體外哺乳動物細胞程序外DNA合成（UDS)試驗

1、藍色海洋書的海洋體外哺乳動物細胞程序外dna合成（uds)試驗 本實驗是一項致突變性實驗，檢測受試樣品是否會引起哺乳動物細胞的原發(fā)dna損傷，以評價受試樣品的潛在致突變性。 細胞從dna復制起，經(jīng)過分裂直到dna均等地分配到兩個新的子細胞的過程即為細胞周期，包括g1期、s期、g2期和m期。s期的dna合成是按固定程序舉行的，稱為程序性dna合成。dna受損后的修復合成與按細胞周期發(fā)展程序而發(fā)生的s期半保留dna合成不同，稱為程序外dna合成（unscheduled dna synthesis, uds)。dna修復是活細胞在dna受到損傷后的一種生物學反應，也是細胞保持遺傳物質(zhì)穩(wěn)定性的一種措施

2、。因此，可以借dna修復來推斷dna的損傷。在加或不加體外代謝活化酶混合液（s9混合液）的條件下，將經(jīng)歷試樣品作用后的同步培養(yǎng)生長于蓋片上的細胞置于含有羥基脲的，h-tdr中，并舉行發(fā)射自顯影或液體閃耀計數(shù)顯示法處理后，計數(shù)細胞核上乳膠層中的顯影銀粒數(shù)或計算3h/14c的發(fā)射活性比?！静牧稀?恒溫水浴箱、冰箱、生物顯微鏡。2陽性對比物7,12-二甲基苯蒽(7,12-demethylbenzanthracene,7,12-dmba)。或2-乙酞基氨基芴(2-acetylaminofluorene,2-aaf)。或4-n-氧化物（4-nitroquinoline-n-oxide,4-nqo)。3細

3、胞培養(yǎng)液。4細胞株。各種細胞均可作為uds的靶細胞，人類細胞（如外周血淋巴細胞、成纖維細胞、hela細胞、人羊膜fl細胞）的uds反應大于嚙齒類細胞。因為肝臟是化學物作用的初級靶器官，又具有生物轉(zhuǎn)化能力，故推舉用法原代肝細胞為uds實驗的靶細胞。5無鈣鎂磷酸鹽緩沖液（cmf-pbs, ph為7.27.4)。6-edta溶液。7固定液：（3:1,v/v)，臨用現(xiàn)配。8.貯備液250mmo1/l羥基脲（hu)。9. 1溶液。10. 3h-胸腺嘧啶核苷。11核乳膠。12顯影液及定影液。13代謝活化系統(tǒng)。肝混合功能混合液（s9混合液）?！巨k法】1. uds發(fā)射自顯影法(1)將細胞增殖至所需數(shù)量后，制成

4、單細胞懸液，濃度為0.5x1051.0x105/ml。將細胞懸液接種于有小蓋玻片的6孔細胞培養(yǎng)板中，在37 c02培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)13天，至細胞50融合。(2)在舉行發(fā)射自顯影技術前一日下午，加入羥基脲(hu)貯備液，hu的終末濃度為1ommol/l。繼續(xù)在37下培養(yǎng)16小時，然后將長有細胞的蓋片置于含有不同濃度的受試樣品、hu(1ommol/l）及3h-胸腺嘧啶核苷(510 uci/ml,30 uci/ml）培養(yǎng)液中，在37下培養(yǎng)5小時。(3)細胞的固定：孵育結束后，小蓋玻片經(jīng)hanks液充分洗滌后，用1%枸櫞酸鈉處理10分鐘。隨后用-（3:1 v/v新奇配制）固定液在4固定過夜，空氣中干燥后，

5、用小量中性樹膠將小玻片粘于載玻片上，長有細胞面朝上，40烘焙24小時。(4）發(fā)射自顯影處理。發(fā)射自顯影處理的全過程需要在暗室中平安紅燈下或黑暗中舉行。為了獲得很薄的乳膠層，將市售的乳膠在臨用時作1:1稀釋。(5）將乳膠液置于42水浴中。并時常用玻璃棒緩緩攪拌，使乳膠液中的空氣逸出。1020分鐘即可用法。同時將預備做自顯影處理的載玻片，置水浴箱平臺上預熱。而后，將附有樣本的載玻片垂直浸漬于乳膠液中約5秒。緩緩將玻片提出（提出速度愈慢，乳膠層愈?。?，并用紗布或擦鏡紙將玻片背面乳膠拭去。(6)已涂了乳膠的玻片移入溫度為29并保持一定濕度的溫箱中。待乳膠干枯（4小時）后，將玻片放入內(nèi)置一干燥劑（變色硅

6、膠）袋的玻片盒中。玻片盒嚴密地以黑色避光紙小包，使徹低不透光，置于一塑料袋中。然后移入4冰箱中曝光10天左右。1)曝光結束后，將玻片移入有機玻璃制的玻片架上。在液溫為19的顯影液中顯影5分鐘，在停顯液中漂洗30秒，再在f-5定影液中定影610分鐘。用蒸餾水漂洗1030分鐘（換水45次），把水瀝去，在空氣中干燥。2)細胞染色：可在發(fā)射自顯影處理前用地衣紅（orcein) 2溶液，或在顯影后用giemsa染液染色。將玻片用乙醇及二甲苯脫水透亮后，用蓋片封固。3)鏡檢：在油鏡下，計數(shù)各樣本細胞核上乳膠層中的顯影銀粒數(shù)，起碼計數(shù)50個細胞核，同時計數(shù)相當面積的本底銀粒數(shù)，兩者之差為細胞核凈銀粒數(shù)。2.

7、 uds液體閃耀計數(shù)測量法（1)將細胞增殖至所需數(shù)量后，用培養(yǎng)液制成單細胞懸液，濃度為0.5x1051.ox105/ml。加入14 c-tdr (25 mci/mmol)，使其終末濃度為0.0luci/ml。將細胞接種于液體閃耀瓶中，1 ml/瓶。在37中培養(yǎng)4872小時，除去培養(yǎng)基并用hanks液洗滌細胞2次。換以含有14 c-tdr(0.0l uci/ml）培養(yǎng)基，37培養(yǎng)23天。在實驗前一天下午除去含標志物質(zhì)的培養(yǎng)基，用hanks液充分洗滌后，換以含1ommol/l羥基脲的培養(yǎng)基。在37繼續(xù)孵育16小時。(2）細胞與受試樣品接觸和uds的14 c-tdr標志。同發(fā)射自顯影顯示法。(3)液

8、體閃耀計數(shù)樣品的制備。細胞經(jīng)歷試樣品接觸和uds的3h-tdr標志后，快速除去培養(yǎng)基，以冰冷鹽水洗滌2次。隨后用冰冷的0.25n過氯酸溶液處理細胞2次，每次10分鐘，以固定細胞并除去酸不溶性組分。再用75處理10分鐘和無水乙醇洗滌1次以除去脂溶性成分。50充分干燥后加入0.5n過氯酸0.5 ml，于7580恒溫箱中水解40分鐘，使摻入的標志物釋出。冷卻后加入3.5ml及甲苯閃耀液（ppo 0.5%,popop 0.03%) 5 ml。振搖使成均相?；虬聪率鲛k法制成支持物上的測量樣品；細胞與受試樣品接觸和uds3h-tdr標志結束后，快速除去培養(yǎng)基，以冰冷鹽水洗滌2次。加入0.02%edta之無

9、鈣鎂磷酸緩沖液在37中孵育15分鐘。用滴管反復吹吸使細胞自瓶底脫下，并抽吸至直徑為2cm的玻璃纖維紙盤上。依次用0.25n過氯酸5ml,752ml、2ml抽吸洗滌后，在50恒溫箱中將紙盤烘干。置于含3 ml甲苯閃耀液的液體閃耀瓶中。(4）液體閃耀液計數(shù)。在舉行樣本中3h及14 c發(fā)射活性檢測前，先挑選好兩個窗寬延續(xù)的測量道的窗寬。使較高能道（道1)只對14 c的高能量衰變脈沖計數(shù)，而在較低能道（道2）計數(shù)所有3h衰變脈沖及14c的較低能量衰變脈沖。在均相測量時，各道的計數(shù)效率可利用自動外標準源及預先繪制好的淬滅校正曲線推算而得。設道i中14c的計數(shù)效率為c1（按照窗寬挑選標準，3h在該道的計數(shù)

10、效率h1=0)、道2中3h和14c的計數(shù)效率分離為h2及c2。則14c及3h的發(fā)射活性（dpm）可自道1和道2的凈計數(shù)值n1及n2（凈計數(shù)值二實際計數(shù)值-本底計數(shù)值）求得。即14c (dpm)=n1/c1;3h(dpm)= (n2-14c×c2)/h2。若所用液體閃耀計數(shù)器有在線微處理機，這些計算過程可自動完成。利用無外標準源的雙道液體閃耀計數(shù)器或測量支持物上的樣品時，先按照上述要求挑選好窗寬，并測量出兩道中14h計數(shù)效率比k(k=c2/c1)、14c的總計數(shù)效率c及3h在道2中的計數(shù)效率h2。則14c(dpm)=n1(1+k)/c,3h (dpm)（n2-n1×k)/h2

11、。(5) dna含量測定。【結果與分析】1. uds發(fā)射自顯影法uds反應的是細胞核dna的修復合成，因此細胞核上銀粒數(shù)(ngs）和細胞質(zhì)中銀粒數(shù)（cgs）所代表的生物學意義不同。ngs可以反映uds的程度，而cgs則為普通的細胞毒性線粒體dna合成的挑選性顯示。所以，目前多用凈核銀粒數(shù)（nngs）作為評價uds的指標。其計算辦法為：nngs=ngs-cgs因為ngs和cgs受許多辦法學因素影響，所以很難給出一個共同的結果判定閾值。建議以下兩種辦法任選一種舉行實驗結果陽性與否的評價。(1)兩個以上相鄰受試組中浮現(xiàn)nngs的劑量依靠性增高。而受試組nngs的增高與對比組相比差異有顯著性。(2）按

12、照實驗的可重復性、濃度一效應關系和細胞毒性（尤其是cgs的削減）等指標做出綜合評價。2液體閃耀計數(shù)法按照液體閃耀計數(shù)測量數(shù)據(jù)，計算出各樣本中3h/14 c的發(fā)射活性比，后者為單位分量dna中3h-tdr摻入水平的反映值。令溶劑對比的3h/14 c比的均值為1.00(100%)，計算出各樣本對比的變幻量，并由此計算出各實驗點的有關統(tǒng)計量。以受試樣品劑量為橫坐標，相對3h/14 c發(fā)射活性比為縱坐標，繪制劑量一反應（效應）關系圖。并按t檢驗統(tǒng)計分析受試樣品組與溶劑對比組均值間的差異程度。uds實驗作為致癌性化合物的迅速預實驗，從一個以評價各短期實驗價值的國際配合程序的報告中可以看出是一個較好的測試系統(tǒng)。如以液體閃耀計數(shù)技術和以hela細胞為靶細胞的實驗系統(tǒng)對42種編碼化合物的測試結果，致癌性化合物檢出的敏捷度為0.68、特異性為0.706、正確性為0.691( martin 1981)。而不同試驗室用鼠傷寒沙門菌微粒體酶系對這些編碼化合物