高效液相—核磁共振聯(lián)用技術(shù)在中藥分析中的應(yīng)用

1、GUANGOONG PHARMACEUTICAL UNIVERSITY藥物分析綜述題目：液相一核磁共振聯(lián)用技術(shù)在中藥分析中的應(yīng)用組員姓名：黃志華、竇文淵、彭 改柏所在學(xué)院：藥科學(xué)院專業(yè)班級(jí)：藥學(xué)05 (5)班學(xué)號(hào)：0503501564、0503501565、0503501535日期：2008-6-2液相核磁共振聯(lián)用技術(shù)在中藥分析中的應(yīng)用摘要 :HPLCNM能用技術(shù)是一種高效、快速獲得混合物中未知化合物結(jié)構(gòu)信息的術(shù)，近年 來(lái)，它在藥物研究中的應(yīng)用日益廣泛。本文介紹了 HPLbNM能用技術(shù)及其在中藥分析中 分離、結(jié)構(gòu)鑒定、構(gòu)型分析等方面的一些研究應(yīng)用。關(guān)鍵詞 :液相核磁共振聯(lián)用技術(shù)（LC NMR）

2、 中藥分析中藥是中華民族的瑰寶，數(shù)千年來(lái)，中藥對(duì)中國(guó)人民的醫(yī)療保健發(fā)揮了巨大的作用特別是隨著我國(guó)加入世界貿(mào)易組織后，以仿制為主的西藥研制將遇到嚴(yán)重挑戰(zhàn)，中藥己成為我國(guó)最有優(yōu)勢(shì)的研究與開(kāi)發(fā)領(lǐng)域。充分利用現(xiàn)代科學(xué)技術(shù)的方法和手段，按照國(guó)際認(rèn)可的醫(yī)藥標(biāo)準(zhǔn)規(guī)范，研究開(kāi)發(fā)能夠正式進(jìn)入國(guó)際醫(yī)藥市場(chǎng)的中藥產(chǎn)品，推動(dòng)中藥的現(xiàn)代化，不僅具有經(jīng)濟(jì)效益也具有巨大的社會(huì)效益。在這其中，中藥及其復(fù)方的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)研究是中藥現(xiàn)代化研究的重點(diǎn)與突破口，它關(guān)系到藥材、飲片，中藥制劑和中成藥產(chǎn)品等的質(zhì)量 控制等。中藥的真?zhèn)舞b別和品質(zhì)評(píng)價(jià)是臨床應(yīng)用、成藥制備、中藥科研不可缺少的前提條件。我國(guó)藥材品種繁多，存在南北差異、同名異物、

3、同物異名等情況，混淆品極多，療效也各不相同。 而且中藥的有效成分和環(huán)境、產(chǎn)地、 采收季節(jié)等因素也有很大關(guān)系。加之近年來(lái)，假冒偽劣中藥充斥市場(chǎng)，為控制中藥質(zhì)量、保證臨床用藥安全和有效，需要對(duì)中藥進(jìn)行嚴(yán)格鑒定。隨著科技不斷發(fā)展，從最原始的眼觀、鼻聞、口嘗、手摸到顯微鑒別和理化鑒別，再到光譜、色譜等現(xiàn)代技術(shù)的應(yīng)用，中藥鑒定技術(shù)越來(lái)越多元化。但每一種分析技術(shù)均有其適用范圍和局限性，將單一的分析技術(shù)聯(lián)合起來(lái)，不僅能獲得更多的信息，而且可能產(chǎn)生單一分析技術(shù)所無(wú)法得到的新的信息。因此，聯(lián)用技術(shù)已成為中藥鑒定發(fā)展的一個(gè)重要 方向。HPL®然是復(fù)雜成分的分離中最有力的工具，微處理機(jī)的應(yīng)用，簡(jiǎn)化了儀器操

4、作，并 能夠?qū)崿F(xiàn)全自動(dòng)化，應(yīng)用極為廣，通過(guò)UVT變波長(zhǎng)檢測(cè)器，可獲得一些化合物的附加信息， 但信息量非常有限，對(duì)活性成分的結(jié)構(gòu)鑒定幫助不大。NMRg夠提供大量的結(jié)構(gòu)信息,包括立體化學(xué)信息（在某些情況下，它不需其他光譜的 信息，就能解析未知物的結(jié)構(gòu)）。因此NM時(shí)中藥中活性成分的結(jié)構(gòu)鑒定有很大的幫助。毫 無(wú)疑問(wèn)，HPLO NM能用技術(shù)對(duì)中藥的分析研究中活性成分的分離和結(jié)構(gòu)鑒定的速度將大 大提高。以下對(duì)HPLG-NM能用技術(shù)操作及在中藥中的分析應(yīng)用作簡(jiǎn)單的介紹。1. HPLCNM能用技術(shù)HPLC-NM能用技術(shù)的研究開(kāi)始于20世紀(jì)70年代，早期發(fā)展十分緩慢，主要是因?yàn)楫?dāng) 時(shí)NMR的靈敏度還較低，溶劑峰

5、抑制問(wèn)題也尚未解決。近年來(lái)HPLC-NMR用技術(shù)的迅速發(fā)展得益于NM波譜儀磁場(chǎng)強(qiáng)度的提高、HPLC-NM即用探頭的設(shè)計(jì)及溶劑峰抑制技術(shù)的發(fā) 展，從而解決了動(dòng)態(tài)變化、靈敏度及溶劑抑制（ 尤其是梯度系統(tǒng)） 的問(wèn)題。當(dāng)時(shí)該儀器可采用停止流動(dòng)模式, 隨后不久連續(xù)流動(dòng)模式打通, 從此以后, 隨著儀器設(shè)計(jì)、磁場(chǎng)強(qiáng)度、流動(dòng)探頭等方面研制水平的提高與改進(jìn), 以及有效的壓制溶劑峰的脈沖序列的建立, 使得這項(xiàng)技術(shù)現(xiàn)在已廣泛應(yīng)用到實(shí)際工作中。1.1 基本操作模式LC- NM能用技術(shù)主要有三種操作模式：連續(xù)流動(dòng)操作模式、停流操作模式和峰存貯操 作模式。1.1.1 連續(xù)流動(dòng)（on-flow ）操作模式：樣品由HPLCT

6、規(guī)檢測(cè)器（UW）出口，用毛細(xì) 管直接連接到專用NM睬頭的液槽，毛細(xì)管的長(zhǎng)度為2ml隨著分離連續(xù)獲得NM圖譜，一次 分析可得到所有組分的NMRF息，然而由于樣品溶液濃度低，NM采樣時(shí)間短（通常掃描16 次），很難得到分辨率良好的NM圖譜。1.1.2 停流（stop-flow）操作模式：當(dāng)樣品色譜峰最高點(diǎn)到達(dá) NM藏槽的中心位置時(shí)， 停止流動(dòng)，進(jìn)行一維或二維NM采樣，直至獲得良好的NM圖譜。然后再啟動(dòng)輸液，恢復(fù)正 常HPL條件，繼續(xù)下一色譜峰的NM測(cè)定。在出峰時(shí)停泵，可以獲得較好的 NM圖譜。1.1.3 峰存貯操作模式：當(dāng)欲分析組分較多而各組分的含量較低時(shí)，為避免由于多次暫停LS離而帶來(lái)峰擴(kuò)散現(xiàn)象

7、，可采用峰存貯操作模式。正常色譜分離時(shí)當(dāng)UV僉測(cè)到色譜峰時(shí)將流出物收集并暫時(shí)貯存到不同的毛細(xì)管回路內(nèi)，由NM譜儀逐一離線測(cè)定各流分。該模式下的樣品需要量低于停流操作。這樣既不中斷 HPLCi程，又能獲得全部成分的良好 的NMR譜。除用毛細(xì)管回路貯存色譜成分外，還有小柱截留法。1.2 溶劑峰抑制方法大多數(shù)HPL呼系采用反相柱，使用2種或3種溶劑的混合物作洗脫液，除D2。卜,其它笊 代溶劑作為常規(guī)洗脫液太昂貴。因此，在線反相HPLC - NMR；驗(yàn)中常采用含質(zhì)子的溶劑，如 CH3 CN和CH3 OH等。常用的MeOH - H2 O和MeCN - H2#系在NMR有很強(qiáng)的響應(yīng)值，可 能掩蓋分析對(duì)象。

8、為了消除NM波譜儀接收器的動(dòng)態(tài)范圍問(wèn)題，溶劑質(zhì)子信號(hào)必須加以抑制常用的方法有:(1)采用笊41溶劑，但價(jià)格昂貴,適合于仙HPLC(2) 通過(guò)不同頻率通道進(jìn)行多重溶劑峰預(yù)飽和。(3) 脈沖梯度場(chǎng)的相位離散而消除溶劑干擾。近年來(lái)由于毛細(xì)管HPLC勺發(fā)展，溶劑的消耗量大為減少,在實(shí)驗(yàn)中有可能完全使用笊代試劑作洗脫液, 不必使用溶劑抑制。1.3 靈敏度的提高提高HPLC - NM或敏度的方法有：(1)利用SP曲方法濃縮樣品。要得到高分辯的譜圖，溶液中不能有懸浮的灰塵和纖維。一般情況下用棉花和濾紙把樣品直接過(guò)濾到樣品管中。測(cè)試微量樣品時(shí), 要帶手套處理樣品,以防手指上的微量物質(zhì)溶在溶液中，否則1H譜中6

9、 1.4會(huì)出現(xiàn)一個(gè)7 Hz裂分的雙峰, 64還有一個(gè)四重峰，可能來(lái)自丙氨酸或乳酸。(2)提高磁場(chǎng)強(qiáng)度(900 MHz NMRS經(jīng)商品化)。核磁譜儀場(chǎng)強(qiáng)的不斷升高，從某種程度 上增加了 NM的靈敏度和分辯力.從1987年第一臺(tái)600MHz勺NM敝,到現(xiàn)在已經(jīng)發(fā)展到 900MH 才。(3) 降低探頭溫度(商品化的低溫探頭) 。利用高溫超導(dǎo)薄膜材料而制成的超導(dǎo)低溫探頭 , 當(dāng)樣品溫度由溫控單元維持時(shí), 采用閉環(huán)或開(kāi)環(huán)制冷系統(tǒng)使超導(dǎo)線圈溫度降到25K, 消除了譜圖的電噪聲，相對(duì)常規(guī)5 m麻頭而言，其潛在靈敏度可以提高810倍。國(guó)內(nèi)已有 此類探頭使用，500MHz信噪比達(dá)3 200 ： 1,可達(dá)到800

10、MH水平。2. HPLCNM鹿中藥分析中的應(yīng)用2.1 HPLCNM能用技術(shù)在檢測(cè)植物藥有效成分中的應(yīng)用2.1.1 半夏水提取物中的應(yīng)用陳平、梁世瓢等利用HPLC-NMRt半夏水提取物中8種化合物的結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析.他們采用 Loop-collection (環(huán)收集方式)的工作方式，將液相分離后不同組分分別收集在不同餾分收集環(huán)(Loop) 里，然后逐個(gè)注入流動(dòng)探頭，再根據(jù)化合物濃度不同, 進(jìn)行不同采樣時(shí)間的核磁共振檢測(cè)，根據(jù)需要增加低濃度樣品的核磁采樣時(shí)間。由實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析而得半夏水提取物中的8種化合物分別是胞昔、酪氨酸、尿普、腺喋吟、鳥(niǎo)營(yíng)、苯丙氨酸、腺營(yíng)和色氨酸(Figure2-6)。實(shí)驗(yàn)過(guò)程中被測(cè)

11、組分從100P中進(jìn)入NMRb析，在數(shù)據(jù)采集前必須利用溶劑抑制技術(shù)去除流動(dòng)相產(chǎn)生的巨大的共振信號(hào)的干擾。使用溶劑抑制技術(shù)帶來(lái)的一個(gè)問(wèn)題是如果被測(cè)化合物的NM聯(lián)振信號(hào)恰好在溶劑峰包埋之下，則這些信號(hào)將與溶劑信號(hào)一樣被壓掉。當(dāng)被測(cè)化合物是未知化合物時(shí)，這些信號(hào)的缺失將會(huì)嚴(yán)重。2.1.2 對(duì)蛇葡萄根的化學(xué)成分的研究王映紅、李娜等通過(guò)用HPLG-NMRO寸葡萄科蛇葡萄根的化學(xué)成分進(jìn)行研究。在 INOVA 1 2500 LC-NMR:,用停止流動(dòng)的萬(wàn)法米集LC NMR H- NMRf及WEGCOSY進(jìn)樣量為25 祖 L , 1H NMRif采樣時(shí)間為 1.5 s ,累加次數(shù)為 416。WETG2COSYF

12、1 , F 2 均為60000. 0 Hz , nt = 24 , n i = 128，總采樣時(shí)間為1h7min37。由結(jié)果鑒定出其中主要成分的結(jié)構(gòu)為 一白藜蘆醇四聚體Vitisin B 。2.1.3 對(duì)長(zhǎng)葉框樹(shù)中的木脂素類化合物的分析Zha常用停止流動(dòng)HPLC-NMR別了紫杉科植物長(zhǎng)葉框樹(shù)中的木脂素類化合物。長(zhǎng)葉框 樹(shù)針葉樣品經(jīng)提取、固相提取等預(yù)精制后，以梯度洗脫HPLG得8個(gè)化合物峰，通過(guò)停止流動(dòng)方法記錄1H NMRI,再結(jié)合EI-MS等對(duì)其中7個(gè)化合物作了結(jié)構(gòu)研究。峰1-6分別為化 合物絡(luò)石昔元、去甲絡(luò)石糖昔元、牛芬昔元、歐側(cè)柏內(nèi)醋甲基醚、松脂素和甲基松脂素。1峰7的HPLC-HNMR與

13、1-6的不同，提小為一個(gè)新木脂素型化合物。 峰8通過(guò)HPLO NM測(cè)定， 表明是一個(gè)未知結(jié)構(gòu)的非木脂素類化合物。2.1.4 對(duì)棕櫚油提取物的分析StrohscheinL等以QoHPLO NM能用研究了富含維生素E同系物的粗棕植I油提取物。通 過(guò)對(duì)圖譜分析分離、鑒定去粗棕楣油提取物中有6 和丫 -型生育三烯酚、B -型生育三烯、a一生育三烯酚、a一生育酚、a一生育烯酚。本方法用甲醇作為流動(dòng)相而不需加緩沖 液的色譜條件對(duì)聯(lián)用技術(shù)來(lái)說(shuō)是理想的。2.1.5 山藍(lán)色素前體分子組成與化學(xué)變化的研究謝運(yùn)昌、文永新等用HPLC- NM能用技術(shù)研究山藍(lán)中山藍(lán)色素前體的分子組成與化學(xué)1變化，由分析H-NM圖譜表明

14、山藍(lán)色素前體分子有由2個(gè)紫藍(lán)氨酸殘基和1個(gè)氨基酚殘基鍵合而成的片段，在室溫下放置后，氨基酚結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)變?yōu)轷Y(jié)構(gòu)。研究結(jié)果為山藍(lán)色素前體、山藍(lán)色素及其相關(guān)化合物的結(jié)構(gòu)測(cè)定提供了重要數(shù)據(jù)為山藍(lán)色素的化學(xué)、山藍(lán)色素形成機(jī)理的闡明起到了關(guān)鍵作用。2.1.6 LC -NM能用技術(shù)分析黃連中微量生物堿的研究王愛(ài)國(guó)、馮幸章等運(yùn)用INVOA 500 LC-NM能用儀對(duì)黃連中彳量生物堿進(jìn)行LC-NM研 究,分別測(cè)定幾個(gè)微量成分的1H- NMR根據(jù)LC-NM伸析，推定黃連總堿中幾個(gè)微量成分 為化合物 (1) 為 5一羥基一13一甲基小檗堿；化合物(2) 為 5- 羥基一棕櫚堿；化合物(3) 為 13一甲基小檗堿；化合

15、物(4) 為棕櫚堿，該研究對(duì)黃連成分的研究有重要的指導(dǎo)意義。2.2 HPLCNMRt雙氫青蒿素差向異構(gòu)體轉(zhuǎn)化的研究劉寧、楊臘虎等通過(guò)HPLC-NM敝對(duì)雙氫青蒿素進(jìn)彳T分離和測(cè)定。在 HPL電譜條件下 所分離而得的2個(gè)異構(gòu)體以工作頻率為500MHz勺NM敕進(jìn)行分析，用笊代甲醇為溶劑，并兼 作化學(xué)位移內(nèi)標(biāo)，在室溫下對(duì)溶解在笊代甲醇30min后和異構(gòu)體轉(zhuǎn)化平衡時(shí)進(jìn)行氫譜檢測(cè)。 在對(duì)實(shí)驗(yàn)初期和放置一段時(shí)間后的1H NM圖譜比較，在1H NM圖譜中明顯一個(gè)峰位高低 轉(zhuǎn)化的過(guò)程, 說(shuō)明雙氫青蒿素在溶液中存在異構(gòu)體的轉(zhuǎn)化過(guò)程。并由圖譜得出2個(gè)異構(gòu)體的1H-NM圖譜主要在5位HT12位Hft學(xué)位移6值有明顯的

16、差異。2.3 LC-NMR在用血清藥化學(xué)方法對(duì)單味中藥內(nèi)活性成分進(jìn)行研究中的應(yīng)用楊春、梁曉天等以“血清藥物化學(xué)”方法為研究思路，用 LC-NM能用技術(shù)對(duì)服用當(dāng) 歸后大鼠的血清樣品進(jìn)行研究，分析其中的活性成分。用HPC法在大鼠服藥后的血清中發(fā)現(xiàn)了 5個(gè)當(dāng)歸活性成分，在肝臟中發(fā)現(xiàn)8個(gè)當(dāng)歸活性成分。用HPLC-NM能用技術(shù)對(duì)肝臟和 血清中2個(gè)主要活性成分研究表明，它們?yōu)槟緝?nèi)酯和 6, 7一二羥基一 3a, 6, 7, 7a-四氫 藁本內(nèi)酯。在服藥后大鼠的肝臟中，阿魏酸的含量最高，而6, 7- 二羥基 -3a,6,7,7a- 四氫藁本內(nèi)酯的含量比藁本內(nèi)酯高。在血清中，6, 7- 二羥基 -3a,6,

17、7,7a- 四氫藁本內(nèi)酯的含量最高，而藁本內(nèi)酯的含量較低，未發(fā)現(xiàn)阿魏酸。在大鼠 服 藥后 1.Oh 的肝臟中發(fā)現(xiàn)阿魏酸的含量最高，而藁苯類化合物的含量并不高。這可能由于阿魏酸的水溶性大，而藁苯類 為脂溶性化合物，因此阿魏酸在體內(nèi)吸收較好。但在1.Oh 的血液中并未發(fā)現(xiàn)它的存在，可能其代謝較快。由于體內(nèi)生物樣品中的活性成分來(lái)源于中藥，在排除代謝產(chǎn)生的成分后，通過(guò)對(duì)中藥中相應(yīng)成分的檢測(cè)，可知中藥在體內(nèi)的活性成分，這為中藥的研究提供了一種 新的思路。總結(jié)實(shí)踐證明HPLC- NMR在結(jié)構(gòu)具有規(guī)律性的同類化合物的鑒定中，可起到提高工作效 率、避免盲目重復(fù)勞動(dòng)的作用. 在中藥分析的提取分離工作中不但有指導(dǎo)

18、作用, 還可以提供較為準(zhǔn)確的光譜信息, 排除雜質(zhì)的干擾, 大大降低了中藥中混合物結(jié)構(gòu)分析的難度，從而可以確定其結(jié)構(gòu)和立體構(gòu)型。在過(guò)去幾年里，雖然HPLC- NM能用技術(shù)的靈敏度已大大提高，并在分離和鑒定上有 了一些成功的應(yīng)用，但仍不夠滿意，柱與池間以及池本身造成的峰擴(kuò)散需進(jìn)一步降低。不斷提高NM的靈敏度和色譜光譜分辨能力，使得實(shí)驗(yàn)結(jié)果更準(zhǔn)確可靠。參考文獻(xiàn)1. 劉文英 藥物分析第 6版人民衛(wèi)生出版社；2. 徐蘇麗 聯(lián)用技術(shù)在中藥研究中的應(yīng)用海峽藥學(xué)2007年第19卷第6期；3. 張亮，張正行HPLC/NM瞅用技術(shù)及其在藥物分析中的應(yīng)用國(guó)外醫(yī)學(xué)藥學(xué)分冊(cè) 1991 年 第 18卷第 4期；4. 陳平

19、，梁世瓢，李川，宋國(guó)強(qiáng)液核聯(lián)用（LC/NMR而液質(zhì)聯(lián)用（LCIMS）的結(jié)合用于中藥多成分化學(xué)結(jié)構(gòu)的分析（ 該分析技術(shù)平臺(tái)的建立及其在分析半夏水提物中的應(yīng)用 ） 中國(guó)藥學(xué)會(huì)學(xué)術(shù)年會(huì)論文集2002: 742-744 ；5. 王映紅 , 李 娜 , 賀文義等高效液相2核磁共振儀聯(lián)用技術(shù)及微量探頭技術(shù)在天然產(chǎn)物分析中的應(yīng)用波譜學(xué)雜志2002 年 9月第 19卷第 3期；6. 靳朝東 色譜聯(lián)用技術(shù)在檢測(cè)植物藥有效成分中的應(yīng)用國(guó)外醫(yī)藥植物藥分冊(cè) 2002 年 第 17卷第 4期；7. 謝運(yùn)昌，文永新，蔣小華等山藍(lán)色素前體分子組成與化學(xué)變化廣西植物Guihaia 23 （ 4）：367 369 2003 年 7月；8. 王愛(ài)國(guó)，馮幸章，李立軍等千金黃連丸加味治療糖尿病的物質(zhì)基礎(chǔ)研究利用LC-MS/MSiLC- NMR用技術(shù)分析黃連中微量生物堿分析測(cè)試學(xué)報(bào)2001Vol.20 No.z1 P.63-64 ；9. 劉寧，楊臘虎，張正行，俞如英雙氫青蒿素差向異構(gòu)體轉(zhuǎn)化的研究藥物分析雜志22 （ 4），2002；10. 楊春 核磁共振技術(shù)在藥物研究復(fù)雜體系中的應(yīng)用博士學(xué)位論文中國(guó)協(xié)和醫(yī)科大學(xué)2001 年 5月；11. Wils