白斑）的評(píng)估有爭(zhēng)議，因?yàn)椴±碜C實(shí)為慢性喉炎者也表現(xiàn)出了低強(qiáng)度（+）ALA熒光，過度角化、癌前病變（如白班）表現(xiàn)出沒有或低強(qiáng)度熒光（0或0/+）。到目前為止，局部應(yīng)用1% 5ALA溶液沒有發(fā)現(xiàn)副作用。熒光內(nèi)鏡技術(shù)用于咽、喉表淺腫瘤的早期診斷非常重要，它能發(fā)現(xiàn)黏膜病變并在早期階段（T1、T2）行內(nèi)鏡激光治療或放療。這種方法

15、的局限性是僅僅評(píng)估腫瘤較表淺的外侵范圍，因?yàn)锳LA的滲透深度在1?mm以內(nèi)。 3.5 喉癌 Arens等42004年等研究間接自身熒光喉內(nèi)鏡對(duì)喉癌及其先兆損害的診斷。以組織病理學(xué)診斷為標(biāo)準(zhǔn)，白光診斷準(zhǔn)確率為78%（n=90）,間接自身熒光為89%（n=103）。間接自身熒光喉內(nèi)鏡的靈敏度為90%，特異度為87%。表明間接自身熒光喉內(nèi)鏡是一種快速、可重復(fù)、無創(chuàng)傷和經(jīng)濟(jì)的成像技術(shù)，有利于發(fā)現(xiàn)和描繪癌前病變、原位癌和喉癌，和單獨(dú)應(yīng)用白光檢查相比更準(zhǔn)確。李勇等23用自身熒光內(nèi)鏡診斷早期喉癌及癌前病變，也得出了相似的結(jié)論，但由于炎癥、水腫和瘢痕的存在，降低了自身熒光內(nèi)鏡診斷的特異度。 Palasz等24

16、2003年通過自身熒光成像技術(shù)研究喉的正常和癌變組織。證實(shí)了自身熒光內(nèi)鏡相對(duì)于單用白光內(nèi)鏡，在早期喉癌的診斷上有高度的靈敏度和高度的特異度，分別為86.9%和82.8%。Zargi等2對(duì)喉惡性腫瘤、Betz等25對(duì)頭頸腫瘤的研究都獲得了相似結(jié)果。自身熒光成像在喉內(nèi)鏡中是一種非常有用的輔助診斷工具。 3.6 食管腫瘤 Mayinger等262001年用熒光內(nèi)鏡和白光內(nèi)鏡對(duì)比研究22例食管癌患者（男20，女2；13例T0N0M0，8例T1N0M0，1例T3N1M0），并以組織病理學(xué)診斷作為參照標(biāo)準(zhǔn)?；颊呖诜?ALA溶液，用量15?mg/kg，服藥6 7h后進(jìn)行PDD檢查。每個(gè)患者都進(jìn)行白光內(nèi)鏡、熒

17、光內(nèi)鏡和組織病理學(xué)檢查，共取活檢組織86塊。結(jié)果PDD的靈敏度為85%（17/20），特異度為53%，白光內(nèi)鏡的靈敏度為25%（5/20），特異度為94%，表明PDD有較高的靈敏度。食管炎癥和新生上皮在藍(lán)光激發(fā)下，也表現(xiàn)出紅色熒光，增加了PDD的假陽性率，降低了特異度。缺點(diǎn)是沒有采用盲法設(shè)計(jì)，樣本例數(shù)較少。伊力亞爾·復(fù)合丁等27用雄性日本白兔制作食管癌動(dòng)物模型，靜脈應(yīng)用光敏劑二氫卟酚e6（Npe6）,用半導(dǎo)體激光照射，研究光動(dòng)力學(xué)診斷較深部食管腫瘤的可行性。結(jié)果表明二氫卟酚e6用量為5.0?mg/kg，給藥6?h后行光動(dòng)力學(xué)診斷是可行的，能將腫瘤與周圍正常組織區(qū)別開來。 除頭頸腫瘤外

18、，熒光診斷技術(shù)還用于其他領(lǐng)域。Lipinski等28應(yīng)用檢測(cè)膀胱腫瘤抗原與光動(dòng)力學(xué)診斷兩種方法，對(duì)比研究經(jīng)病理學(xué)證實(shí)為復(fù)發(fā)的膀胱淺表腫瘤。膀胱灌注3%的5ALA溶液，2?h后行PDD檢查，81%的患者（35/43）試驗(yàn)結(jié)果陽性。由于PDD能更早發(fā)現(xiàn)新生物，使膀胱癌的復(fù)發(fā)率減少50%29，30，已廣泛用于臨床。Ludicke等31用PDD方法進(jìn)行卵巢癌動(dòng)物模型微轉(zhuǎn)移的實(shí)驗(yàn)研究，并比較PDD和標(biāo)準(zhǔn)白光內(nèi)鏡發(fā)現(xiàn)腹腔微轉(zhuǎn)移數(shù)量的多少。結(jié)果表明，PDD顯著高于白光內(nèi)鏡發(fā)現(xiàn)的轉(zhuǎn)移數(shù)量(P<0.01)，ALA誘導(dǎo)熒光成像發(fā)現(xiàn)癌變數(shù)是普通白光的2倍，更有利于發(fā)現(xiàn)腹腔微轉(zhuǎn)移病變。Banerjee等

19、32、Sheski等33回顧了近20年關(guān)于支氣管肺癌PDD診斷和治療的文獻(xiàn)，認(rèn)為PDD能明顯提高不典型增生和原位癌的發(fā)現(xiàn)率，缺點(diǎn)是假陽性率較高，需進(jìn)一步研究。Ladner等1研究乳腺腫瘤的光動(dòng)力學(xué)特點(diǎn)，認(rèn)為熒光診斷技術(shù)是用于術(shù)中診斷和指導(dǎo)腫瘤切除邊界的一種簡(jiǎn)便方法。 4 展 望 作為一種新興的腫瘤診斷方法，熒光診斷敏感性高,特異性強(qiáng)， 操作簡(jiǎn)單，是無創(chuàng)性診斷早期癌及其癌前病變的輔助性方法，尤其對(duì)于肉眼難以發(fā)現(xiàn)的微小癌變和不典型增生的早期診斷具有重大意義。但是PDD仍然存在皮膚對(duì)光敏劑的過敏問題，隨著新一代光敏劑的研制及用藥方式的改變，光敏性皮炎等副作用的發(fā)生率已大大減少；其次是特異性不高，導(dǎo)致

20、患者接受不必要的組織活檢或手術(shù)，增加了痛苦。AF熒光強(qiáng)度低，易受干擾，對(duì)腫瘤邊界分辨率較低，但無明顯副作用。將二者結(jié)合起來，根據(jù)不同的部位采用不同的方法，可提高診斷的準(zhǔn)確性，減少副作用?！緟⒖嘉墨I(xiàn)】 1 ZK(#Ladner DP, Steiner RA, Allemann J,et al. Photodynamic diagnosis of breast tumours after oral application of aminolevulinic acidJ. Br J Cancer, 2001, 84(1):3337.2 AKZargi M, Fajdiga I, AKSmid L.

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