間接免疫熒光檢測PBMC

1、2021/8/61 間間 接接 免免 疫疫 熒熒 光光-檢測人外周血單個核細(xì)胞檢測人外周血單個核細(xì)胞武漢大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院武漢大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院免疫學(xué)教研室免疫學(xué)教研室熊熊 潔潔2021/8/62原原 理理 間接免疫熒光法是用熒光素標(biāo)記間接免疫熒光法是用熒光素標(biāo)記Ab2以檢測以檢測Ag或或Ab的一種實驗技術(shù)。其原理是的一種實驗技術(shù)。其原理是Ag首先與首先與Ab1結(jié)合，然后結(jié)合，然后Ab1再與熒光素標(biāo)記的再與熒光素標(biāo)記的Ab2結(jié)合，結(jié)合，形成一個形成一個Ag- Ab1-熒光素標(biāo)記熒光素標(biāo)記Ab2的三分子復(fù)合的三分子復(fù)合物，在熒光顯微鏡下呈現(xiàn)熒光。物，在熒光顯微鏡下呈現(xiàn)熒光。2021/8/63 外周血單個

2、核細(xì)胞分離外周血單個核細(xì)胞分離 - - 葡蔗糖葡蔗糖- -泛影葡胺密度梯度離心法泛影葡胺密度梯度離心法 原理原理 外周血單個核細(xì)胞（外周血單個核細(xì)胞（PBMC）包括淋巴細(xì)胞、單）包括淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞，其體積、形狀和比重與其他細(xì)胞不同。紅核細(xì)胞，其體積、形狀和比重與其他細(xì)胞不同。紅細(xì)胞和多核細(xì)胞比重較大，為細(xì)胞和多核細(xì)胞比重較大，為1.092左右，而淋巴細(xì)左右，而淋巴細(xì)胞和單核細(xì)胞比重為胞和單核細(xì)胞比重為1.075左右。利用比重為左右。利用比重為1.077左左右的分層液作密度梯度離心，使一定比重的細(xì)胞按右的分層液作密度梯度離心，使一定比重的細(xì)胞按密度梯度分布，從而將各種血細(xì)胞加以分離。密度梯度

3、分布，從而將各種血細(xì)胞加以分離。2021/8/64 材料材料 1、淋巴細(xì)胞分層液（葡蔗糖、淋巴細(xì)胞分層液（葡蔗糖-泛影葡胺，比重為泛影葡胺，比重為1.0770.001g/L） 2、 2臺盼藍(lán)染液臺盼藍(lán)染液 3、 Hanks液或者液或者RPMI-1640培養(yǎng)基培養(yǎng)基 4、試管、吸管、水平離心機等、試管、吸管、水平離心機等2021/8/65 方法方法 1、無菌采集靜脈血、無菌采集靜脈血2ml注入盛有注入盛有2ml Hanks液液（含（含100u/ml肝素）的試管中，混勻。肝素）的試管中，混勻。2、吸取淋巴細(xì)胞分層液吸取淋巴細(xì)胞分層液2ml加入離心管中，再將加入離心管中，再將稀釋抗凝血液小心沿管壁加

4、至分層液上，應(yīng)注稀釋抗凝血液小心沿管壁加至分層液上，應(yīng)注意保持兩者界面清晰。（關(guān)鍵）意保持兩者界面清晰。（關(guān)鍵）3、室溫、室溫2000rmin離心離心20min。管內(nèi)可分為四層。管內(nèi)可分為四層。2021/8/662021/8/674、用毛細(xì)吸管輕輕吸出乳白色的單個核細(xì)胞，加、用毛細(xì)吸管輕輕吸出乳白色的單個核細(xì)胞，加入另一支已含有入另一支已含有2-5mlHanks液的離心管中，液的離心管中，混勻?；靹?。5、室溫下，、室溫下，1500rpm離心離心10min。2021/8/686、棄上清，重復(fù)洗滌一次。、棄上清，重復(fù)洗滌一次。 用完全用完全RPMI-1640 1ml定容，計數(shù)細(xì)胞，調(diào)整細(xì)定容，計數(shù)

5、細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度。胞濃度。 一般每一般每ml血可分離出血可分離出1-2106個單個核細(xì)胞。個單個核細(xì)胞。7、細(xì)胞活力檢查、細(xì)胞活力檢查 取取1滴細(xì)胞懸液加滴細(xì)胞懸液加1滴滴2%臺盼藍(lán)染液，作濕片高臺盼藍(lán)染液，作濕片高倍鏡檢，計算活細(xì)胞百分率?；罴?xì)胞不著色，死倍鏡檢，計算活細(xì)胞百分率。活細(xì)胞不著色，死細(xì)胞染成藍(lán)色。一般活性應(yīng)在細(xì)胞染成藍(lán)色。一般活性應(yīng)在95以上。以上。2021/8/69材材 料料1. Ag PBMC2. Ab1 兔抗人白細(xì)胞血清兔抗人白細(xì)胞血清 (Ab1)3. Ab2 FITC-抗兔單克隆抗體抗兔單克隆抗體 (Ab2)4. 洗滌液洗滌液5. 熒光顯微鏡熒光顯微鏡2021/8/610方方 法法1.制備抗原片制備抗原片: 吸管取吸管取1滴滴PBMC液體（約液體（約10ul）滴加到標(biāo)本片）滴加到標(biāo)本片黑色圈圈背面中央黑色圈圈背面中央, 靜止靜止5-10分鐘，待分鐘，待PBMC干干燥。燥。 2. 15 ul Ab1 加入玻片上加入玻片上37孵育孵育30 min。 PBS洗洗3次次(3min/次次)。2021/8/6113. 玻片上加玻片上加15 ml 熒光二抗熒光二抗 (Ab2) 濕盒內(nèi)濕盒內(nèi)37孵育孵育30 min。PBS洗洗3次次(同上同上,避光操作避光操作)4. 用