黑米中花青素的抗氧化性質(zhì)研究

1、黑米中花青素的抗氧化性質(zhì)研究摘要：將粗提出的黑米花青素分別采用 Fenton反應體系、鄰苯三酚自氧化體系、普魯士藍法 來測定其對OH 和02一 的清除作用及其還原能力進行評價，并以維生素C和異抗壞血酸鈉作為實驗對照。得出黑米花青素是一種潛在的具有抗氧化活性的天然藥物。關鍵詞：黑米；花青素；自由基；抗氧化性；前言千百年來，億萬中國人民通過自身實踐總結出一句俗語“逢黑必補”。祖國中醫(yī)理論認為，黑色歸腎，腎為先天之本，乃生命之源。據(jù)神農(nóng)本草經(jīng)和本 草綱目記載，黑米具有滋陰補腎、健脾暖肝、明目活血的功效，又有“補血米”、 “長壽米”、“神仙米”的美稱。黑米含有豐富的蛋白質(zhì)、人體所必需的氨基酸、 不飽和

2、脂肪酸、維生素C及鈣、鐵、鋅等礦物營養(yǎng)元素，還含有藥用價值很高 的黑米花青素口。近20年來，陸續(xù)有研究者開展了黑米的功能評價研究，徐飛百、黃玉等先后證實了黑糯米具有防治缺鐵性貧血，提高耐缺氧能力和保護 白細胞等作用；顧德法 證實黑米具有抗應激反應和免疫調(diào)節(jié)作用?；ㄇ嗨貫楹诿字械闹饕S酮類物質(zhì)(anthocyanidin),這是一種廣泛存在于自 然界植物中的水溶性天然色素，在自然狀態(tài)下常與各種單糖形成糖甘， 稱為花色 甘。花青素作為一種天然食用色素，安全、無毒、資源豐富，而且具有一定營養(yǎng) 和藥理作用，在食品、化妝品、醫(yī)藥、保健等方面有著巨大的應用潛力20世紀80年代人們逐漸認識到消除自由基和抗氧

3、化是營養(yǎng)保健的重要前提和基礎， 而花青素作為消除自由基能力最強的、 其他抗氧化劑所無可比擬的抗氧化劑。 大 量研究表明，花青素具有很強的抗氧化作用，有助于清除體內(nèi)的自由基、降低氧 化酶的活性、抗衰老、抑制膽固醇吸收、降低低密度脂蛋白膽固醇含量、預防癌 癥、增強血管彈性、保護胃粘膜、防止心血管疾病等多種生理功能：6 o在黑米抗氧化功能評價方面：孫玲和張名位等 證實黑米水提液和60%亨 提液對氧自由基都具有不同的清除效果，且在所用的濃度范圍內(nèi)消除率與供試液 的濃度呈明顯的量效關系，相關系數(shù)達顯著或極顯著水平，提示黑米具有較強的 抗氧化性。陳文等摟一"應用黑粘米酶解液進行小鼠灌胃試驗，表明

4、黑米具有抗 氧化作用。因而研究和開發(fā)利用黑米花青素有著良好的前景。異Vc鈉和Vc是食品加工過程中常用的兩種抗氧化劑。本實驗對黑米中花 青素與異Vc鈉和Vc的抗氧化性進行了比較，結果顯示，黑米花青素具有較強 的抗氧化性能。1材料1.1 供試材料實驗室粗提的黑米花青素1.2 主要儀器設備紫外-可見分光光度計、電子天平、恒溫水浴鍋、離心機、電爐、石棉網(wǎng)、 容量瓶、三角瓶、燒杯、試管、量筒、玻璃棒、移液管等。1.3 主要試劑Vc、異Vc鈉、蒸儲水、鄰菲羅咻、硫酸亞鐵、雙氧水、Tris、鄰苯三酚、鹽 酸、鐵氟化鉀、三氯乙酸、三氯化鐵、甲醇等。2方法2.1 黑米花青素對OH 消除率的測定利用H2O2/Fe

5、2+通過Fentong應口 °產(chǎn)生OH ，鄰二氮菲一 Fe2+溶液被OH 氧 化成鄰二氮菲一 Fe3+0鄰二氮菲一 Fe2+（橙紅色）的褪色程度可用來衡量OH 的 消除量U1 o取2.0 ml磷酸緩沖液、1.5 ml濃度為5.0 mmol/L鄰二氮菲、1.0 ml濃 度為7.5 mmol/L的FeSO4和5.5 ml蒸儲水放入試管中，加上述各組樣品搖勻后置于 恒溫水槽中，37c保溫60min,置于波長510nm處測吸光值為A未損。按上述方法， 以1ml體積分數(shù)為0.001的H2O2代替1ml蒸儲水，測出的吸光值為 A損傷；以1ml 樣品液和1mlH2O2代替2ml蒸儲水，測出的吸光值

6、為As 口 。按下式計算羥自由 基消除率：OH 消除率（尸（As A損傷）/（ A未損A損傷）X 100口”為表示幾種抗氧化劑消除OH 能力，采用IC50值表示。將黑米花青素、異 Vc鈉和Vc配制成系列溶液，測定提取液濃度與 OH 消除率，并繪制OH 清除 率對提取液濃度曲線，用方程式計算出 OH 消除率為50%時所需提取液濃度 （IC50）。IC50值越低，抗氧化劑的OH 消除能力越強，抗氧化性越好。2.2 黑米花青素對O2 清除率的測定鄰苯三酚在堿性條件下自動氧化，不斷釋放出O2一 , O2 又可進一步促進自氧化。中間產(chǎn)物的積累在滯后3045s與時間呈良好的線性關系，一般維持4min 左右

7、，隨后減慢。有色產(chǎn)物在320nm有強烈的光吸收。由于自氧化速率依賴于 O2的濃度，清除O2一 則抑制自氧化反應，阻止中間產(chǎn)物的積累，從而評價受試 物清除O2一 的能力口”。取25c預熱pH為8.2、濃度為50mmol/L的Tris-HCl緩沖 液2.25ml,置于10ml試管中，依次加入不同濃度樣品溶液各 2ml,接著加入25c 預熱過的45mmol/L的鄰苯三酚75晨 迅速混勻，反應 4min后加入20仙濃度為 10mol/L的HCl終止反應，在320nm波長處檢測吸光度As。按上述方法，以2ml蒸 儲水代替樣品，測得的鄰苯三酚體系吸光度為A,以pH值為8.2的Tris-HCl緩沖液 2.2

8、5ml,力口2ml樣品測得的吸光度作為空白吸光度 Ao12 0按下式計算超氧陰離 子清除率：O2 消除率(尸A-(As-Ao)/ A X 100口£為表示幾種抗氧化劑消除O2一 能力，采用IC5Ca表示。將黑米花青素、異 Vc鈉和Vc配制成系列溶液，測定提取液濃度與 O2一 清除率，并繪制O2一 清除 率對提取液濃度曲線，用方程式計算出 O2一 消除率為50%時所需提取液濃度 (IC50)。IC50值越低，抗氧化劑的O2一 消除能力越強，抗氧化性越好。2.3 黑米花青素還原能力的測定以普魯士藍Fe(Fe(CN)s)生成量作為指標，將赤血鹽K3Fe(CN)6還原成黃血鹽， 再利用Fe2

9、+形成普魯士藍。700nm吸光值反映普魯士藍的生成量，吸光值越大， 樣品還原力值愈強，表示抗氧化效果愈佳口”。取樣品液各1ml,分別加2.5ml磷酸鹽緩沖液(0.2 M, pH6.6)和2.5 ml質(zhì)量分數(shù)為0.010的鐵氟化鉀，混勻，在 50c水浴鍋中保溫20min。然后，加入體積分數(shù)為0.100的三氯乙酸2.5 ml,將溶 液在3000r/min條件下離心15min。取2.5 ml上清液，加入2.5 ml蒸儲水和0.5 ml質(zhì) 量分數(shù)為0.001三氯化鐵，混勻?？瞻讓φ找约状继娲寡趸瘎?，在700nm波長下測定混合液的吸光度口3 結果與分析本實驗研究黑米花青素的抗氧化性，為了更好的體現(xiàn)黑米

10、花青素良好的抗氧 化性，以及從節(jié)省經(jīng)費方面考慮，故選取食品加工過程中常用的兩種抗氧化劑異 Vc鈉、Vc進行對照實驗，由于三種抗氧化劑抗氧化作用的機理有所不同，因此 三種抗氧化劑的抗氧化性也存在差異。3.1 黑米花青素、異Vc鈉、Vc抗氧化作用（即清除自由基）的機理花色甘類化合物的酚羥基結構，特別是鄰苯二酚或鄰苯三酚的鄰位酚羥基很 容易被氧化成酶類結構，在有酶、充足的水分以及較高 pH值時，氧化反應進行 得更快，從而消耗環(huán)境中的氧。其酚類結構使其對活性氧等自由基具有很強的捕 捉能力，如能與氧化反應產(chǎn)生的脂質(zhì)自由基等結合， 將減少或阻止組織中氧化反 應過程的進行，這使得它具有較強的抗氧化性以及消除

11、自由基的能力口 6、黑米花色甘類化合物清除自由基和抗氧化的作用機理在于它阻止了自由基 在體內(nèi)產(chǎn)生的3個階段：即與O= 反應阻止自由基引發(fā)；與金屬離子鰲合阻止 OH 生成；與脂質(zhì)過氧基（ROO ）反應阻止脂質(zhì)過氧化過程口 61。還原型Vc是氫原子供體，給出一個氫原子，它可成為半脫氫Vc,如再給出 一個氫原子，則成為雙脫氫 Vc（即氧化型Vc）。一般認為，當Vc濃度較低時， Vc給出一個電子，形成Vc自由基，可增加機體自由基的生成量；當 Vc濃度較 高時，則可作為自由基消除劑發(fā)揮作用。 Vc可直接消除O2一 ,R 和OH 等自 由基口 7。而異Vc鈉是Vc的旋光異構體，同樣是氫原子供體，還原能力相

12、較于 Vc要強一些口 ：3.2 對羥自由基（OH ）的清除作用濃度（mg/ml）黑米花青素異Vd內(nèi)V VC線性（黑 米花青素）線性（異V刪）線性（VC）圖1黑米花青素、異 Vc鈉、Vc對羥自由基（OH ）的清除作用比較OH 是人體在新陳代謝過程中產(chǎn)生對生物體毒性最大的一種自由基，它可 以使機體組織中的糖類、氨基酸、核酸等物質(zhì)發(fā)生氧化，從而導致各種疾病的發(fā) 生和加速機體的衰老。由圖1可知黑米花青素對Fenton反應產(chǎn)生的OH 具有較好的消除作用，而且隨著濃度的增加其清除作用越明顯，并呈較好的線性關系。 在低濃度范圍內(nèi)，3種樣品的消除能力比較接近。隨著濃度的增加，清除能力的 差異也越明顯。在相同濃

13、度下，對 OH 清除效果依次為黑米花青素>異Vc鈉>Vc。黑米花青素對OH 消除能力的IC50為0.335mg/ml,異Vc鈉和Vc的IC50 分別為0.3915mg/ml和0.4604mg/ml,表明黑米花青素具有比異 Vc鈉和Vc更 高的清除OH 的能力。3.3 對超氧陰離子（O2一 ）的清除作用O2一 是所有氧自由基中最早產(chǎn)生的自由基，可以經(jīng)過一系列反應生成其他 氧自由基，對機體組織造成氧化損傷，因此清除O2一 具有特別重要的意義。由圖2可知，黑米花青素、異Vc鈉和Vc對鄰苯三酚自氧化體系產(chǎn)生的 02一 都有 一定的消除作用。在1050仙g/m）隨著3種樣品濃度的升高，其清除

14、作用越明 顯，并具有較好的線性關系，其濃度（x）-消除率（y）曲線見圖2。黑米花青素對 O2一 消除能力的IC50為34.15 pg/m|異Vc鈉和Vc的IC50分別為39.76仙g/ml 和47.54 pg/ml表明黑米花青素具有比異 Vc鈉和Vc更高的消除。2一 的能力。濃度(ug/ml)黑米花青素異VG內(nèi)VC一線性（黑米花青素）-線性（異V刪）-一線性（VC）圖2黑米花青素、異 Vc鈉、Vc對超氧陰離子（。2一 ）的清除作用比較3.4還原能力混合溶液吸光度的大小反映樣品還原能力的強弱，吸光度越大表明還原能力越強，而且還原能力與抗氧化性呈明顯的相關性。由圖 4可知，黑米花青素具有 較強的還

15、原能力，隨著濃度的升高其還原能力也相應的提高，呈現(xiàn)劑量效應關系。在低濃度范圍，黑米花青素、異 Vc鈉和Vc的還原能力比較接近，且都維持在較低水平。隨著濃度的升高，黑米花青素的還原能力逐漸高于 Vc和異Vc鈉的還原能力T-黑米花青素-異VG內(nèi)VC10.8值0.6光吸0.40.2020406080100120濃度(ug/ml)圖4黑米花青素、異Vc鈉、Vc還原能力大小比較4結論與討論本研究采用三種方法，分別測定黑米花青素對OH 消除能力、O' 消除能力及還原能力評價。試驗結果表明，黑米花青素具有比異Vc鈉和Vc更強的OH 消除能力、O= 消除能力及還原能力，表明黑米花青素是一種較強的的大

16、然抗氧化劑，具有潛在的保健及藥用價值。5主要參考文獻1張文佳，張昊琛，鮑康勝，范廣偉.黑米花青素提取與純化工藝研究J.安徽農(nóng)業(yè)科學,2011.2徐飛.紫黑米提高提高貧血大鼠血紅蛋白作用的研究.營養(yǎng)學報，1989,11 (2):120125.3黃玉.黑米的藥理作用.西醫(yī)學院學報，1986,8(13) : 3739.4顧德法.紫黑糯米皮層對促進小鼠骨髓祖細胞分化和脾淋巴細胞胞增殖的影響.中國水稻科學,1996,10(4) : 250 252.5魏蕾，呂佳飛，李志洲.花青素的提取純化、抗氧化能力及功用方面的研究進展J.氨基酸和生物資源，2009,(04).6趙宇瑛，張漢鋒.花青素的研究現(xiàn)狀及發(fā)展趨勢

17、J.安徽農(nóng)業(yè)科學，2005,(05).7孫玲,張名位，池建偉等.黑米的抗氧化性及其與黃酮和種皮色素的關系.營養(yǎng)學報,2000,22(3) : 246249.8陳文，王磊.黑優(yōu)粘米酶解水提液延緩衰老作用研究.上海農(nóng)學院學報,1996,14(4):258261.9施鴻飛，王磊，唐粉芳等.黑米對小鼠HyP和GSH-Px的影響.南京中醫(yī)藥人學學報,1997,13(6) : 346347.10 MOURAFC,ARAUJOMH,COSTARC,etal « Efficient use of Femetalas an electron transferagent in a heterogeneo

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