藥品微生物限度檢驗(yàn)方法規(guī)范標(biāo)準(zhǔn)操作技巧規(guī)章

1、/標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程標(biāo)題：藥品微生物限度檢驗(yàn)方法標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程生效日期年 月 日頁(yè)次：1/12編號(hào):SOP-QC- 028 01頒發(fā)部門：質(zhì)量管理部新訂口修訂口原文件號(hào)：編制：部門審核：QA審核：批準(zhǔn)：分發(fā)部門：QC目的：建立一個(gè)藥品微生物限度檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程。范圍：適用于本企業(yè)生產(chǎn)的所有品種，本企業(yè)所有潔凈生產(chǎn)區(qū)域QC微生物限度檢查室，潔凈工作室等。責(zé)任者：QC主任、化驗(yàn)員。規(guī)程：本規(guī)程引至中國(guó)藥典200弭版。1 .概述：微生物限度檢查系指非規(guī)定滅菌制劑及其原輔料受到微生物污 染程度的一種檢查方法，包括染菌量及控制菌的檢查。我公司C設(shè)無菌操 作室，用于微生物限度檢查。無菌操作室的管理及使用制度見本文

2、附錄一。2 .抽樣：供試品應(yīng)按批號(hào)隨即抽樣，一般抽樣量為檢驗(yàn)用量2（個(gè)以上 最小包裝單位）的3倍。抽樣時(shí)，凡發(fā)現(xiàn)有異?？梢傻臉悠?，曲陷選用疑 問的樣品，但因機(jī)構(gòu)損傷明顯破裂的包裝不得作為樣品，凡已能從藥品、瓶 口（外蓋內(nèi)側(cè)及瓶口周圍）外觀看出長(zhǎng)螭、長(zhǎng)霉、蟲蛀及變質(zhì)的藥品，可直 接判為不合格，無需要再抽樣檢驗(yàn)。3 .供試品的保存：供試品在檢驗(yàn)之前，應(yīng)保存在陰涼干燥處，以防供試 品中的污染菌因保藏條件所引起致死、損傷或繁殖。供試品在檢驗(yàn)之前，應(yīng) 該保持原有包裝狀態(tài)，嚴(yán)禁開啟，包裝已開啟的樣品不得作為供試品。4 .檢查：4.1. 使用設(shè)備：電熱恒溫培養(yǎng)箱、電熱恒溫水溫箱、試管、刻度吸管、 量筒、三角

3、瓶、培養(yǎng)皿、試管架、注射器、針頭、注射器盒、研缽75%酒 精棉球、紫外燈（365nm長(zhǎng)）。4.2. 檢查的全過程應(yīng)嚴(yán)格遵守?zé)o菌操作，嚴(yán)防再污染。使用設(shè)備、儀器、 人員及無菌操作室常用的消毒、滅菌方法見本文附錄二。除另有規(guī)定外，供 試品制備成供試液后,均在均勻狀態(tài)取樣。制成供試液后，應(yīng)該在60分鐘內(nèi) 注皿操作完畢。標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程標(biāo) 題藥品微生物限度檢驗(yàn)方法標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程頒發(fā)部門質(zhì)量管理部編號(hào)SOP3- QC028- 01頁(yè)次：2/124.3. 培養(yǎng)：除另有規(guī)定外，本檢查法中細(xì)菌培養(yǎng)溫度為30 35C,霉菌、 酵母菌培養(yǎng)溫度為25- 28c ,控制菌培養(yǎng)溫度為36士 1C ,檢驗(yàn)結(jié)果的報(bào)告 以1g、1

4、ml或10cm2為單位。4.4. 復(fù)檢4.4.1. 菌數(shù)測(cè)定不合格者應(yīng)復(fù)檢，控制菌檢查以一次檢出為準(zhǔn)，不再?gòu)?fù) 試，但應(yīng)保留檢出菌株一個(gè)月備查。4.4.2. 以復(fù)試項(xiàng)下不合格項(xiàng)目為準(zhǔn)，作單項(xiàng)復(fù)試。復(fù)試需另取同批號(hào)樣 品，測(cè)定2次。4.4.3. 復(fù)試報(bào)告，以3次測(cè)定結(jié)果的算術(shù)平均值報(bào)告。4.5. 檢驗(yàn)報(bào)告4.5.1. 檢驗(yàn)報(bào)告以14 1ml或10cm2為單位。4.5.2. 測(cè)定菌數(shù)報(bào)告，以每次測(cè)定結(jié)果全部平均值報(bào)告。4.5.3. 控制菌按檢驗(yàn)結(jié)果報(bào)告，如未檢出控制菌時(shí)，報(bào)告為按規(guī)定抽樣 檢驗(yàn)結(jié)果未檢出XX菌”，如抽樣中任意一樣品要檢出控制菌時(shí)，報(bào)告演 規(guī)定抽樣，檢出xx菌，不符合藥品微生物限度標(biāo)準(zhǔn)

5、：4.6. 培養(yǎng)基、試藥及稀釋劑的相關(guān)內(nèi)容見本文件附錄三。4.7. 供試液的制備：按供試液的理化特性與生物學(xué)特性可采取適宜的方 法制成供試液。4.7.1. 供試品的取樣及注意事項(xiàng)供試品取樣應(yīng)有一定數(shù)量，以使檢驗(yàn)結(jié)果具有代表性，正常的供試品一 般每批應(yīng)隨機(jī)抽取兩瓶或兩盒以上的包裝單位，檢驗(yàn)時(shí)每次應(yīng)分取兩幅） 以上的樣品共10g或10ml。供試品在檢驗(yàn)前，應(yīng)嚴(yán)格保持包裝的原有狀態(tài)，不得啟開，并放在陰涼 干燥處，防止微生物再繁殖，以免影響檢驗(yàn)結(jié)果，凡已將原包裝啟開，則無 代表性應(yīng)另取樣。供試品稀釋后須在1 -2小時(shí)內(nèi)操作完畢，防止微生物繁殖或死亡。供試品稀釋成供試液后，應(yīng)在均勻狀態(tài)下取樣，凡因抑菌或

6、不溶于水的 劑型，其供試品應(yīng)作特殊處理后進(jìn)行檢驗(yàn)。4.7.2. 液體供試品：取供試品10mL加入稀釋劑90ml中，混勻，作為 供試液。油劑可加適量聚山梨酯80,混勻，吸取相當(dāng)于10g或10ml供試品，標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程標(biāo) 題藥品微生物限度檢驗(yàn)方法標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程頒發(fā)部門質(zhì)量管理部編號(hào)SOP3- QC-028- 01頁(yè)次：3/12再稀釋成100ml作為供試液；合劑(系指含王槳或蜂蜜者，下同)可用供試 品作為供試液。4.7.3. 固體、半固體或黏稠液供試品：稱取供試品 10g,置0.9%無菌氯 化鈉溶液100ml中，用勻漿儀或其他適宜的方法混勻后作為供試液在制備 過程中，必要時(shí)可加適量聚山梨W80,并適當(dāng)加

7、溫，但不應(yīng)超過45C。(1)非水溶性供試品：取供試品5g (5ml)加入含溶化的無菌司盤80 5g、單硬脂酸甘油酯3g、聚山梨酯80 10酶合物的燒杯中，用無菌玻棒攪拌 成團(tuán)后，慢慢加入45c左右的0.9%£菌氯化鈉溶液約80ml,邊加邊攪拌， 使供試品充分乳化，作為供試液1 : 20)。(2)腸溶膠囊(片)供試品：稱取供試品10g,置含無菌磷酸鹽緩沖液 (pH6 100ml的錐形瓶?jī)?nèi)，于45c水浴中，保溫、振搖，使溶解，作為 供試液。(3)含抑菌成分的供13t品照中國(guó)藥典2000年版附錄“微生物限度 檢測(cè)法”制備供試液。4.8. 對(duì)照用菌液4.8.1. 控制菌檢查均應(yīng)作相應(yīng)已知菌的

8、對(duì)照試驗(yàn)，大腸桿菌的對(duì)照菌株 為CMCC(B)44 102其余對(duì)照菌株見中國(guó)藥典2000年版附錄。取相應(yīng)菌株的營(yíng)養(yǎng)基斜面新鮮培養(yǎng)物白金耳，接種至營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基 內(nèi)，培養(yǎng)18-20小時(shí)后，稀釋至1 ：1C6。對(duì)照菌的加入量為50100個(gè)。4.8.2. 菌種短期保存法：凡使用菌種，一般接種在普通瓊脂斜面上，經(jīng) 37c培養(yǎng)18-20小時(shí)，取出在5c的冰箱內(nèi)保存?zhèn)溆眉纯桑吭陆臃N傳代一 次，數(shù)周內(nèi)不致死亡。4.9. 檢查法4.9.1. 檢查前的準(zhǔn)備：A.用具的洗滌與滅菌。試管：使用過的試管經(jīng)消毒后，將培養(yǎng)基倒出，用清潔液洗刷，用純化 水沖洗45次，倒立，晾干備用。滅菌前，用棉塞塞上管口，牛皮紙包緊，

9、扎緊。標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程標(biāo) 題藥品微生物限度檢驗(yàn)方法標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程頒發(fā)部門質(zhì)量管理部編號(hào)SOP3- QC-028- 01頁(yè)次：4/12B.吸管：使用過的吸管用清潔液浸泡數(shù)分鐘后川純化水沖洗45次， 晾干，備用。滅菌前，在吸管上端距0.5cm處塞入約2cm左右的適當(dāng)疏松棉 花，用牛皮紙裹緊。C.研缽:使用過的研缽用清潔液洗刷后用純化水沖洗數(shù)次，晾干備用。 滅菌前，用牛皮紙將缽體和錘包裹。D.培養(yǎng)皿：使用過的培養(yǎng)皿經(jīng)消毒后，將培養(yǎng)基倒出，用清潔液洗涮， 用水沖洗4-5次，倒立、晾干各用。滅菌前，根據(jù)消毒器內(nèi)經(jīng)大小用牛皮紙 包數(shù)個(gè)培養(yǎng)皿，扎緊。將上述包好的用具，放在121c的高壓蒸汽消毒器中，滅菌30min

10、后， 放入微生物限度檢查室定點(diǎn)位置，備用。將所有已滅菌的培養(yǎng)皿、三角瓶、吸管（1ml、10ml）、稀釋劑及供試 品等移至無菌室內(nèi)。每次試驗(yàn)所用物品必須事先計(jì)劃，準(zhǔn)備足夠用量，避免 操作中人出操作間。將全開啟無菌室紫外線殺菌燈和空氣過濾裝置并使其工 作30min操作人員用肥皂洗手，關(guān)閉紫外線殺菌燈，進(jìn)入緩沖間，換工作 鞋，再用0.1%新潔爾滅或用75叱醇棉球擦手，并擦拭供試品瓶、盒、袋等 的開口周圍，待干后將供試品瓶、盒、袋啟封，啟封后先檢查瓶蓋內(nèi)側(cè)及瓶 口周圍有無生霉、長(zhǎng)螭的跡象，對(duì)肉眼可見疑似者，若經(jīng)證實(shí)為生霉、長(zhǎng)螭 即可判定為不合格，無須繼續(xù)檢驗(yàn)。4.9.2. 細(xì)菌、霉菌、酵母菌計(jì)數(shù)。4.

11、9.2.1. 檢查程序（如下列圖1）。4.9.2.2. 操作步驟a.供試液制備：經(jīng)陰性對(duì)照聯(lián)樣后，按各類制劑備供試液的方法（如 供試液的制備）制備。b.稀釋及取樣稀釋：取1ml吸管1支，吸取混勻的1 ： 10供試液（或原液，1: 20供 試液）1ml,在離稀釋劑液面上約1cm處，測(cè)管壁注入裝有9ml的稀釋劑的 試管中，混勻成1 : 100 （或1 ： 10, 1 ： 20。的稀釋液。吸樣：用上述吸管分別取1 ： 10供試液（或原液，1 ： 20供試液）1ml, 注入23個(gè)平皿中，以另一支1ml吸管，按上述操作下一級(jí)的稀釋與吸取。c.注皿與干燥標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程標(biāo) 題藥品微生物限度檢驗(yàn)方法標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程

12、頒發(fā)部門質(zhì)量管理部編號(hào)SOP3- QC028- 01頁(yè)次：5/12事先將培養(yǎng)融化，置45c水浴中，備用，當(dāng)供試液及各稀釋液均注入平 皿后，以上述培養(yǎng)基傾注入平皿，每平皿約5 ml,轉(zhuǎn)動(dòng)平皿，使樣液與培 養(yǎng)基混勻后，置水平臺(tái)上待凝。培養(yǎng)基凝固后，在凈化條件下開蓋倒置或換 滅菌的陶瓦蓋，使平板干燥，減少平板表面的水分，防止菌落蔓延生長(zhǎng)，干 燥時(shí)間一般在3h左右，干燥時(shí)間計(jì)入培養(yǎng)時(shí)間。d.培養(yǎng):將上述平板倒置于適宜溫度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。細(xì)菌于3035c 培養(yǎng)48士 2小時(shí)，霉菌于2528c培養(yǎng)72士2小時(shí)。e.菌落計(jì)數(shù)：用肉眼直接計(jì)數(shù),標(biāo)記或在菌落計(jì)數(shù)器上點(diǎn)計(jì)，然后用于510倍放大鏡 檢查，是否遺漏。

13、若平板上有2個(gè)或者2個(gè)以上的菌落重疊，可分辨時(shí)分辨，仍以個(gè)或2個(gè)以上菌落計(jì)數(shù)。標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程標(biāo) 題藥品微生物限度檢驗(yàn)方法標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程頒發(fā)部門質(zhì)量管理部編號(hào)SOP3- QC028- 01頁(yè)次：6/12平板上有片狀菌落或花斑樣菌落蔓延生長(zhǎng)以及平板受到污染的情況，該 平板計(jì)數(shù)無效。當(dāng)同一稀釋級(jí)使用2個(gè)平板時(shí)，應(yīng)采用2個(gè)平板菌落數(shù)的均值為平均平 板菌落數(shù)，若2個(gè)平板菌落數(shù)相差在職倍以上時(shí)，該稀釋級(jí)不宜采用，但不 包括2個(gè)平板菌數(shù)均在15個(gè)以下的情況(15個(gè)以下兩平板菌落數(shù)允許幅度 04, 25, 29, 412 514, 613 71%f.菌數(shù)報(bào)告規(guī)則細(xì)菌一般宜選取平均平板菌落巍0300間的稀釋級(jí)，作為

14、菌數(shù)計(jì)算的依 據(jù)，霉菌宜選取平均菌數(shù)在3070M間的稀釋級(jí)作為菌數(shù)計(jì)算的依據(jù)。若在1個(gè)稀釋級(jí)的平均平板菌落數(shù)處至0300(30100之間時(shí)，將該 稀釋級(jí)的菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)，為報(bào)告菌數(shù)。若有2個(gè)稀釋級(jí)的平均平板菌落數(shù)處福0300(20100之間時(shí)，按下 式計(jì)算兩級(jí)比值。比值高稀釋級(jí)的平均菌落數(shù)稀釋倍數(shù)低稀釋級(jí)的平均菌落數(shù)稀釋倍數(shù)當(dāng)比值2時(shí)，以兩級(jí)的菌落數(shù)均值為報(bào)告菌數(shù)；當(dāng)比值2時(shí)，以低稀釋級(jí)平均平板菌落乘以稀釋倍數(shù)為報(bào)告菌數(shù)。若有3個(gè)稀數(shù)級(jí)的平均平板菌數(shù)處抽0300(30100之間時(shí)，采用后2個(gè)稀釋級(jí)計(jì)算級(jí)間比值。當(dāng)比值2時(shí)，以兩級(jí)的菌落數(shù)均值為報(bào)告菌數(shù)；當(dāng)比值2時(shí)，以低稀釋平均平板菌落數(shù)乘以

15、稀釋倍數(shù)為報(bào)告菌數(shù)若各稀釋級(jí)平均平板菌數(shù)均小00以上，按最高的稀釋級(jí)的平均平板菌 落數(shù)第六以稀釋倍數(shù)為報(bào)告菌數(shù)或適當(dāng)增中稀釋數(shù)，重作測(cè)定后報(bào)告結(jié)果。若各稀釋級(jí)的平均平板菌落數(shù)均不在30300間，其中稀釋級(jí)的平均平 板菌落數(shù)大于300,相鄰稀釋的平均平板菌數(shù)又小血。時(shí)，以最接近30或 300的稀釋級(jí)平均平板菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)為報(bào)告菌數(shù)。若各稀釋平均平板菌落數(shù)均小形0小時(shí)，按最低稀釋級(jí)的平均平板菌落 數(shù)乘以稀釋倍數(shù)為報(bào)告菌數(shù)，但若用原液為供試液，當(dāng)：10稀釋級(jí)與原液 的平均平板菌落數(shù)相等或大于時(shí)，應(yīng)以培養(yǎng)基稀釋法測(cè)定。標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程標(biāo) 題藥品微生物限度檢驗(yàn)方法標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程頒發(fā)部門質(zhì)量管理部編號(hào)SOP

16、3- QC028- 01頁(yè)次：7/12g.培養(yǎng)基稀釋法：取供試液(原液或1 ： 10, 1 ： 100供試液)3份，每份各1 ml,分別注入 5個(gè)平皿內(nèi)(每皿積壓為2 ml),每個(gè)平皿傾注營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基約5 ml,混 的菌落數(shù)，共得3組數(shù)據(jù)，稀釋級(jí)平均菌落數(shù)小于1時(shí)，則報(bào)告菌數(shù)為小于 10個(gè)。h.報(bào)告數(shù)書寫(細(xì)菌數(shù)報(bào)告規(guī)則舉例)原液供試品稀釋倍數(shù)110-110-210-3級(jí)間比 值菌落 數(shù)報(bào)告數(shù)書寫一136516420一1640016X 103 或 16000一2760295461.63775038X 103 或 38000一2890271602.22710027X 103 或 27000一2

17、39202351.72760028X 103 或 28000一23619642一1960020X 103 或 20000一不可計(jì)4650 513一5130051X 103 或 51000一不可計(jì) 30512一3050030X 103 或 30000一241912一24024X 101 或 24022.3277一27027X 101 或 270_ _0600_ _6< 10注:(1)菌落數(shù)在100個(gè)以內(nèi)時(shí)，按實(shí)測(cè)數(shù)書寫報(bào)告。(2)菌落數(shù)大于100時(shí)，取二位有效數(shù)字，第三位數(shù)按有效數(shù)字處理規(guī)格 處理，為簡(jiǎn)便計(jì)，也可用不割的指數(shù)報(bào)告。(3)不得按計(jì)數(shù)規(guī)則報(bào)告的情況空白對(duì)照平板有菌生長(zhǎng)，表明培養(yǎng)

18、基已被污染；各稀釋級(jí)平板上生產(chǎn)的菌落數(shù)f任何10倍遞增稀釋規(guī)律，菌數(shù)顯示混亂；同一稀釋級(jí)的兩個(gè)平板上生長(zhǎng)的菌落數(shù)均在5個(gè)以上，但菌數(shù)相關(guān)一倍 以上；菌落蔓延生覆蓋整個(gè)平板無法計(jì)數(shù)；出現(xiàn)以上情況，該次實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)不得計(jì)數(shù)報(bào)告。4.9.3. 大腸桿菌檢查法；/標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程標(biāo) 題藥品微生物限度檢驗(yàn)方法標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程頒發(fā)部門質(zhì)量管理部編號(hào)SOP3- QC028- 01頁(yè)次：8/124.9.3.1檢驗(yàn)程序（見附頁(yè)）MIX? *1 -MUG +1 -MUG *MUG *判檢出大順桿菌判檢出大腸桿菌EMB或妻康菊瓊脂報(bào)告揖告無菌落生根判耒檢出大JIS桿菌有菌落生長(zhǎng)省紫外觀察，顯靈止為陽性， 比為陽性J*MUJ首箭

19、基質(zhì)顯色，MUG管內(nèi),液 面呈戲理直為陽性/ H；液面呈試劑本 身色為明性，1-報(bào)告F試臉普通.肉海涼脂耦面莖¥而總色彘橙甲第國(guó)臉4.9.32操作步驟/標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程標(biāo) 題藥品微生物限度檢驗(yàn)方法標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程頒發(fā)部門質(zhì)量管理部編號(hào)SOP- QC-028- 01頁(yè)次：9/12取膽鹽乳糖培養(yǎng)基3份，每份100 ml 2份分別加入規(guī)定量的供試液， 其中1份加入對(duì)照菌5070g作陽性對(duì)照，第3份加入與供試液等量的稀 釋液作陰性對(duì)照。培養(yǎng)1824小時(shí)（必要可延至48小時(shí)）。陰性對(duì)照應(yīng)無菌 生長(zhǎng)。取上述3份的培養(yǎng)物各0.2m|分別接種5 ml MUG培養(yǎng)基管內(nèi)培養(yǎng)， 分別于5小時(shí)與24小時(shí)，取未接種

20、的MUG培養(yǎng)基管作本底對(duì)照,將各管置 365nm紫外光下觀察。陽，性對(duì)照管呈現(xiàn)熒光,MUG陽性。供試液的MUG 管呈現(xiàn)熒光，MUG陽性；無熒光，MUG陰性。然后加數(shù)滴靛基質(zhì)試液于 MUG管內(nèi)，液面呈玫瑰紅者為陽性，呈試劑本色為陰性。當(dāng)陰性對(duì)照呈陰性，陽性對(duì)照正常生長(zhǎng)，供試液膽鹽乳糖培養(yǎng)基培養(yǎng)液 澄明，并證明無菌生長(zhǎng)，判未檢出大腸桿菌。供試湎UG陽性，靛基質(zhì)陽 性，判斷檢出大腸桿菌；MUG陰性，靛基質(zhì)陰性，判未檢出大腸桿菌。如MUG陽性、靛基質(zhì)陰性，或MUG陰性、靛基質(zhì)陽性，均應(yīng)取供試 液膽鹽乳糖培養(yǎng)基培養(yǎng)物劃線于曙紅亞甲藍(lán)瓊脂平板或麥康凱瓊脂平板，培 養(yǎng)1824小時(shí)，如上述供試液培養(yǎng)物的分離平

21、板無菌落生長(zhǎng)，判未檢出大腸 桿菌。若有菌落生長(zhǎng)，應(yīng)挑選23可疑菌落作靛基質(zhì)度驗(yàn)（）、甲基紅試驗(yàn) （M）、乙酰甲基甲醇生成試MP）、枸椽酸鹽利用試驗(yàn)C）及革蘭染色、 鏡檢，按下表規(guī)定判斷結(jié)果。MUG-1曙紅亞甲藍(lán)瓊脂IMVic結(jié)果+ +檢出大腸桿菌一 一未檢出大腸桿菌+ 一無菌生長(zhǎng)未檢出大腸桿菌+ 一啟菌生長(zhǎng)-4 °檢出大腸桿置一 十啟菌生長(zhǎng)+ +-檢出大腸桿置注：、如出冊(cè)+或出現(xiàn)一+,均應(yīng)重新分離菌株，再作MUG 1和IMVic試驗(yàn)；為革蘭氏陰性桿菌。寶靛基質(zhì)試驗(yàn)Q）:取可疑菌落或斜面培養(yǎng)物，接種于蛋白月東水培養(yǎng)基 中，培養(yǎng)24小時(shí)，沿管壁加入靛基質(zhì)試液數(shù)滴，液面呈玫瑰紅色為陽性，于

22、 試劑本色為陰性。甲基紅試驗(yàn)（M）:取可穎菌數(shù)或斜面培養(yǎng)物,接種于磷酸鹽葡萄月東水培 基中，培養(yǎng)48小時(shí)及小時(shí)，于管內(nèi)加入甲基紅指示液數(shù)滴，立即觀察，呈 鮮紅色或橘紅色為陽性，呈黃色為陰性。標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程標(biāo) 題藥品微生物限度檢驗(yàn)方法標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程頒發(fā)部門質(zhì)量管理部編號(hào)SOP- QC-028- 01頁(yè)次：10/12乙酰甲基甲醇生成試驗(yàn)VP）:取可疑菌落或斜面培養(yǎng)物，接種于磷 酸鹽葡萄糖水培養(yǎng)基中，培養(yǎng)小時(shí)2小時(shí)，于每2 ml培養(yǎng)液中加入a菸酚 乙醇試液1 ml,混勻，再加40%氫氧化鉀溶液0.4 m|充分振搖，在4小時(shí) 內(nèi)出現(xiàn)紅色為陽性，無紅色反應(yīng)為陰性。枸椽酸鹽得用試驗(yàn)（C）:取可疑菌落或斜面培養(yǎng)

23、物,接種于枸椽酸鹽培 養(yǎng)基的斜面上，一般培養(yǎng),4872小時(shí)，培養(yǎng)基斜面有菌落生長(zhǎng)，培養(yǎng)基由 綠色變?yōu)樗{(lán)色時(shí)為陽性，培養(yǎng)基顏色無改變?yōu)殛幮?。革蘭氏染色法、鏡檢：試劑；結(jié)晶紫染液：取結(jié)晶紫1.0g溶于95%乙醇20ml,與1%草酸鏤溶 液80 ml混勻靜置48h備用。革蘭氏碘液，先用35ml蒸儲(chǔ)水溶解2.0gB化 鉀，再加入磺片1.0g待全溶后，加蒸儲(chǔ)水稀釋卷00mL備用。沙黃（蕃 紅）染液：將沙黃0.25g溶于95叱醇10ml中，待全溶解后再加蒸儲(chǔ)水至 100mL即可。染色法：用接種環(huán)沾取無菌水，置于潔凈載玻片上，再挑取 少許菌苔，輕輕研開，使均勻。涂片自然風(fēng)干或微熱烤干，而后通過火焰23 次以

24、固定涂片。滴加結(jié)晶紫梁液,染色數(shù)分鐘，水洗，滴加磺液媒染1分鐘， 水洗，甩干余水，滴加95叱醇脫色，約203例，水洗，吸干，滴加沙黃 復(fù)染液，染1分鐘，水洗，待干，鏡檢。染色結(jié)果：革蘭氏陽性菌呈藍(lán)紫色， 陰性菌呈紅色。4.9.4. 活螭檢查法：a.設(shè)備和材料：顯微鏡、雙筒實(shí)體顯微鏡、放大鏡、解剖針、發(fā)絲針、 小毛筆、載玻片、蓋玻片、酒精燈、培養(yǎng)皿或小搪瓷盤（內(nèi)襯黑色30%t 油水。b.螭的形態(tài)特征：螭的體表微小，多在mm以下，一般呈卵圓形或橢 圓表、無頭胸、腹界限。幼螭足三對(duì)，若螭足四對(duì)，成螭足多數(shù)為四對(duì)。足 通常由六節(jié)組成。口器向前突出，螯肢常呈螯鉗狀，由2-3節(jié)組成。須肢節(jié) 數(shù)因種類而異，

25、由不得2到5節(jié)組成，一般呈爪或鉗狀，偶爾為長(zhǎng)形。有些 種類在軀全前端或兩側(cè)有1 -2對(duì)眼，軀體兩側(cè)對(duì)稱,表面有被有堅(jiān)硬的幾丁 質(zhì)的板，保護(hù)其內(nèi)部器客和支持肌肉固定。體表有剛毛，它的形狀、數(shù)目及 彼此長(zhǎng)短比例和排列位置因種類而異。螭類與蜘蛛、昆蟲（書虱），外形比較的近似，因此，必須注意它們之間 的主要區(qū)別，見下表:標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程標(biāo) 題藥品微生物限度檢驗(yàn)方法標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程頒發(fā)部門質(zhì)量管理部編號(hào)SOP3- QC028- 01頁(yè)次：11/12特征成螭（如腐食醋螭）蜘蛛昆蟲（如書虱）分類蜘形綱、婢螭目蛛形綱、蜘蛛目昆蟲綱、嚙蟲目足4對(duì)4對(duì)3對(duì)觸角無無1對(duì)體段頭、胸、腹無界限頭、胸、腹無界限頭、胸、腹無界限c

26、.檢查方法：直檢法：取供試品先用肉眼觀察，有無疑似活螭的白點(diǎn)或其它顏色的點(diǎn) 狀物，再用5-10倍放大間或雙筒實(shí)全顯微鏡檢視，有螭者，用解剖針或發(fā) 絲針或小毛筆挑取活螭放在滴一滴甘油水的載玻片上，置顯微鏡下觀察。漂浮法:將供試品放在盛大有飽和食鹽水的扁表稱量瓶或適宜的容器內(nèi)， 加飽和食鹽水至容器的三分之二處攪拌均勻，置10倍放大鏡或雙筒實(shí)體顯 微鏡下檢查，或繼續(xù)加飽和食鹽水至瓶口處（為防止鹽水和樣口溢出污染桌 面，宜將上述容器放在裝有適量甘油水的培養(yǎng)皿中,）用潔凈的載玻片蓋在瓶 口上，使玻片與液面接觸，沾取液面上的漂浮物，置顯微鏡下檢查。分離法：也稱烤螭法。將供試品放在物質(zhì)特制的分離器或附有孔徑

27、大小 適宜的篩網(wǎng)的普法玻璃漏斗里，利用活螭避銃、怕熱的習(xí)性，在漏斗的廣口 上面放一個(gè)60100W勺燈泡，距離藥品約6cm處，照射12小時(shí)?；铙た?沿頭漏斗內(nèi)的底部細(xì)頸內(nèi)壁向下爬，用小燒杯裝半杯甘油水，放在漏壯舉的 下口處，收集爬出來的活螭?；铙ぢ训臋z驗(yàn)方法：螭卵極小，一般在0.1mm以正是，呈乳白色，橢圓表或卵圓形。須用 1020倍入大鏡或顯微鏡方可查見。螭卵常見于活螭的周圍，但在未檢出活 螭的樣品中，亦有檢出螭卵者。一般在供試品中已經(jīng)檢出活螭的，不再進(jìn)行 螭卵的檢查。對(duì)可疑供試品，未檢出活螭時(shí)，可注意檢查活螭卵。檢驗(yàn)方法：可采用檢驗(yàn)活螭項(xiàng)下的直檢法或漂浮法檢法。凡用上述兩種 方法檢查，如發(fā)現(xiàn)

28、可疑螭卵時(shí)，用發(fā)絲針小心挑取。取一塊形載玻片，在窩 中央滴入2滴甘油水，將挑取物放入甘油水中，置顯微鏡下檢查為確證挑取 物是否為活螭卵，可將上述載玻片置培養(yǎng)皿中，加蓋，及230c培養(yǎng)38 天，每天上、下午定時(shí)用低倍顯微鏡觀察，如在甘油水液中孵出幼螭，則判 斷為檢出活螭卵。標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程標(biāo) 題藥品微生物限度檢驗(yàn)方法標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程頒發(fā)部門質(zhì)量管理部編號(hào)SOP- QC-028- 01頁(yè)次：12/12供試品檢驗(yàn)報(bào)告凡供試品按上述有關(guān)劑型項(xiàng)規(guī)定檢驗(yàn)發(fā)現(xiàn)活螭者，應(yīng)作檢出活螭報(bào)告。在供試品中未檢出活螭，但檢出活螭卵時(shí)，可按檢出活螭處理。為保留陰性結(jié)果備查，可將檢出的螭按下法處理保存；半活螭挑放在載 玻片上，預(yù)先

29、滴有1滴75幅L酸溶液中，加上蓋玻片。手持載玻片，在酒精 燈小火焰上來回移動(dòng)，緩緩加熱片刻，使其適當(dāng)透化、即可鏡檢。鑒定后的 螭體，可取下放入70%酒精中保存，或適當(dāng)處理。發(fā)線針的制作:取長(zhǎng)約1.5cm的頭發(fā)絲一根和長(zhǎng)約10cm的小金屬棒一根， 以頭發(fā)絲長(zhǎng)度的一半緊貼在金屬棒的一端，用細(xì)棉線將其纏緊，然后粘上加 拿大樹脂或油漆，晾干，即得。5.內(nèi)包裝材料中不易溶解的（女FVC,鋁箔等），取100cn2,剪碎，力口 入100ml無菌生理鹽水，浸泡后振搖，制得供試品溶液，照上述方法檢驗(yàn)， 結(jié)果以10cm2報(bào)告，細(xì)菌數(shù)不得過100個(gè)/10cn2,霉菌數(shù)不得過10個(gè)/10cn2, 并不得檢出大腸桿菌及

30、活螭。注：本文含有的附件有：無菌操作室的管理及使用制度、設(shè)備、儀器、人員 及無菌操作室常用的消毒、滅菌方法、培養(yǎng)基、試藥及稀釋劑、藥品衛(wèi)生檢 驗(yàn)記錄、附錄一：無菌操作室的管理及使用制度1 .無菌操作室內(nèi)應(yīng)設(shè)有緩沖間,緩沖間內(nèi)設(shè)有紫外燈,并備有無菌操作 衣、帽、口罩、拖鞋和消毒用的洗手盆和毛巾等，入室前應(yīng)嚴(yán)格洗手消毒， 穿戴無菌衣帽、口罩、拖鞋。2 .無菌室內(nèi)應(yīng)備有超凈工作臺(tái)，專用的接種棒等，以及盛育石碳酸 水溶液的消毒吸管筒、酒精和碘酒棉球等。無菌操作衣帽應(yīng)經(jīng)常熱壓滅菌。3 .每次進(jìn)無菌室之前，須用0.1%新潔爾滅擦拭工作臺(tái)面等，用35% 來蘇爾溶液拖地面，并須定期用電爐烘烤無菌室內(nèi)，防止霉菌

31、，定期做雜菌 的抽驗(yàn)檢查，要求在室內(nèi)各個(gè)角落打開瓊脂平板培養(yǎng)基，放疊0分鐘，經(jīng) 37c培養(yǎng)48小時(shí)生長(zhǎng)的雜菌菌落數(shù)平均應(yīng)在3個(gè)以下。4 .在無菌操作前后，室內(nèi)應(yīng)打開紫外燈照射1220分鐘，操作完畢后 應(yīng)及時(shí)清潔操作室。5 .在進(jìn)行活菌，毒菌和藥品檢驗(yàn)操作時(shí)，一切器具和用品都應(yīng)保持無菌， 不得用手直接接觸或污染他物，防止污染，接種環(huán)在使用前后都必須通過火 焰，嚴(yán)格施行燒灼滅菌，冷卻后，方可使用或收還，吸取菌液時(shí)，嚴(yán)禁直接 用口吸。附錄二：設(shè)備、儀器、人員及無菌操作室常用的消毒、滅菌方法1.常用消毒液的配制1.1.0.1麻潔爾滅溶液：稱取新潔爾滅 1g加水使成1000ml即得， 用于擦拭工作臺(tái)面和

32、手消毒。1.2. 35%來蘇爾溶液：取來蘇爾3050ml加水使成1000ml即得，用 于手或地面的消毒。1.3. 75叱醇棉球配制：取95%勺乙酉I原液78ml加水22ml混勻即得， 而后將脫脂棉花球泡在內(nèi)。用于手的消毒。1.4. 2%!酒棉球白配制：每100ml95%勺酒精內(nèi)先加1.5g碘化鉀，微溫 后振搖使溶解，再加2g碘片，振搖完全溶解后即為2%的碘酒液，將脫脂棉 球浸泡于中即得。用于手、皮膚和器械的消毒,注意此液要保存于棕色瓶中。2 .玻璃器皿的洗滌2.1. 新的玻璃器皿應(yīng)先用清水沖去灰塵雜物，瀝干水后，浸泡的重銘酸 鉀硫酸洗液中12小時(shí)左右，濾盡酸液，用清水沖洗干凈，備用。2.2.

33、吸過細(xì)菌培養(yǎng)基的吸管，用后應(yīng)立即浸泡在裝有5%的石碳酸溶液的 吸管筒內(nèi)，整根吸管要全部浸泡在消毒液內(nèi)12小時(shí)以上，方可取出，立即用 清水去污物，瀝盡水份，放在銘酸液中過夜，取出清水沖凈，烘干備用。2.3. 裝有細(xì)菌培養(yǎng)物的試管、雙碟及吸過含芽胞的強(qiáng)毒菌的吸管，須先 經(jīng)高壓滅菌，取出傾出廢物，用洗潔精水刷洗，清水沖凈，烘干備用。2.4. 用過的載玻片，應(yīng)隨即泡在35%的來蘇爾水溶液中，每隔數(shù)周集 中取出，用洗衣粉水煮沸，洗凈，清水沖洗，蒸儲(chǔ)水沖洗1-2遍后，晾干備 用。3 .滅菌器具的準(zhǔn)備3.1. 棉花塞：供細(xì)菌檢驗(yàn)用的各種試管、三角瓶棉塞等均應(yīng)是普通棉花 包一層紗布制成，松緊應(yīng)適度，長(zhǎng)度一般要

34、求是塞進(jìn)管中約3/5,留在管外 約2/5,使用完后隨即烘干，防霉防塵，變硬無彈性時(shí)應(yīng)重新更換。3.2. 凡洗凈烘干或晾干備用的檢驗(yàn)用具、器皿，均須裝入鋁盒或用牛皮 紙包扎好，經(jīng)121c 30分鐘熱壓滅菌后取出置60c干燥烘干保存?zhèn)溆谩? .常規(guī)消毒滅菌法4.1. 將待滅菌器具置干燥箱內(nèi)，逐步加熱至140- 160C保持2小時(shí)后再 逐步自行降至常溫，方可取出，即可達(dá)到完全滅菌的目的。4.2. 濕熱滅菌法高壓蒸汽滅菌是采用高壓滅菌器，根據(jù)滅菌物品的不同，滅菌時(shí)溫度和 時(shí)間也有所不同。常用的溫度和時(shí)間:a. 115220分鐘；b. 121c20-30分鐘。附錄三：培養(yǎng)基、試藥及稀釋劑1 .培養(yǎng)基1.

35、1. 培養(yǎng)基制備注意事項(xiàng)a.制備培養(yǎng)基時(shí)所用的各種玻璃器皿和分裝容器、棉塞等，都必須經(jīng)過妥善洗刷，潔凈無污、干燥者，不得用銅、鐵制容器，可用 玻璃，搪瓷器皿。b.高壓滅菌時(shí)，應(yīng)將滅菌鍋內(nèi)的冷空氣全部排除后，鍋內(nèi)培養(yǎng)基達(dá)到 100c時(shí)方可關(guān)閉蒸汽閥，否則溫度不足，則滅菌不徹底。c.培養(yǎng)所需要的pH值，是以滅菌后所測(cè)的pH值為準(zhǔn)，因此，調(diào)節(jié)pH 應(yīng)讓培養(yǎng)基冷卻后再調(diào)，用NaOH調(diào)節(jié)的弱堿性培養(yǎng)基，高壓滅菌梅H可 比最終要求的約高0.2左右，滅菌后基本合適。d.制成后的培養(yǎng)基應(yīng)置冷暗處或冰箱內(nèi)保存廠般培養(yǎng)基保存期不超過 兩周，特殊培養(yǎng)基不超過3天。1.2. 營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基：取營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基34g加1

36、000m蒸儲(chǔ)水，加熱 溶解，分裝，116c高壓滅菌20分鐘。（用于細(xì)菌記劫1.3. 玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基（虎紅瓊脂培養(yǎng)基）：取玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基 30g,加1000ml蒸儲(chǔ)水，加熱溶解，分裝，116C高壓滅菌20分鐘。（用于 霉菌及酵母菌記數(shù)）1.4. 膽鹽乳糖培養(yǎng)基（BL）:取麥康凱瓊脂培養(yǎng)基MacC）、磷酸鹽葡 萄月東水培養(yǎng)基15.8g加1000ml蒸儲(chǔ)水，加熱溶解，分裝，116C高壓滅菌 20分鐘。（用于大腸桿菌檢查）1.5. 蛋白月東水培養(yǎng)基：取蛋白月東水培養(yǎng)基15g加1000m蒸儲(chǔ)水，加熱 溶解，分裝，116c高壓滅菌20分鐘。（用于大腸桿菌檢查）1.6. 4-甲基傘形酮葡萄 酸培養(yǎng)菜

37、MUG）:取4甲基傘形酮葡萄培養(yǎng) g,加1000m蒸儲(chǔ)水，分裝，115c高壓滅菌20分鐘。（用于大腸桿菌檢查）1.7. 曙紅亞甲藍(lán)瓊脂培養(yǎng)基EMB）:取營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基100ml加熱溶 化后，冷至60C,按無菌操作加入滅菌的曙紅鈉指示液ml、20%的乳糖溶 液5ml及亞甲藍(lán)指示液1.31.6ml搖勻，傾注平皿即得。（用于大腸桿菌檢 查）。1.8. 蛋白月東水培養(yǎng)基:取胰蛋白月東10g氯化鈉5g、水1000ml混合，加 熱溶化，調(diào)節(jié)pH值使滅菌后為7.3比1,分裝于小試管，滅菌即得。（用于大 腸桿菌檢查）。1.9. 磷酸鹽葡萄糖月東水培養(yǎng)基：取陽S磷酸氫二鉀3.8g葡萄糖5g、 水1000ml混合，微溫使溶解，調(diào)節(jié)pH值使滅菌后為7.3 0.1,分裝于小試 管，121C,滅菌15分鐘即得。1.10. 枸椽酸鹽培養(yǎng)基:取氯化鈉5g、枸椽酸鈉（無水）2g、硫酸鎂0.