實(shí)驗(yàn)四 花粉采集及生命力的測(cè)定

1、實(shí)驗(yàn)四實(shí)驗(yàn)四 花粉貯藏及花粉花粉貯藏及花粉生活力的測(cè)定生活力的測(cè)定 花期不遇給雜交工作造成困難，花期不遇給雜交工作造成困難，有的園林植物可通過(guò)調(diào)整花期來(lái)有的園林植物可通過(guò)調(diào)整花期來(lái)解決，有的則不得不進(jìn)行花粉貯解決，有的則不得不進(jìn)行花粉貯藏，或者從外地寄運(yùn)花粉。為了藏，或者從外地寄運(yùn)花粉。為了避免雜交工作失誤，在使用外地避免雜交工作失誤，在使用外地寄來(lái)的花粉或經(jīng)過(guò)一段時(shí)間貯藏寄來(lái)的花粉或經(jīng)過(guò)一段時(shí)間貯藏的花粉之前，必須對(duì)花粉的生活的花粉之前，必須對(duì)花粉的生活力進(jìn)行檢測(cè)，以便對(duì)雜交結(jié)果進(jìn)力進(jìn)行檢測(cè)，以便對(duì)雜交結(jié)果進(jìn)行分析與研究。因此我們必須掌行分析與研究。因此我們必須掌握花粉貯藏及花粉生活力測(cè)定的

2、握花粉貯藏及花粉生活力測(cè)定的原理和技術(shù)原理和技術(shù) 。（為什么貯藏花。（為什么貯藏花粉？）粉？）一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康囊弧?shí)驗(yàn)?zāi)康?掌握花粉貯藏及花粉生命力鑒定的方法和原理。 二、實(shí)驗(yàn)材料二、實(shí)驗(yàn)材料 月季、百合、一串紅、矮牽牛、油茶等植物的花粉。 三、儀器及藥品三、儀器及藥品 載玻片、蓋玻片、解剖針、鑷子、毛筆、干燥器、小指形管、標(biāo)簽、記號(hào)筆、顯微鏡、天平、燒杯、培養(yǎng)皿、滴管、玻璃棒、量筒、電爐、石棉網(wǎng)、冰箱； 凡士林、無(wú)水氯化鈣、蔗糖、瓊脂、蒸餾水、硼酸、磷酸二氫鉀、磷酸氫二鈉、碘、碘化鉀、氯化二苯基四氮唑（ TTC ）。四、實(shí)驗(yàn)原理四、實(shí)驗(yàn)原理 花粉在低溫（低溫（ 0 2 ）、干燥、黑暗）、干燥、黑

3、暗等條件下代謝強(qiáng)度降低，花粉貯藏的原理就是要?jiǎng)?chuàng)造這樣低代謝的環(huán)境條件，從而延長(zhǎng)花粉的壽命。 花粉的形態(tài)、花粉中酶的活性以及積累淀粉的多少（淀粉質(zhì)花粉）通常與其生活力密切相關(guān)，因此可以利用花粉的形態(tài)觀察、過(guò)氧化物酶、脫氫酶的活性高低（呼吸）、淀粉的含量以及在人工培養(yǎng)基上花粉管萌發(fā)的情況作為鑒定花粉生活力高低的標(biāo)準(zhǔn)。 鑒定花粉生活力的方法很多，概括起來(lái)主要有如鑒定花粉生活力的方法很多，概括起來(lái)主要有如下幾種：下幾種： 1 直接測(cè)定法直接測(cè)定法 ： 將待測(cè)花粉直接授粉，然后統(tǒng)計(jì)將待測(cè)花粉直接授粉，然后統(tǒng)計(jì)結(jié)實(shí)情況。此法最準(zhǔn)確，但需時(shí)較長(zhǎng)，且實(shí)驗(yàn)結(jié)果結(jié)實(shí)情況。此法最準(zhǔn)確，但需時(shí)較長(zhǎng)，且實(shí)驗(yàn)結(jié)果易受氣候

4、條件的影響。也可在授粉后隔一定時(shí)間切易受氣候條件的影響。也可在授粉后隔一定時(shí)間切下柱頭，在顯微鏡下下柱頭，在顯微鏡下壓片檢查花粉的萌發(fā)壓片檢查花粉的萌發(fā)情況，根情況，根據(jù)萌發(fā)率的高低來(lái)鑒定花粉的生活力。據(jù)萌發(fā)率的高低來(lái)鑒定花粉的生活力。 2 形態(tài)觀察法形態(tài)觀察法 直接在顯微鏡下觀察花粉的形態(tài)，根據(jù)品直接在顯微鏡下觀察花粉的形態(tài)，根據(jù)品種花粉的典型性（如具有正常的大小、形狀、種花粉的典型性（如具有正常的大小、形狀、色澤等）判斷花粉的生活力，即形態(tài)正常的色澤等）判斷花粉的生活力，即形態(tài)正常的花粉有生活力，而一些花粉有生活力，而一些小的、皺縮的、畸形小的、皺縮的、畸形的花粉的花粉不具有生活力。此法簡(jiǎn)

5、便易行但準(zhǔn)確不具有生活力。此法簡(jiǎn)便易行但準(zhǔn)確性差，一般只用于測(cè)定新鮮花粉的生活力。性差，一般只用于測(cè)定新鮮花粉的生活力。 3 染色觀察法染色觀察法 （對(duì)二萘氧基聯(lián)苯胺對(duì)二萘氧基聯(lián)苯胺） （1）過(guò)氧化物酶測(cè)定法）過(guò)氧化物酶測(cè)定法 原理：具有生活力的花粉含有活躍的過(guò)氧化物酶。原理：具有生活力的花粉含有活躍的過(guò)氧化物酶。此酶能利用過(guò)氧化物使各種多酚及芳香族胺發(fā)生氧此酶能利用過(guò)氧化物使各種多酚及芳香族胺發(fā)生氧化而產(chǎn)生顏色，依據(jù)顏色可知花粉有無(wú)活力?；a(chǎn)生顏色，依據(jù)顏色可知花粉有無(wú)活力。 步驟和方法：步驟和方法：先在載玻片上加少量待測(cè)花粉，然先在載玻片上加少量待測(cè)花粉，然后在花粉上滴試劑后在花粉上滴試

6、劑和試劑和試劑各一滴，仔細(xì)攪勻，各一滴，仔細(xì)攪勻，蓋上蓋玻片，經(jīng)蓋上蓋玻片，經(jīng)34分鐘后，再放在顯微鏡下檢查，分鐘后，再放在顯微鏡下檢查，有生活力的花粉呈紅色或玫瑰色，無(wú)生活力的花粉有生活力的花粉呈紅色或玫瑰色，無(wú)生活力的花粉為黃色或無(wú)色，為了確定具有生活力的花粉百分率，為黃色或無(wú)色，為了確定具有生活力的花粉百分率，要連續(xù)觀察要連續(xù)觀察35個(gè)視野，求其平均值，將觀察結(jié)果個(gè)視野，求其平均值，將觀察結(jié)果填入表內(nèi)。填入表內(nèi)。3 染色觀察法染色觀察法 （2）碘碘-碘化鉀碘化鉀染色法染色法 原理：正常的花粉積累淀粉較多，而不正常的花原理：正常的花粉積累淀粉較多，而不正常的花粉則少。據(jù)此，可用化學(xué)物質(zhì)染色

7、，根據(jù)呈色反應(yīng)粉則少。據(jù)此，可用化學(xué)物質(zhì)染色，根據(jù)呈色反應(yīng)來(lái)間接測(cè)定花粉的正常與否和花粉生活力的差別。來(lái)間接測(cè)定花粉的正常與否和花粉生活力的差別。通常正?；ǚ塾猛ǔＵ；ǚ塾肐-KI染色后呈藍(lán)色，而發(fā)育不良畸形染色后呈藍(lán)色，而發(fā)育不良畸形花粉則不積累淀粉，當(dāng)花粉則不積累淀粉，當(dāng)I-KI染色時(shí)呈黃褐色。染色時(shí)呈黃褐色。 步驟和方法步驟和方法：取花粉撒于載玻片上，加一滴蒸餾：取花粉撒于載玻片上，加一滴蒸餾水，用鑷子使花粉散開，再加一滴水，用鑷子使花粉散開，再加一滴I-KI溶液，蓋上蓋溶液，蓋上蓋玻片置于顯微鏡下觀察，凡被染色呈藍(lán)色表示具有玻片置于顯微鏡下觀察，凡被染色呈藍(lán)色表示具有生活力，呈黃褐色

8、者為發(fā)育不良生活力弱的花粉。生活力，呈黃褐色者為發(fā)育不良生活力弱的花粉。3 染色觀察法染色觀察法 （3）氯化三苯基四氮唑（）氯化三苯基四氮唑（TTC）法）法 原理：凡具有生活力的花粉，在其呼吸作用過(guò)程原理：凡具有生活力的花粉，在其呼吸作用過(guò)程中都有氧化還原反應(yīng)，而無(wú)生活力的花粉則無(wú)此反中都有氧化還原反應(yīng)，而無(wú)生活力的花粉則無(wú)此反應(yīng)，因此當(dāng)應(yīng)，因此當(dāng)TTC滲入有生活力的花粉時(shí)，花粉中的滲入有生活力的花粉時(shí)，花粉中的脫氫酶在催化去氫過(guò)程中與脫氫酶在催化去氫過(guò)程中與TTC結(jié)合，使無(wú)色的結(jié)合，使無(wú)色的TTC變成三苯基甲（變成三苯基甲（TTF）而呈紅色。）而呈紅色。 步驟和方法步驟和方法：取少量花粉放在

9、載玻片上，在花粉：取少量花粉放在載玻片上，在花粉上滴上滴12滴滴TTC溶液，用鑷子使其混勻后，蓋上蓋溶液，用鑷子使其混勻后，蓋上蓋玻片。將此載玻片上置于恒溫箱中（玻片。將此載玻片上置于恒溫箱中（3540）約）約1520分鐘，在顯微鏡（分鐘，在顯微鏡（100倍）下觀察。凡有生倍）下觀察。凡有生活力的花粉粒呈紅色，其次呈淡紅色，失去生活力活力的花粉粒呈紅色，其次呈淡紅色，失去生活力的和不育的花粉粒表現(xiàn)無(wú)色。的和不育的花粉粒表現(xiàn)無(wú)色。4 培養(yǎng)基發(fā)芽法培養(yǎng)基發(fā)芽法 在培養(yǎng)基上進(jìn)行花粉的人工萌發(fā)，在培養(yǎng)基上進(jìn)行花粉的人工萌發(fā)，鑒定待測(cè)花粉萌發(fā)率的高低。此法若鑒定待測(cè)花粉萌發(fā)率的高低。此法若采用適宜的培養(yǎng)

10、基能較精確地測(cè)定出采用適宜的培養(yǎng)基能較精確地測(cè)定出花粉的生活力，但不同植物的花粉萌花粉的生活力，但不同植物的花粉萌發(fā)條件存在較大的差異，所以很多時(shí)發(fā)條件存在較大的差異，所以很多時(shí)候測(cè)定的結(jié)果也只是相對(duì)可靠。候測(cè)定的結(jié)果也只是相對(duì)可靠。五、實(shí)驗(yàn)步驟：五、實(shí)驗(yàn)步驟： 花粉的貯藏花粉的貯藏 （）將采集的花粉進(jìn)行干燥（涼干或放入盛有無(wú)水氯化鈣的干燥器中干燥），一般以花粉不相互黏結(jié)為度。 （）將干燥的花粉裝在指形管中（不要太多，一般以五分之一體積或更少為宜），瓶口塞以紗布，瓶外貼以標(biāo)簽，注明花粉種類、采收日期。 （）將指形管放入無(wú)水氯化鈣控制一定濕度的干燥器中，干燥器置于0 2 的冰箱內(nèi)。 花粉生活力的

11、測(cè)定：花粉生活力的測(cè)定： （）染色觀察法 TTC 和KI染色法 分別配制 TTC 和KI染色液各100ml，裝入棕色瓶中備用。 制片：取少量花粉于載玻片上，滴入 1 2 滴 0.5 TTC 或KI染色液，用鑷子攪拌均勻，蓋上蓋玻片，于 35 40 條件下凈置 15 20min 。 觀察統(tǒng)計(jì)：在顯微鏡下觀察三個(gè)不同的視野，凡被TTC染成紅色或玫瑰紅的都是有生活力的花粉，黃色或不著色者為沒有生活力的花粉；被KI染成藍(lán)色者表示具有生活力，花粉呈黃褐色者不具有生活力。 六、作業(yè)及思考題：六、作業(yè)及思考題： 1.繪一幅花粉粒發(fā)芽形態(tài)圖。繪一幅花粉粒發(fā)芽形態(tài)圖。 2.按下表統(tǒng)計(jì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果。 TTC染色（KI

12、染色）統(tǒng)計(jì)結(jié)果 花粉來(lái)源各視野中花粉粒數(shù)量及生活力平均生活力()花粉總數(shù)其中花粉總數(shù) 其中 花粉總數(shù) 其中 紅色黃色生活力紅色黃色生活力紅色黃色生活力月季（）培養(yǎng)基發(fā)芽法（）培養(yǎng)基發(fā)芽法 固體培養(yǎng)基固體培養(yǎng)基 配制培養(yǎng)基：稱取 1g 瓊脂， 5g 蔗糖，量取 94ml 蒸餾水，裝入燒杯，加熱使瓊脂融化呈透明狀（注意補(bǔ)充水分，以保持培養(yǎng)基的濃度），即配成 5% 濃度的培養(yǎng)基。同法配制 10% 、 15% 、 20% 濃度的培養(yǎng)基。 制片：用滴管吸取少量培養(yǎng)基，趁熱滴在載玻片的凹槽內(nèi)，放置片刻，使其凝固。 播種花粉：將少量花粉均勻地撒播在培養(yǎng)基上，注意不可過(guò)多，否則難以觀察。 培養(yǎng)：將制備好的片子

13、放在墊有濕潤(rùn)濾紙的培養(yǎng)皿內(nèi)，于 20 22 的溫箱中培養(yǎng)；觀察：待花粉萌發(fā)后于顯微鏡下觀察并統(tǒng)計(jì)發(fā)芽率。觀察時(shí)每片隨機(jī)取三個(gè)視野，統(tǒng)計(jì)花粉總數(shù)及發(fā)芽數(shù)，計(jì)算平均萌發(fā)率（花粉總數(shù)不少于 100 粒）。 六、作業(yè)及思考題：六、作業(yè)及思考題： 、按下表統(tǒng)計(jì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果。、繪一幅花粉粒發(fā)芽形態(tài)圖。 染色法測(cè)定結(jié)果記載表染色法測(cè)定結(jié)果記載表 花粉來(lái)源各視野中花粉粒數(shù)量及生活力平均生活力()花粉總數(shù)其中花粉總數(shù) 其中 花粉總數(shù) 其中 紅色黃色生活力紅色黃色生活力紅色黃色生活力貯藏新鮮培培養(yǎng)養(yǎng)基基法法測(cè)測(cè)定定結(jié)結(jié)果果記記載載表表 花粉來(lái)源培養(yǎng)基濃度各視野中花粉粒數(shù)量及發(fā)芽率平均生活力()123發(fā)芽數(shù)/總數(shù)發(fā)芽率

14、發(fā)芽數(shù)/總數(shù)發(fā)芽率發(fā)芽數(shù)/總數(shù)發(fā)芽率貯藏0%5%10%15%20%新鮮 配制配制對(duì)二萘氧基聯(lián)苯胺對(duì)二萘氧基聯(lián)苯胺:a0.2克聯(lián)苯胺溶于克聯(lián)苯胺溶于100毫升毫升50%的酒精溶液；的酒精溶液； b0.15克克a-萘酚溶于萘酚溶于100毫升毫升50%酒精溶液；酒精溶液； c0.25克的碳酸鈉溶解在克的碳酸鈉溶解在100毫升的蒸餾水中。毫升的蒸餾水中。 以上三種溶液分別放入棕色瓶中備用，使用以上三種溶液分別放入棕色瓶中備用，使用時(shí)將這三種溶液等量配成試劑時(shí)將這三種溶液等量配成試劑，放入棕色滴瓶，放入棕色滴瓶中備用，在使用前準(zhǔn)備好中備用，在使用前準(zhǔn)備好0.3%的過(guò)氧化氫水溶的過(guò)氧化氫水溶液作為試劑液作為試劑。配制配制 TTC 染色液染色液： 稱取稱取 0.5g TTC 溶于溶于 100ml 磷酸鹽緩沖液磷酸鹽緩沖液中，裝入棕色瓶備用。中，