密度梯度離心法分離葉綠體(共3頁)

1、精選優(yōu)質(zhì)文檔-傾情為你奉上報告成績 實時記錄成績 實驗六 密度梯度離心法分離葉綠體學(xué)生姓名 學(xué)號 班級 座位號： 同組同學(xué) 日期： 年 月 日備注： 【Introduction】（1）組織細胞破碎的方法和原理：細胞破碎是采用一定的方法，在一定程度上破壞細胞壁和細胞膜，使細胞內(nèi)容物包括目的產(chǎn)物釋放出來的技術(shù)。破碎方式有機械法和非機械法。機械法是使用物理的方法破壞細胞膜或細胞壁結(jié)構(gòu)，處理量大，破碎效率高，速度快，但是容易使不穩(wěn)定產(chǎn)品變性失活。包括了研磨法、珠磨破碎法、超聲波法、高壓勻漿法、X-Press法等。非機械法則使用了化學(xué)的方法，較溫和，有一定選擇性，但效率較低。包括了滲透壓法、酶解法、增溶

2、法、脂溶法、堿處理法等。（2）離心機使用中的注意事項：離心技術(shù)里的顆粒沉降速度受到重力、固液相對密度的差別、顆粒的大小形狀、沉降介質(zhì)的粘滯力和離心場的大小等因素影響，使用時必須事先在天平上精確平衡離心管和其內(nèi)容物。離心過程中不得隨意離開，液體不得裝得過多防止甩出，造成轉(zhuǎn)頭不平衡、生銹或被腐蝕。若要在低溫下離心，轉(zhuǎn)頭在使用前應(yīng)放置在冰箱預(yù)冷。另外，每個轉(zhuǎn)頭各有其最高允許轉(zhuǎn)速和使用期限，不得過速使用。（3）簡述密度梯度離心的原理：密度梯度離心法，是用一定的介質(zhì)在離心管內(nèi)形成一連續(xù)或不連續(xù)的密度梯度，通過重力或離心力場的作用使細胞分層、分離。最常用的介質(zhì)為蔗糖等。密度梯度離心法精確度比差速離心法大，

3、但是操作起來較繁瑣，需要一定技巧?！綧aterials & methods】 實驗儀器：復(fù)式雙筒顯微鏡（帶油鏡）；Motic數(shù)碼互動系統(tǒng)；擦鏡紙/蓋玻片；載玻片/鑷子；記號筆；小片濾紙；移液器/吸頭；香柏油/二甲苯；1.5和 5ml離心管；低溫高速離心機（角轉(zhuǎn)子）。實驗材料：菠菜葉。試劑：0.35M NaCl，蔗糖溶液（0.5M/150g/L、1.5M/500g/L）。（1）組織破碎勻漿：洗凈菠菜葉擦去水分，去莖每班稱取6g4預(yù)冷的試劑瓶中吸取20ml 0.35M NaCl加到冰浴的攪拌機葉片剪碎至攪拌機容器中打開電源，高速切碎葉片20S，冰浴冷卻1m再反復(fù)操作2次，共攪碎60s過濾至

4、冰浴的小燒杯中。（2）離心分離：吸取勻漿液2mL至2mL離心管4，500rpm，離心10min制備密度梯度管吸取離心后溶液400uL緩緩加入密度梯度離心管4，8000rpm，離心20min。（3）顯微鏡觀察：取出離心管輕輕吸出中間綠色薄帶加入新的1.5mL離心管中取20uL至干凈載玻片蓋上蓋玻片顯微鏡40倍鏡或油鏡下觀察。【Results】滴片后在顯微鏡40倍鏡下可以觀察到：有許多綠色、橄欖形的細胞器，即為葉綠體，數(shù)量較多，密度較大。【Discussion】1. 討論實驗中進行細胞器分離純化的注意事項。答：為了保持葉綠體的活性，本實驗需要一直維持在冰浴或4環(huán)境中。使用離心機的時候，由于離心時產(chǎn)

5、生很大的離心力，必須事先在天平上精確平衡離心管和其內(nèi)容物。吸取上清液時應(yīng)將離心管略微傾斜，將槍頭輕靠在管壁內(nèi)且從溶液上方開始緩慢吸出液體，不要使液體渾濁；密度梯度離心加入上層低密度液體時，也應(yīng)將槍頭輕靠上側(cè)液面管壁上緩慢加入液體，加完后上下層液體應(yīng)有明顯界限。2. 若鏡檢實驗結(jié)果不理想，請分析原因？答：如果葉綠體偏少，可能是溫度沒有控制在4攝氏度左右，使葉綠體失活；或者離心后晃動了又將溶液混合起來了；或者密度梯度沒有做好，分層不明顯。如果葉綠體偏多，可以做適當?shù)南♂尅！綫uestions】1. 若分離純化線粒體和細胞核，應(yīng)如何操作？答：動物的細胞膜脆弱，易受滲透壓沖擊而破碎。如果要分離純化線粒

6、體和細胞核，要將剪碎的組織包括液體移入勻漿器，收集濾液并離心、密度梯度離心，然后用分別用健那綠染液和改良苯酚品紅染液染色，這樣才能觀察到藍綠色的線粒體和紫紅色的細胞核。2若用吖啶橙染色葉綠體分離液，會出現(xiàn)什么現(xiàn)象，解釋為什么細胞核的吖啶橙染色與葉綠體的吖啶橙染色不同。答：用吖啶橙染色后，葉綠體發(fā)出桔紅色熒光，細胞核可發(fā)出綠色熒光。吖啶橙是一種熒光色素，與細胞中DNA和RNA結(jié)合量存在差別，可發(fā)出不同顏色的熒光（即著色特異性），這是由于DNA是個高度聚合物，吸收熒光物質(zhì)的位置較少，發(fā)綠色熒光，而RNA聚合度低，能和熒光物質(zhì)結(jié)合的位置多，故發(fā)紅色熒光。1【References】1 李沂軒,紀巖文.

7、 吖啶橙染色方法檢查線索細胞. 中國皮膚性病學(xué)雜志. 2005年第11期.實驗六 密度梯度離心法分離葉綠體（錯誤）學(xué)生姓名 學(xué)號 班級 座位號： 同組同學(xué) 日期： 年 月 日備注： 【Real-time Record】流程具體步驟備注1破碎勻漿(1) 每組稱取新鮮綠葉1g干凈小燒杯移液槍吸取4ml 0.25M蔗糖緩沖液將組織剪成約1mm3小塊。(2)將剪碎的組織包括液體移入勻漿器的外管中再將內(nèi)管插入外管中，緩慢而均勻地施力，上下旋轉(zhuǎn)拉動，勻漿7-10分鐘六層紗布過濾回洗凈的原燒杯中。(3)每組取1個5ml離心管，加入勻漿液2ml。2離心分離2ml勻漿離心(2000rpm,10m) 上清U1轉(zhuǎn)入燒杯(1)沉淀D1懸浮(加2ml 0.25M蔗糖)離心(3000rpm,10m) 上清U2轉(zhuǎn)入燒杯沉淀D2懸浮(加1ml 0.34M蔗糖)制梯度液(0.8ml 0.88M蔗糖)離心(4000rpm,15m)沉淀D3(2)上清U1和U2混合物分裝2x1.5ml離心(5000rpm, 10m) 沉淀D4 上清2x1.2ml離心(10000rpm,10m)沉淀D5懸浮(加0.5ml 0.25M蔗糖)6 染色鏡檢(1) 線粒體染色：10l沉淀D5懸浮液涂片1