鼠尾膠原制備

1、鼠尾膠原是一種天然培養(yǎng)基，它具有促進(jìn)體外培養(yǎng)細(xì)胞（特別是上皮細(xì)胞）貼壁的作用，同時(shí)它也是一種天然的黏附劑， 當(dāng)我們需要在培養(yǎng)瓶或培養(yǎng)皿內(nèi)放置小玻片， 制備細(xì)胞爬片時(shí)， 可在瓶底涂一層膠原， 再放上小玻片，自然干燥后小玻片就固定于培養(yǎng)瓶之中。通過(guò)本實(shí)驗(yàn)可掌握鼠尾膠原的制備方法，以及如何切割小玻片，并利用鼠尾膠原將其固定于培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)。實(shí)驗(yàn)設(shè)備及材料：大鼠尾巴、剪刀、鐐子、止血鉗、彎頭吸管、平皿、三角燒瓶、燒杯、量筒、天平、生理鹽 水、75%酒精、0.1%醋酸溶液、蓋玻片、培養(yǎng)瓶、鉆石筆、鼠尾膠原。實(shí)驗(yàn)內(nèi)容：1、制備鼠尾膠原。2、切割小玻片。3、利用鼠尾膠原將小玻片固定于培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)。實(shí)驗(yàn)步驟：制備鼠尾膠

2、原：1、取大鼠尾巴洗凈，75%酒精浸泡5分鐘；2.將尾巴剪開、去掉皮毛，并剪成小段，抽出銀色的尾鍵3、將尾腱剪斷置于平皿中，生理鹽水浸泡；4、重復(fù)步驟2、3,直至尾腱量夠用；5、吸去生理鹽水，將尾腱稱重（0.5-1克）；6、將尾腱置于平皿內(nèi)剪碎，轉(zhuǎn)移至三角燒瓶中；7、按每克尾腱50ml的比例，加入0.1%醋酸溶液；8、搖晃，使尾腱分散于醋酸溶液中，4 c放置一星期；9、離心，4000轉(zhuǎn)/分，10-15分鐘；10、吸取上清，分裝成小瓶，4 c保存。醋酸的配置：36 %的醋酸如何配制成0.1mol/L的醋酸溶液先計(jì)算36%的醋酸的摩爾濃度（mol/L）,稀釋相應(yīng)的倍數(shù)到0.1mol/L。一般來(lái)說(shuō)，

3、常溫下溶質(zhì)是固體的，其溶液的百分比濃度（）是質(zhì)量比體積；而常溫下溶質(zhì)為液體時(shí)，其溶液百分比濃度是體積比體積。醋酸常溫下為液態(tài)，故36 %是體積比體積，100毫升溶液中含36毫升的醋酸。醋酸的相對(duì)密度為1.05 ,故36毫升醋酸的質(zhì)量為36 X1.05=37.8克；醋酸的分子式 CH3COOH ,分子量為60,故36毫升醋酸的摩爾數(shù)為 37.8與0=0.63（mol）,故36 %的醋酸溶 液的摩爾濃度為0.63至.1=6.3（mol/L）。取1份36 %的醋酸溶液，再加 62份的水，即成0.1mol/L。依次類推、鼠尾膠原-鼠尾I型膠原蛋白鼠尾膠原蛋白SDS-PAGE電泳對(duì)比簡(jiǎn)介鼠尾I型膠原蛋白

4、（Collagenfromrattail,TypeI ）系采用Birkedal-Hansen方法在無(wú)菌下制備，純度達(dá)到95%以上，可溶于 0.006mol/L乙酸。本品可用于細(xì)胞培養(yǎng)皿的包被，特別適合普 通細(xì)胞培養(yǎng)器皿不易貼壁細(xì)胞的培養(yǎng)；也可用于制備三維膠原凝膠，使細(xì)胞在模擬的三維環(huán)境中生長(zhǎng)。質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)1、SDS-PAGE分析純度大于 95%。2、無(wú)菌檢驗(yàn)結(jié)果為陰性。3、本品2g/cm血被細(xì)胞培養(yǎng)皿后培養(yǎng)PC-12細(xì)胞，貼壁及生長(zhǎng)正常。4、本品濃度1mg/mL, pH7.0時(shí)形成具有一定強(qiáng)度的三維膠原凝膠，NIH-3T3細(xì)胞在三維凝膠內(nèi)生長(zhǎng)正常、PC-12細(xì)胞在三維凝膠表面生長(zhǎng)正常。使用方法1、

5、細(xì)胞培養(yǎng)器皿的表面包被以包被濃度為2g/cm2為例，用無(wú)菌0.006mol/L乙酸將膠原蛋白稀釋到 0.012mg/mL。加到 相應(yīng)的培養(yǎng)器皿中，確保膠原蛋白溶液鋪滿器皿的表面。開蓋在超凈臺(tái)上過(guò)夜晾干， 也可以在室溫放置1小時(shí)后，用PBS洗34次后直接使用。包被好的器皿在 425c至少可保存三 個(gè)月以上的時(shí)間。2、三維膠原凝膠的制備A、無(wú)細(xì)胞三維膠原凝膠的制備（以配制1mg/mL三維膠1mL為例）將200 dL本品加到置于冰浴的離心管中，加入690dL雙蒸水，然后加到 12dL0.1mol/LNaOH中（如果反過(guò)來(lái)把12 dL0.1mol/LNaOH加到膠原溶液中，會(huì)由于NaOH不能迅速混勻而

6、產(chǎn)生局部的膠原凝結(jié)），立即混勻。再加入100wL10X PB械10><養(yǎng)液，混勻后立即加到培養(yǎng)器皿中（混勻后pH為7左右，如果PBS或培養(yǎng)液中沒(méi)有加酚紅，初次使用時(shí)需要測(cè)定pH值）。將培養(yǎng)器皿在室溫放置20min待膠凝固后，轉(zhuǎn)移到培養(yǎng)箱內(nèi)。如果配制中使用的是10XPBS,使用前需要加入適當(dāng)體積的細(xì)胞培養(yǎng)液預(yù)平衡。B、含細(xì)胞三維膠原凝膠的制備（以配制1mg/mL三維膠1mL為例）準(zhǔn)備好懸浮于培養(yǎng)液的細(xì)胞，并放置于冰浴中。將 200本品加到 12dL0.1mol/LNaOH中（如果反過(guò)來(lái)把 12科L0.1molLNaOH加到膠原溶液中，會(huì)由于NaOH不能迅速混勻而產(chǎn)生局部的膠原凝結(jié)），

7、立即混勻。再加入 23L10XPB堿10維養(yǎng)液，混勻后立即加到培養(yǎng)器皿中（混勻后 pH為 7左右，如果PBS或培養(yǎng)液中沒(méi)有加酚紅，初次使用時(shí)需要測(cè)定 pH值）。加入760 dL的細(xì) 胞懸浮液，混勻后立即加到培養(yǎng)器皿中。將培養(yǎng)器皿在室溫放置20min待膠凝固后，加入適當(dāng)體積的細(xì)胞培養(yǎng)液，轉(zhuǎn)移到培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。本品在室溫下pH中性時(shí)可迅速成膠，在操作過(guò)程中要盡量保持低溫。保存條件4c保存，切勿凍存，有效期一年。鼠尾膠原-實(shí)驗(yàn)應(yīng)用涂布鼠尾膠原探討應(yīng)用鼠尾膠原在豚鼠前庭毛細(xì)胞膜片鉗實(shí)驗(yàn)中的促進(jìn)毛細(xì)胞貼壁效果。法制作鼠尾膠原，觀察全細(xì)胞膜片鉗實(shí)驗(yàn)中，自制的鼠尾膠原對(duì)前庭毛細(xì)胞的貼壁黏附作用。 結(jié)果無(wú)鼠尾膠

8、原時(shí)， 前庭毛細(xì)胞懸浮于外液，不宜封接；有鼠尾膠原時(shí)，前庭毛細(xì)胞貼附于培養(yǎng)皿底壁，易于封接和長(zhǎng)時(shí)間（約8h）的觀察和記錄。鼠尾膠原對(duì)前庭毛細(xì)胞具有良好的貼壁黏附促進(jìn)作用。結(jié)論鼠尾膠原能促進(jìn)毛細(xì)胞貼壁，涂布鼠尾膠原有利于膜片鉗實(shí)驗(yàn)的長(zhǎng)時(shí)程記錄；并且制作簡(jiǎn)便，成本低廉。鼠尾膠原在原代培養(yǎng)耳蝸血管紋邊緣細(xì)胞中的應(yīng)用。目的：建立利用自制的鼠尾膠原培養(yǎng)大鼠耳蝸邊緣細(xì)胞的方法。方法：制作鼠尾膠原，并觀察利用自制的鼠尾膠原所培養(yǎng)出大鼠耳蝸 邊緣細(xì)胞的效果。結(jié)果：自制的鼠尾膠原能正常地培養(yǎng)出大鼠耳蝸邊緣細(xì)胞，細(xì)胞角蛋白 18表達(dá)陽(yáng)性，免疫組織化學(xué)結(jié)果和掃描電鏡證實(shí)所培養(yǎng)的細(xì)胞具有典型的分泌上皮細(xì)胞特 征。結(jié)論

9、：成功建立了利用自制鼠尾膠原培養(yǎng)大鼠耳蝸邊緣細(xì)胞的方法，并且制作簡(jiǎn)便，成本低廉。鼠尾膠原為底物的人鼻腔纖毛上皮細(xì)胞培養(yǎng)模式的建立目的建立以鼠尾膠原為貼附底物的 人鼻腔纖毛上皮細(xì)胞的體外培養(yǎng)模式，為人鼻腔黏液纖毛運(yùn)輸系統(tǒng)的研究提供科學(xué)有效的方法.方法制備鼠尾膠原并鋪片，以鼠尾膠原為貼附底物組織塊培養(yǎng)法培養(yǎng)人鼻腔纖毛上皮細(xì) 胞，培養(yǎng)7天時(shí)進(jìn)行HE染色及掃描電鏡和透射電鏡觀察細(xì)胞形態(tài)和結(jié)構(gòu)，應(yīng)用高速攝像技術(shù)測(cè)量纖毛擺動(dòng)頻率.結(jié)果鼠尾膠原要平坦均勻，平均厚度約為1mm； HE染色可見(jiàn)上皮細(xì)胞呈單層向周圍爬開；掃描電鏡下見(jiàn)纖毛上皮細(xì)胞呈不規(guī)則多角形，纖毛周圍可見(jiàn)微絨毛；透射電鏡下可見(jiàn)纖毛上皮細(xì)胞間為緊密

10、連接；同一細(xì)胞任意兩點(diǎn)纖毛擺動(dòng)頻率是相同的；同一來(lái)源體外培養(yǎng)的鉤突和下鼻甲的纖毛擺動(dòng)頻率是相同的.結(jié)論以鼠尾膠原為貼附底物人鼻腔纖毛上皮細(xì)胞的體外培養(yǎng)模式的成功建立，為今后研究鼻內(nèi)用藥對(duì)纖毛清除功能的影響提供了良好的方法和途徑。鼠尾膠原-醋酸溶解無(wú)菌室1.將鼠尾膠原加入到 0.1M的醋酸中，制備成濃度為0.1%的溶液。在室溫中攪拌1-3 小時(shí)直到完全溶解。2 .建議將溶液轉(zhuǎn)移到擰口的玻璃瓶中，并小心的在瓶底鋪上一層氯仿。氯仿的量約為膠原 溶液的10%。不要晃動(dòng)或攪拌。在 2-8度中放置過(guò)夜。在無(wú)菌條件下轉(zhuǎn)移上層的膠原溶液。我們不建議用過(guò)濾的方法無(wú)菌化。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)該方法會(huì)導(dǎo)致丟失蛋白。3 .稀釋一定數(shù)量的膠原溶液。4 .按照6-10ug/cm2的濃度包被培養(yǎng)瓶。在室溫或37度結(jié)合數(shù)小時(shí)或者 2-8度過(guò)夜。5 .從包被表面除去多余的液體。過(guò)夜干燥。如果膠原溶液不是無(wú)菌的，這時(shí)候可以在無(wú)菌細(xì)胞操作室中暴光在紫外線下過(guò)夜消毒。在接種細(xì)胞前用無(wú)菌的水漂洗。鼠尾膠原-真皮類似物的建立生友鼠尾膠原蛋白I型目的：探尋建立真皮類似物的培養(yǎng)方法。方法：原代培養(yǎng)人皮膚成纖維細(xì)胞，制備鼠尾膠原，將鼠尾膠原溶液、濃縮培養(yǎng)基、NaOH溶液和以血清重懸的成纖維細(xì)胞