根癌農(nóng)桿菌介導柞蠶抗菌肽D基因轉(zhuǎn)化柑桔的研究

1、根癌農(nóng)桿菌介導柞蠶抗菌肽D基因轉(zhuǎn)化柑桔的研究中國農(nóng)科學l997,30(3.!=3一l啄最,ScientiaricuhuraSinica一根癌農(nóng)桿菌介導柞蠶抗菌肽D基因陳善春張進仁黃自然高峰陳鳳珍隆有慶一,一(中國農(nóng)業(yè)科學院柑桔研究所,重慶63071Zz華南農(nóng)業(yè)大學遺傳工程室Is重慶教育學院生物摹)提要以含有最元載體(攜帶人工臺成的祚噩抗苗肽D基因,nptl基因和1305基目)的根癌農(nóng)桿菌苗株SE轉(zhuǎn)化錦桎,新套桎(Citrus婦Osbeck),涉田柚(c.grandis)的上胚軸和子明了柑桔品種(基固型),預培養(yǎng)時司和不同的芽伸長培養(yǎng)基對Km抗性芽誘導和伸長的影響.erllblot分析證明柞蠶抗

2、苗肽D基因已整合剄3個柑拮品種的基因組.關簟調(diào)堂堂?焦矍垡;堡壁查盤茸甚墮然羞且柑桔細菌性潰瘍病(其病原為野油菜黃單孢桿菌柑桔致病變種Xanthomonascampestris區(qū)特別是甜橙栽培區(qū)盛行的潰瘍病給柑桔業(yè)帶來巨大的經(jīng)濟損失.柑桔是多年生木本植物,用常規(guī)育種方法進行抗病育種難度較大.近年來,人們已嘗試用不同的基因工程抗病策略實現(xiàn)植物對細菌病的抗性,其中較為成功的途徑是向植物導入昆蟲抗菌肽基因(如CecropinB基因,Shiva基因)和溶菌酶基因,目前已獲得有一定抗病力的轉(zhuǎn)基因煙草.和馬鈴薯植株".柞蠶抗菌肽具有廣譜的殺菌功能,人工合成的抗茵肽D基因已披導入煙草.和藿香,獲得

3、了抗青枯病的轉(zhuǎn)基因植株.另外,獲得的轉(zhuǎn)抗菌肽D基因桑樹0"亦正在進行抗病性評價.柑桔類果樹的遺傳轉(zhuǎn)化起步較晚,迄今國外利用載體法和直接基因轉(zhuǎn)移法轉(zhuǎn)化柑桔莖段."",懸浮培養(yǎng)細胞"和原生質(zhì)體"".",均獲得了表達外源標記基因的轉(zhuǎn)基因植株.我們在國內(nèi)率先較系統(tǒng)地進行了這方面的研究"'",已建立一套有效的農(nóng)桿菌介導的柑桔遺傳轉(zhuǎn)化技術.抑菌試驗和電鏡觀察表明,柞蠶抗菌肽對柑桔潰瘍病病原菌具有很強的抑菌效應,它可迅速破壞病原菌的細胞膜,導致膜內(nèi)物質(zhì)滲出胞外而致死亡(另丈發(fā)表).本文報道柞蠶抗菌肽D基因轉(zhuǎn)化柑

4、桔的結(jié)果.1材料與方法本研究的基本技術路線見下頁示意.本研究以我國柑桔主栽品種錦橙,新會橙(c.sinensisOsbeck)和沙田柚(c.grandis)1215d齡試管實生苗為試材,無菌切取幼苗的子葉和上胚軸作為轉(zhuǎn)化外植體.收稿日期19960621中國農(nóng)業(yè)科學院院長基金資助項目和重慶市中青年專寨基金資助珥茸中國農(nóng)業(yè)科學3O卷根癌農(nóng)桿菌L三望柑桔外植體一'+感含Carb的誘芽培養(yǎng)基Km抗性誘芽培養(yǎng)基培養(yǎng),抑菌稀崖Km篩選誘芽培養(yǎng)基,芽忡長培養(yǎng)基一離體微嫁接一-一一-擬轉(zhuǎn)植株Du竺轉(zhuǎn)基因植株no$檢測根癌農(nóng)桿菌菌株SE含雙元載體系統(tǒng),其載體質(zhì)粒Co24攜帶CaMV35S啟動子控制的,人

5、工合成的柞蠶抗菌肽D(APD)基因(122bp),篩選標記和鑒定標記基因分別為新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶(nptI)基因和胭脂堿合成酶(nos)基因(圖1).從平板上挑取農(nóng)桿菌SE單菌落,接種于附加鏈霉素(Str)70g/ml,氯霉素(Cm)25g/ml,Km50g/mI和壯觀霉素(Spc)70g/ml的LB液體培養(yǎng)基中,28土1,120r/min搖床上培養(yǎng)過夜.圈1載體質(zhì)粒Co24的結(jié)構圖1.3外植體感染,誘芽和再生無菌切取長約lcm的上胚軸切段和lcm×lcm的子葉切塊,浸入以MS液體培養(yǎng)基稀釋810倍的農(nóng)桿菌苗液(0+D.o.5)中1O15min,取出后以無菌濾紙輕輕吸干殘余菌液.外植體

6、在誘芽培養(yǎng)基(Ms+2mg/LBA+0.25mg/LIAA)中共培養(yǎng)3d后,轉(zhuǎn)移到含羧芐青霉素(Carb)500g/ml的誘芽培養(yǎng)基中預培養(yǎng)710d;而后再轉(zhuǎn)入含Km(50/g/m1)和不定芽時,將外植體轉(zhuǎn)移到含Km(75/zg/m1)和Carb(50g/m1)的芽伸長培養(yǎng)基上培養(yǎng),每15d更換1次新鮮培養(yǎng)基.抗性小芽達0.5cm以上時,將其切離外植體,轉(zhuǎn)入含100vg/mlKm的相同伸長培養(yǎng)基中培養(yǎng).選取Icm以上,健壯的Km抗性芽在生根培養(yǎng)基中誘根;或?qū)⒖剐匝坑妙愃朴陔x體莖尖嫁接的方法離體微嫁接(vitromicrografting)在15d齡的到溫室的花盆中,或?qū)⑿≈仓甑那o芽再次嫁接到溫

7、室生長的6月齡的枳砧上.參照許耀等"的方法,在樣品量和樣品預處理方面略有改動,即將待測組織塊和提取緩沖液研磨,離心,取上清,加入底物(精氨酸和a一酮戊二酸)保溫3h,然后進行紙電泳3期陳善春等:根癌農(nóng)桿菌介導柞蠶抗菌膚D基因轉(zhuǎn)化柑桔的研究DNA.每個樣品取lO#gDNA以EcoRI消化,電泳,然后轉(zhuǎn)移到硝酸纖維紊膜上;用P標記lkb的含柞蠶抗菌肽D基因的Co24片段為探針進行雜交.2結(jié)果與討論IAA)中共培養(yǎng)3d后,轉(zhuǎn)入附加Carb(500g/m1)的相同培養(yǎng)基上預培養(yǎng)710d;然后轉(zhuǎn)移到誘芽(篩選)培養(yǎng)基(誘芽培養(yǎng)基附加Km50g/ml及Carb500/*g/m1),1530d可見

8、切口處有一些小的不定芽形成(圖版一1,2);再將其轉(zhuǎn)入附加Km75#g/ml和Garb的芽伸長培養(yǎng)外植體(對于較小的芽,則連同外植體一起繼續(xù)在上述含75tag/mlKm的培養(yǎng)基中培養(yǎng),每15d繼代1次,待芽大于0.5cm時再切下),轉(zhuǎn)移到附加Km100#g/ml的芽伸長培養(yǎng)基上培養(yǎng)20d;選取大于lcm,健壯的Km抗性芽誘根或離體微嫁接.基于我們早先用標記基因建立的柑桔遺傳轉(zhuǎn)化方法,本研究又進一步探討了日的基因轉(zhuǎn)化柑桔時下列因素對Km抗性芽誘導率的影響.的結(jié)果表明,供試的3個品種與農(nóng)桿菌菌株SE都具有較好的親和性,Km抗性芽誘導率和平均芽數(shù)均無顯著差異,但沙田柚抗性芽的生長勢強于錦橙和新會橙.

9、衰1供試品種外拄體的Km抗性芽誘導頻率"Table1InductionequencyofKmshootsfromexplantsofthreevarieties上胚軸Epieotyl子葉Cotyledon感蘭散.ofexplaatswi感No.of散.囂圣infeetedshoots(FTqy,)PpJ】n'octedstoo侶(Fr'equertv,)PpJ"在古50#g/mlKm和500gg/mlCarb的誘芽(篩選)培養(yǎng)基(Ms+2mg/LBA+0.25mg/LIAA)中培養(yǎng)30d的統(tǒng)計值Scoredafterculturing30daysOnshoo

10、tinductionmedium(MS+2mg/LBA+0.25mg/LIAA+50#g/ridKm+500vg/mlC,Brb)2.1.2預培養(yǎng)時間柑桔組織培養(yǎng)中,從外植體直接再生不定芽的初期階段,培養(yǎng)基中的脅迫壓力(如NaCI,Kin)會降低誘芽率;在遺傳轉(zhuǎn)化時,農(nóng)桿菌的侵染亦會對外植體切口處細胞造成一定的傷害.因此.本文探討了共培養(yǎng)后,外植體進入含Km的篩選培養(yǎng)基之前在僅含Carb的誘芽培養(yǎng)基(Ms+2mg/LBA+0.25rag/LIAA)中預培養(yǎng)的時間對Km抗性芽誘導率的影響.從圖2可以看出,預培養(yǎng)可促進Km抗性芽的誘導,誘芽率隨預培養(yǎng)時間中國農(nóng)業(yè)科學3o卷的延長而上升;但超過10d

11、誘芽率幾乎不再增高,這可能是由于無篩選壓力時預培養(yǎng)可促進外植體的"啟動",而10d左右外植體的啟動"基本完成.此外,預培養(yǎng)010ci后篩選獲得的Km抗性芽約有8o可檢測到Nopaline的存在,而預培養(yǎng)1020d后篩選此,共培養(yǎng)后710d的預培養(yǎng)能有效地提高Km抗性芽的誘導率若預培養(yǎng)時間超過10d,誘導率不再升高,且可能形成一些較大的未轉(zhuǎn)化芽而"逃避(escape)Km篩選,從而導致假陽性率上升.長作用由于外植體在誘芽(篩選)培養(yǎng)基中培養(yǎng)獲得的抗性小芽在相屙培養(yǎng)基上生長十分緩慢,因此將具芽外植體轉(zhuǎn)入附加較高濃度(75g/m1)Km的芽伸長培養(yǎng)基上使小芽一

12、*哺蝤047101520預培養(yǎng)時問fd)Dtopfuh眥I圉2預培養(yǎng)時間對Km抗性芽誘導頻率的影響cultureolldurationKmshootinductionfrequencyinJinchengorange表明(表2),GA對不定芽伸長具有明顯的促進作用,其適宜濃度為0.10.25mg/L;當濃度高于0.5mg/L時,部分抗性芽的小葉葉柄基部愈傷化,隨后葉片脫落,芽褐化死亡與誘芽培養(yǎng)基不同,附加低濃度的BA和IAA的培養(yǎng)基更利于芽的伸長.此外,由于活性碳能吸看出,供試3個品種Km抗性芽伸長的最適培養(yǎng)基均為MS+BA(o.1ing/L)+IAA(o.1ing/L)+GA(O.25rag

13、/L)+活性碳(3,v/w)+Km(75,ug/m1)+Carb(250g/m1).2.2.1在生根培養(yǎng)基中生根將lcm以上,健壯的Km抗性芽轉(zhuǎn)入表3的兩種含lO0g/mlKm的生根培養(yǎng)基,生根率很低(均低于15,兩種培養(yǎng)基中3個品種未經(jīng)轉(zhuǎn)化的對照芽生根率均為0,數(shù)據(jù)未列出),30d左右根長僅23cm(圖版一3).在生根培養(yǎng)基中培養(yǎng)45d左右,獲得的擬轉(zhuǎn)化植株生長變得緩慢,根和莖幾乎不再伸長.此時,將其從試管中取出,按常規(guī)方法移栽到花盆中;或取擬轉(zhuǎn)化植株莖芽作接穗,嫁接到溫室中砧木上.目前以直接誘根法共獲得2株轉(zhuǎn)化植株,生長良好.2.2.2離體微嫁接大多數(shù)柑桔品種在離體培養(yǎng)中生根都比較困難,因

14、而已報道采用試管微嫁接法使離體培養(yǎng)的小芽成株,.由于本研究中3個品種的Km抗性芽離體生根率都很低,因此我們也嘗試用類似于離體莖尖嫁接的方法以lcm左右,健壯的抗性芽作接穗嫁接在15d齡的試管實生錦橙或枳砧上,嫁接植株培養(yǎng)在裝有液體MS培養(yǎng)基(蔗糖7.5)的試管中,3od左右轉(zhuǎn)化芽(接穗)明(圖版4).目前溫室中已確認的轉(zhuǎn)基因植株絕大部分是通過離體微嫁接方法成株的.3期陳菩春等:根癌農(nóng)桿菌介導柞蠶抗菌肽D基田轉(zhuǎn)化柑桔的研究l1衰2培養(yǎng)基對上胚軸形成的Km抗性小芽伸長的影響"Table2EffectofmediumonelongationofKmshootsproducedfromepi

15、cotyl培養(yǎng)基附加成分"SupplementaryComponentsofmedia錦橙BAIAAGA活性碳接種的具()芽上旺軸教"carbonhypoeotyla()withKmrshOOtsIno=山ted新會橙Xinhniorange沙田柚Sharianpummeo培養(yǎng)30d后接種的具培養(yǎng)30d后接種的具Km抗性芽仲長芽上旺軸Km抗性芽伸長芽上旺軸的上胚軸教(伸教的上胚軸教(伸教"長頻率,)長頻率,)hypocotylshypocotylshypocotylshypcotylswithelongatedwithKItrwithelongetedwithKm

16、KmrshootsshootsKItrshootsshootsafter30daysiaocuLatedafter30daysinoculated培養(yǎng)30d后Km抗性芽伸長的上旺軸教(伸長頻率,)hypocotylswithelongatedKItrshootsafter30daysculturecultureculture(Elongationfrequency,)(Elongationfrequency,)(Elongationfrequency-)30d的統(tǒng)計值I繼代間隔期為I5dScoredafter30daysofcultureIsubcultureinterval-ws15days

17、"基幸培養(yǎng)基為MS培養(yǎng)基,各培養(yǎng)基組合還附加7S/mlKm和250/zg/mlCarbBasalmediumwasMSmedium.A11mediacontained75FR/mlKmand250"g/mlCath"具芽上胚軸指在古50g/mtKm和500.us/mlCarb的誘芽(篩選)培養(yǎng)基中培養(yǎng)30d后形成抗性小芽的上胚軸,這些抗性小芽于0,5cmEpicotylswithKmshootsiDealleSthattheKmshootswereformedoi3.thewoundsitesofepieo,ylwhichwerecuI-turedonshooti

18、nduction(selecting)mediumcontaining5O/l1Kmand500g/mlCathfor30days,Theheightof衰3培養(yǎng)基對Km抗性芽生根頻率的影響Table3EffectofmediumontootingfrequencyofKmshoots錦橙(Jinorange)新會橙(Xinhuiorange)沙田柚(Shatianpummelo)接種Km抗培養(yǎng)30d后接種Km抗培養(yǎng)30d后接種Km抗培養(yǎng)30d后性芽總數(shù)生根的抗性性芽總數(shù)生根的抗性性芽總教生根的抗性芽教芽數(shù)芽數(shù)生根培養(yǎng)基)(誘根率,)(誘根率?)(誘根率,).Km"shootsot5

19、afterKm"shootsrootsafterKin'shootsrootsBfterinoculatedculturinginoculatedculturinginoculatedculturing30days(Frequency,)30days(Frequency,)30days(Frequency,)"均附加Ioo.Lg/mlKmIM,IAA難度單位mg/LRootingmediumcontained100Fg/mlKmIConcentrationunitofBA,IAA:mg/L為了檢測鑒定標記nos基因的表達,取Km抗性芽及溫室中擬轉(zhuǎn)化植株的葉片制樣進行

20、胭脂堿(Nopaline)檢測.紙電泳結(jié)果表明,80以上的Km抗性芽和植株的葉中均可檢測到Nopaline的存在,對照(未經(jīng)轉(zhuǎn)化)植株則只有精氨酸而無NopaIine(圖版一5).可以中國農(nóng)業(yè)科學30卷看出,nptI基因和nos基因的表達具有較好的一致性.但可能由于使用基因,載體質(zhì)粒的結(jié)構和Km篩選策略不同,Moore等."在用報告基因(gus)進行的柑桔遺傳轉(zhuǎn)化中,Km抗性與gus基因表達的一致性較差(僅05.2),因而他們認為只用Km篩選轉(zhuǎn)化體是極不定標記的一致性,這樣可提高轉(zhuǎn)化效率.NOS抗性芽和NOS植株葉片的Southernblot分析結(jié)果表明,抗菌肽D基因已經(jīng)整合到錦橙,

21、新會橙和沙田柚的基因組中(圖版一6,7,8)68.0(17/25),58.3(7/12),62.5(5/8)的錦橙,新會橙和抄田柚的NOS抗性芽或NOS植株的葉片具有較強的雜交信號其余3241.7的NOS抗性芽或NOS植株的葉片是假陽性,這可能與nos檢測方法粗略,部分轉(zhuǎn)基因芽或植株為嵌合體以及nos的產(chǎn)物(Nopaline)可參與植物代謝有關.目前,已獲得的3個品種轉(zhuǎn)基因植株在溫室中生長良好,高達lm左右(圖版一9).本研究是國內(nèi)外源目的基因成功地導入柑桔的首次報道.國外迄今亦僅見Moore等.溫室抗病性評價正在進行中.參考文t許耀,等.植物組簪i中冠裹堿合成瞢活性誼的一種筒梗有效方法.遺傳

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