最詳細的Western_Blot過程步驟詳解

1、Western Blot詳解(原理、分類、試劑、步驟及問題解答)Western免疫印跡(Western Blot )是將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到膜上，然 后利用抗體進行檢測。對已知表達蛋白，可用相應抗體作為一抗進行 檢測，對新基因的表達產(chǎn)物，可通過融合部分的抗體檢測。本文主要通過以下幾個方面來詳細地介紹一下Western Blot技術：一、 原理二、 分類i.放射白顯影ii.底物化學發(fā)光ECLECFiv.底物DAB呈色三、 主要試劑四、 主要步驟五、 實驗常見的問題指南1.參考書推薦2.針對樣品的常見問題3.抗體4.濾紙、膠和膜的問題5. Marker的相關疑問6.染色的選擇7.參照的疑問8.緩沖液配方的

2、常見問題9.條件的摸索10.方法的介紹11.結果分析一、 原理與Southern或Northern雜交方法類似，但Western Blot采用 的是聚丙烯酰胺凝膠電泳，被檢測物是蛋白質(zhì)，“探針”是抗體，“顯色” 用標記的二抗。經(jīng)過PAGE分離的蛋白質(zhì)樣品，轉(zhuǎn)移到固相載體（例 如硝酸纖維素薄膜）上，固相載體以非共價鍵形式吸附蛋白質(zhì)，且能 保持電泳分離的多肽類型及其生物學活性不變。 以固相載體上的蛋白 質(zhì)或多肽作為抗原，與對應的抗體起免疫反應，再與酶或同位素標記 的第二抗體起反應，經(jīng)過底物顯色或放射白顯影以檢測電泳分離的特 異性目的基因表達的蛋白成分。該技術也廣泛應用于檢測蛋白水平的 表達。二、

3、分類現(xiàn)常用的有底物化學發(fā)光ECL和底物DAB呈色，體同水平和實驗條 件的是用第一種方法，目前發(fā)表文章通常是用底物化學發(fā)光ECL。只要買現(xiàn)成的試劑盒就行，操作也比較簡單，原理如下（二抗用HRP標記）：反應底物為過氧化物+魯米諾，如遇到HRP，即發(fā)光，可使 膠片曝光，就可洗出條帶。三、主要試劑1、 丙烯酰胺和N, N-亞甲雙丙烯酰胺，應以溫熱(以利于溶解雙丙 稀酰胺)的去離子水配制含有29%(w/v)丙稀酰胺和1%(w/v)N , N-亞 甲雙丙烯酰胺儲存液丙稀酰胺29g , N , N-亞甲叉雙丙稀酰胺1g ,加H2O至100ml。)儲于棕色瓶，4 C避光保存。嚴格核實PH不得超過7.0,因可以

4、發(fā)生脫氨基反應是光催化或堿催化的。使用期不得超過兩個月，隔幾個月須重新配制。如有沉淀，可以過濾。2、 十二烷基硫酸鈉SDS溶液:10%(w/v)0.1gSDS , 1mlH2O去離子 水配制，室溫保存。3、 分離膠緩沖液：1.5mmol/LTris-HCL(pH8.8):18.15gTris和48ml1mol/LHCL混合，加水稀釋到100ml終體積。過濾后40C保存。4、 濃縮膠緩沖液：0.5mmol/LTris-HCL(pH6.8):6.05gTris溶于40mlH2O中，用約48ml 1mol/L HCL調(diào)至pH6.8加水稀釋到100ml終體積。過濾后40C保存。這兩種緩沖液必須使用Tr

5、is堿制備，再 用HCL調(diào)節(jié)PH值，而不用Tris.CL。5、TEMED原溶液N, N , NN四甲基乙二胺催化過硫酸鉉形成白 由基而加速兩種丙稀酰胺的聚合。PH太低時，聚合反應受到抑制。10%(w/v)過硫酸胺溶液。提供兩種丙稀酰胺聚合所必須的白由基。去離子水配制數(shù)ml，臨用前配制.6、SDS-PAGE加樣緩沖液：pH6.8 0.5mol/L Tris緩沖液8ml,甘油6.4ml,10%SDS 12.8ml,筑基乙醇3.2ml, 0.05%漠酚藍1.6ml, H2O 32ml混勻備用。按1:1或1:2比例與蛋白質(zhì)樣品混合，在沸水終煮 3min 混勻后再上樣，一般為 20-25ul，總蛋白量

6、100四。7、Tris-甘氨酸電泳緩沖液：30.3gTris , 188g甘氨酸，10gSDS，用 蒸館水溶解至1000ml,得0.25mol/LTris-1.92mol/L甘氨酸電極緩沖 液。臨用前稀釋10倍。8、 轉(zhuǎn)移緩沖液：配制1L轉(zhuǎn)移緩沖液，需稱取2.9g甘氨酸、5.8gTris堿、0.37gSDS，并加入200ml甲醇，加水至總量1L。9、麗春紅染液儲存液： 麗春紅S2g三氯乙酸30g磺基水楊酸30g加水至100ml用時上述儲存液稀釋10倍即成麗春紅S使用液。使 用后應予以廢棄。10、 脫脂奶粉5%(w/v)。11、NaN3 0.02%疊氮鈉(有毒，戴手套操作)，溶于磷酸緩沖鹽溶 液

7、(PBS)。12、Tris緩沖鹽溶液(TBS):20mmol/LTris/HCL(pH7.5), 500mmol/LnaCl。13、Tween20(15)鼠抗人-MMP-9(16)鼠抗人-TIMP-1。14、 過氧化物酶標記的第二抗體。15、NBT(溶于70%二甲基甲酰胺，75mg/ml)。16、BCIP(溶于100%二甲基甲酰胺，50mg/ml)。17、100mmol/LTris-HCL(pH9.5)。18、100mmol/L NaCl。19、50mmol/LTris-HCL(pH7.5) , 5mmol/L EDTA。(可以參看分子克隆)四、主要步驟 主要包括以下4個基本步驟1.樣品制備原

8、始樣品可為細胞、組織、培養(yǎng)上清、免疫沉淀或親和純化的蛋白，以下為定性檢測目的蛋白時細胞樣品的處理方法，其余的樣品制備方 法參閱相關文獻。1.培養(yǎng)細胞或藥物處理。2.棄培養(yǎng)基，用1X PBS漂洗細胞2次，去盡殘留培養(yǎng)基。3.加入1X SDS樣品緩沖液(6-well plate, 100 /w或75 cm2plate,500-1000 W瓶)，舌【J落細胞，轉(zhuǎn)移到Ep管。注意：冰上操作。4.超聲1015秒剪切DNA以減低樣品粘性。5.煮沸樣品5 minutes。6.離心12000g, 5 min ,取上清。乙 電泳分離：上樣15 M20 M至SDS-PAGE膠(10 cm x 10 cm)電泳。如

9、要定量檢測某蛋白的表達水平，應用RIPA裂解液(1 ml per 107cells/ 100 mm dish/ 150 cm2flask)裂解細胞，收集裂解液至離心管中，在振蕩器上混勻415min , 14000g離心15min ( 4C),棄沉淀，用 Bradford法或其它蛋白質(zhì)測定方法測定上清中蛋白濃度以 調(diào)整上樣體積和上樣量，進行 Western雜交時還需設置內(nèi)或外參照,通常用beta-actin。注意：一般上樣2030昭已足夠，如待檢蛋白為低豐度蛋白，可加 大上樣量至100四，但電泳條帶易拖尾，可制備亞細胞組份或采用更 敏感的檢測方法。2.電泳分離（參照SDS-PAGE電泳方法）3.

10、轉(zhuǎn)膜雜交膜的選擇是決定Western blot成敗的重要環(huán)節(jié)。應根據(jù)雜交方 案、被轉(zhuǎn)移蛋白的特性以及分子大小等因素，選擇合適材質(zhì)、孔徑和 規(guī)格的雜交膜。用于Western blot的膜主要有兩種：硝酸纖維素膜（NC）和PVDF膜。NC膜是蛋白印跡實驗的標準固相支持物，在低離子轉(zhuǎn) 移緩沖液的環(huán)境下，大多數(shù)帶負電荷的蛋白質(zhì)會與膜發(fā)生疏水作用而 高親和力的結合在一起，但在非離子型的去污劑作用下，結合的蛋白 還可以被洗脫下來。根據(jù)被轉(zhuǎn)移的蛋白分子量大小，選擇不同孔徑的NC膜。因為隨著膜孔徑的不斷減小，膜對低分子量蛋白的結合就越 牢固。通常用0.45叩和0.2叩兩種規(guī)格的NC膜。大于20kD的蛋 白可用

11、0.45 gm的膜，小于20kD的蛋白就要用0.2叩的膜了，如用0.45 的膜就會發(fā)生flowthrough”的現(xiàn)象。PVDF膜靈敏度、分辨率和蛋白親和力比常規(guī)的膜要高，非常適合于低分子量蛋白的檢測。但PVDF膜在使用之前必需用純甲醇浸泡飽和1-5秒鐘。蛋白質(zhì)常用的轉(zhuǎn)移方法主要有兩種： 槽式濕轉(zhuǎn)和半干轉(zhuǎn)移。前者操作 容易，轉(zhuǎn)移效率高；而后者適用于大膠的蛋白轉(zhuǎn)移，所用緩沖液少。以下為槽式濕轉(zhuǎn)的操作步驟。1.將膠浸于轉(zhuǎn)移緩沖液中平衡10min。注意：如檢測小分子蛋白，可省略此步，因小分子蛋白容易擴散出膠。2.依據(jù)膠的大小剪取膜和濾紙6片，放入轉(zhuǎn)移緩沖液中平衡10min。如用PVDF膜需用純甲醇浸泡

12、飽和3-5秒鐘。3.裝配轉(zhuǎn)移三明治：海綿？3層濾紙？膠？膜？3層濾紙？海綿，每層 放好后，用試管趕去氣泡。切記：膠放于負極面（黑色面）。4.將轉(zhuǎn)移槽置于冰浴中，放入三明治（黑色面對黑色面），加轉(zhuǎn)移緩沖液，插上電極，100V , 1h（電流約為0.3A）。注意：應再次 檢查三明治和電極是否裝配正確，電源是否接通。5.轉(zhuǎn)膜結束后，切斷電源，取出雜交膜4.免疫雜交與顯色1.用25 ml TBS洗膜5min ,室溫，搖動。2.置膜于25 ml封閉緩沖液中1h,室溫，搖動3.15ml TBS/T洗3次（5 min/T）4.加入合適稀釋度的一抗，室溫孵育1-2h或4C過夜，緩慢搖動。5.15 ml TBS

13、/T洗3次（5 min/T）。6.加入合適稀釋度的堿性磷酸酶（AP）或辣根過氧化酶（HRP）標 記的二抗，室溫孵育1h,緩慢搖動。乙15 ml TBS/T洗3次（5 min/T）。8.15 ml TBS洗1次。9.蛋白檢測（顯色法或發(fā)光法，按相應試劑說明操作）。注意事項：1.操作中戴手套，不要用手觸膜。2.PVDF膜在甲醇中浸泡時間不要超過5秒。3.如檢測小于20kD的蛋白應用0.2叩的膜，并可省略轉(zhuǎn)移時的平 衡步驟。4.某些抗原和抗體可被Tween-20洗脫，此時可用1.0% BSA代替Tween-20。5.關于封閉劑的選擇：5%脫脂奶/TBS or PBS:能和某些抗原相互 作用，掩蓋抗體

14、結合能力；0.33% BSA in PBS:低的內(nèi)源性交叉反 應性。6.如用0.1% Tween 20、0.02% NaN3in PBS or TBS作封閉劑和 抗體稀釋液，抗體檢測后可進行蛋白染色。如要同時檢測大分子量和小分子蛋白，最好用梯度膠分離蛋白。五、實驗常見的問題指南根據(jù)問題的類型主要分成以下幾類（以下資料權作參考，請勿盲目模仿?。?1.參考書推薦A.對初學者看什么資料比較好？解答：抗體技術實驗指南和Antibodies （a laboratory manual , wrote by EdHarlow , david lane ）兩本書不錯。2.針對樣品的常見問題B.做線粒體膜UCP

15、2蛋白的Western Blot（以下簡寫成WesternBlot）,提取線粒體后凍存（未加蛋白酶抑制劑），用的博士德的一 抗，開始還有點痕跡，現(xiàn)在越來越差，上樣量已加到120四，換了個santa cloz的一抗仍不行。是什么原因？蛋白酶抑制劑單加PMSF行嗎？ 解答：懷疑是樣品問題，可能是：1,樣品不能反復凍融；2,樣品未 加蛋白酶抑制劑。同時，建議檢查Western Blot過程，提高一抗?jié)?度。對于加蛋白酶抑制劑來說，一般加PMSF就可以了，最好能多 加幾中種蛋白酶抑制劑。E.同一蛋白樣品能同時進行兩種因子的Western Blot檢測嗎？ 解答：當然可以，有的甚至可以同時測幾十種樣品。

16、F.如果目標蛋白是膜蛋白或是胞漿蛋白，操作需要注意什么？ 解答：如果是膜蛋白和胞漿蛋白，所用的去垢劑就要溫和得多，這時 最好加上NaF去抑制磷酸化酶的活性。G.我的樣品的蛋白含量很低，每微升不到1微克，但是在轉(zhuǎn)膜時經(jīng) 常會發(fā)現(xiàn)只有一部分蛋白轉(zhuǎn)到了膜上，就是在轉(zhuǎn)膜后染膠發(fā)現(xiàn)有的孔 所有的蛋白條帶都在，只是顏色變淡了，有什么辦法可以解決？解答：你可以加大上樣量，沒有問題，還有轉(zhuǎn)移時你可以用減少電流 延長時間，多加5 10%甲醇。H.想分離的蛋白是分子量260kd的，SDS-PAGE電泳的分離膠濃度 多大合適？積層膠的濃度又該用多少？這么大分子量的蛋白容易作Western Blot嗎？解答：260k

17、d的蛋白不好做，分離膠用6%, Stacking Gel 3.5 %I.如果上樣量超載，要用什么方法來增加上樣量？如果需要加大上樣量使原來弱的條帶能看清楚。解答：可以濃縮樣品，也可以根據(jù)你的目標分子量透析掉一部分小分 子蛋白。一般地，超載30%是不會有問題的。如果已經(jīng)超了不少了，而且小分子量的也要，可以考慮加大膠的厚度，可以試試1.5mm的comb。J.蛋白變性后可以存放多久？解答：80 C,一兩年沒有問題。最關鍵兩條：不要被蛋白酶水解 掉；不要被細菌消化掉（也是被酶水解了）。K.我所測定的蛋白分子量是105KD， 按理說分離膠應當采用7.5%,但我所查資料卻要求分離膠和濃縮膠均采用11 %的

18、配方，不知為 何？解答：上述您提到的兩種凝膠均可以使用， 因為105 KD的蛋白在上 述兩種膠的線性分辨范圍內(nèi)，但需注意條帶位置。L.接下來我準備采用DAB顯色技術，二抗是生物素化的多克隆抗體， 三抗是親和素生物素體系，不知采用這樣的方案后，封閉液是否要作 調(diào)整，能否再用5%的脫脂奶粉呢？好像有資料說脫脂奶粉會影響親 和素生物素的生成， 是嗎？解答：不能使用脫脂奶粉，因為脫脂奶粉中含生物素，用B S A代替 應該好一點.M.還有一問題，一般一次上樣的蛋白總量是多少，跟目的蛋白的表達量有關系嗎？解答：Western Blot一般上樣30 100微克不等，結果跟目的蛋白 的豐度、上樣量、一二抗的量

19、和撫育時間都有關系，也與顯色時間長 短有關。開始摸條件時，為了拿到陽性結果，各個步驟都可以量多一 點時間長一點，當然背景也就出來了。要拿到好的結果，如果抗體好 的話比較容易，抗體不好的話就需要反復地試了，當然有的不適合Western Blot的怎樣做也不行。所以拿到好的結果不容易。N.做組織樣品的western的時候，處理樣品有什么訣竅嗎？還有，您用過大牛血清做封閉劑嗎？濃度如何？效果是不是比BSA好一點？解答：必須進行研磨、勻漿、超聲處理，蛋白質(zhì)溶解度會更好，離心 要充分，膜蛋白需用更劇 烈的方法抽提，低豐度膜蛋白可能還要分 步抽提（超速離心） 。還有一點就是組織中的蛋白酶活性更強，需要注

20、意抑制蛋白酶的活性（加入PMS F和蛋白酶抑制劑cocktail）,封閉劑一般5%脫脂奶粉較常用。如果一抗為多克隆抗體，使用BSA也是不錯的選擇。O.您是否可以介紹一下大分子量蛋白200KD，在做western要注意什么呢？解答：做200kd蛋白的Western Blot時要注意，分離膠最好選擇7% 的；剝膠時要小心；轉(zhuǎn)移時間需要相應延長；要做分子量參照（否則 出現(xiàn)雜帶不知道如何分析）。P.有什么方法可以提高上樣量？解答：可以濃縮樣品；增大上樣體積來增大上樣量。Q.我要檢測的目的蛋白是分子量大概為42kd的膜蛋白，膜蛋白提取 可不可以不用到超速離心機，有沒有直接用低溫高速離心機就可以的 提到膜

21、蛋白的方法，42kd的蛋白分子量算不算大？解答：如是需要提取膜蛋白，（而不是只需要提取膜蛋白），可以用Ripa buffer提取膜蛋白和胞漿蛋白，用這個做Western Blot就可以 了。如果是非要只提取膜蛋白就要用到超速離心機。42kd不算大， 也不算小，所以，可以按照一般的轉(zhuǎn)移方法實施。R.蛋白的上樣量有沒有什么具體的要求？解答： 上樣量要根據(jù)實驗的要求來定，如果要求是定量和半定量的WesternBlot則上樣量要均等，如果只是要定性，則沒有太大的關 系，盡量多上就行了，但是不要超過0.3四/mm2。S.一抗，二抗的比例是否重要？解答：比較重要，調(diào)整好一抗，二抗的比例，可以去掉部分非特異

22、的 本底。3.抗體 做細胞信號傳導， 要做磷酸化某因子WesternBlot ,其二抗有何要 求？解答：對二抗無要求，要看你實驗條件來選擇，一般推薦用HRP標 記的二抗。U.同一公司的另外抗體用這個稀釋度做出來效果很好，所以沒做預試，怕費時間，用什么樣的稀釋度比較好呢？我用的ELL+plus試劑 盒顯色。轉(zhuǎn)膜過夜， 一抗孵育也是過夜的， 若封閉也過夜的話就要四 天才看的到結果了。解答：不同抗體，即使是同一公司的抗體，其最佳的抗體稀釋度也是 不一樣的，需要你實驗摸索。我覺得轉(zhuǎn)膜過夜好像沒有必要吧，轉(zhuǎn)膜 的目的也就是將蛋白轉(zhuǎn)到膜上就行啦， 何必浪費時間呢。至于具體的 轉(zhuǎn)膜時間，還要看你的目的蛋白分

23、子量的大小；轉(zhuǎn)膜的設備，是半干 式，還是濕式。一抗當然可以過夜，如果你想所短Western Blot時間的話，可以增高一抗的孵育溫度，我們實驗室一般37度，兩小時就足夠了；你可以參照抗體說明書。至于一抗和二抗得稀釋度，你可 以一抗1:1500 ;二抗1: 20000試試。另外建議你洗膜時，多洗幾 次，最好是在封閉；一抗和二抗后至少是5x5min ,跑一張好膜不容 易，多盡點心吧，這樣不會浪費你的時間，只會節(jié)省你的時間！V.免疫組化和Western Blot可以用同一種抗體嗎？解答：免疫組化時抗體識別的是未經(jīng)變性處理的抗原決定簇（又稱表位），有些表位是線性的，而有的屬于構象型；線性表位不受蛋白變

24、 性的影響，天然蛋白和煮后的蛋白都含有；構象型表位由于受蛋白空 間結構限制，煮后變性會消失。如果你所用的抗體識別的是蛋白上連 續(xù)的幾個氨基酸，也就是線性表位，那么這種抗體可同時用于免疫組 化和Western ,而如果抗體識別構象形表位，則只能用于免疫組化。一般抗體說明書上都有注明此種抗體識別的氨基酸區(qū)間。（限于單抗）W. Western Blot中抗體的重復應用問題解答:抗體工作溶液一般不主張儲存反復使用，但是如抗體比較珍貴， 可反復使用2 3次。稀釋后應在2 3天內(nèi)使用，4度保存，避免反 復凍融。4.濾紙、膠和膜的問題X. NC膜 PVDF膜尼龍膜怎樣鑒別？解答：尼龍膜是較理想的核酸固相支持

25、物，有多種類型；硝酸纖維素膜是目前應用最廣的一種固相支持物，價格最便宜；PVDF膜介于二者之間。就結合能力而言：尼龍膜結合DNA和RNA能力可達480 - 600g/cm2，可結合短至10bp的核酸片段；硝酸纖維素膜結合DNA和RNA能力可達80 100四/cm2,對于200bp的核酸片段結合能力不 強；PVDF膜結合DNA和RNA能力可達125 300四/cm2。就溫度適應性而言：尼龍膜經(jīng)烘烤或紫外線照射后，核酸中的部分密 嚏堿基可與膜上的正電荷結合；硝酸纖維素膜依靠疏水性相互作用結 合DNA，結合不牢固；PVDF膜結合牢固，耐高溫，特別適合于蛋白印跡。就韌性而言：尼龍膜較強；硝酸纖維素膜較

26、脆，易破碎；PVDF膜較 強。就重復性而言：尼龍膜可反復用于分子雜交，雜交后，探針分子可經(jīng) 堿變性被洗脫下來；硝酸纖維素膜不能重復使用；PVDF膜可以重復 使用。Y.在做Western Blot時，PBDF膜用甲醇浸泡的目的？解答：PVDF膜用甲醇泡的目的是為了活化PVDF膜上面的正電基 團，使它更容易跟帶負電的蛋白質(zhì)結合， 做小分子的蛋白轉(zhuǎn)移時多加 甲醇也是這個目的。乙檢測磷酸化的JNK和非磷酸化的JNK可以在同一張膜上嗎？ 解答：可以。AA.轉(zhuǎn)膜后經(jīng)麗春紅染色的條帶，為什么大蛋白分子的一端（即點樣 空的一側）的轉(zhuǎn)膜好象不是很好，為什么？解答：這是正常的，大分子的蛋白轉(zhuǎn)移的慢，你延長轉(zhuǎn)移時間

27、和電流，大分子一端就會好的多，但是小分子的就有可能會變淡。BB.我想問您裂解細胞用三去污裂解法，還是用上樣緩沖液？解答：用上樣緩沖液，這樣有幾個好處，可以提取總蛋白，同時又可 以讓磷酸化酶失活。CC.采用tank system有什么講究?解答：建議低電壓，長時間，（一般tank System用衡壓好點），如28V 14 16hrs。DD.做HSP WESTEN定量，同樣的抗體免疫組化能做出，而WESTEN卻不能？解答：這多半是抗體的問題，要看抗體的說明，是否能做WesternBlot和IHC。EE.膜一般要如何處理？解答：一般用甲醇泡泡就可以了。FF.如果是6 X8轉(zhuǎn)印膜，要加多少一抗？解答：

28、一抗的稀釋度是有說明的，根據(jù)你的一抗看看就知道了，但是 那么大的膜孵育體積一般最少為3 5ml。GG.上下槽緩沖液有何要求，怎樣才能達到最佳效果。解答：無要求。HH.跑電泳的時候配的膠總是“縮”是什么原因呢？是有的成分不對 嗎？解答：沒什么問題，就是你膠里的水分被蒸發(fā)了。過夜時拿保鮮膜包 起來，在里面加點水保持濕度就可以了。如果過夜，膠里的水分被蒸 發(fā)，采用保鮮膜包上也可以；也可能母液（30%聚丙酰胺）有問題， 你可以重新配制一份觀察；能夠替換的試劑，盡量換一下，選用好的試劑，避免找問題麻煩。脫色液中甲醇的含量太高也會造成膠縮。II.膜、濾紙、膠大小有何講究？解答：如果是用的是半干轉(zhuǎn)，順序為：

29、陰極一濾紙一膠一膜一 濾紙。濾紙的長寬分別比膠小1 2mm，而膜的長寬分別比膠大1 -2mm。絕對禁忌：上下兩層濾紙因為過大而相互接觸，這樣會短 路，電流不會通過膠和濾紙。JJ.蛋白質(zhì)的分子量跨度很大，如要分離小21KD ,中至66KD,大至170KD,可以一次做好嗎？解答：這么廣的分布不好轉(zhuǎn)移，一般建議：21kd和66kd可以一起轉(zhuǎn)，12 %SDS-PAge ,濕轉(zhuǎn)36V , 3 5hrs就可以了， 可以根據(jù)你實 驗室的經(jīng)驗調(diào)節(jié)；170kd用7%SDS page , 48V 10hrs 16hrs。KK.不能很好地將大分子量蛋白轉(zhuǎn)移到膜上，轉(zhuǎn)移效率低怎么樣解決？解答：可以考慮：轉(zhuǎn)移緩沖液中加

30、入20%甲醇（是指終濃度）（優(yōu)化 的轉(zhuǎn)移緩沖液，可以參考蛋白質(zhì)技術手冊），因為甲醇可降低蛋 白質(zhì)洗脫效率，但可增加蛋白質(zhì)和NC膜的結合能力，甲醇可以防止 凝膠變形，甲醇對高分子量蛋白質(zhì)可延長轉(zhuǎn)移時間； 轉(zhuǎn)移緩沖液加入 終濃度0.1%SDS ,也是為了增加轉(zhuǎn)移效率；用優(yōu)質(zhì)的轉(zhuǎn)移膜，或使 用小孔徑的NC膜（0.2微米）；使用戊二醛交聯(lián)；低濃度膠，如低至6%。太大時還可以考慮用瓊脂糖膠；提高轉(zhuǎn)移電壓/電流；增加 轉(zhuǎn)移時間。LL.如何選擇最合適的蛋白雜交膜？解答：蛋白質(zhì)印跡雜交是分子生物學實驗中極為常用的一門技術。選擇質(zhì)量上層、合乎要求、方便適用的雜交膜是決定這項實驗成敗的重 要環(huán)節(jié)。根據(jù)雜交方案、被

31、轉(zhuǎn)移生物大分子的特性以及分子大小等等 因素，我們要量體裁衣，從雜交膜的材質(zhì)、孔徑和規(guī)格上都要做出合 理的選擇。硝酸纖維素膜：硝酸纖維素膜是蛋白印跡實驗的標準固相支持物。在低離子轉(zhuǎn)移緩沖液的環(huán)境下，大多數(shù)帶負電荷的蛋白質(zhì)會與硝酸纖維 素膜發(fā)生疏水作用而高親和力的結合在一起，雖然這其中的機制還不是十分清楚，但由于硝酸纖維素膜的這個特性，而且易于封閉非特異 性結合，從而得到了廣泛的應用。在非離子型的去污劑作用下，結合 的蛋白還可以被洗脫下來。根據(jù)被轉(zhuǎn)移的蛋白分子量大小，要選擇不 同孔徑的硝酸纖維素膜。因為隨著膜孔徑的不斷減小，膜對低分子量 蛋白的結合就越牢固。但是膜孔徑如果小于0.1mm,蛋白的轉(zhuǎn)移

32、就很難進行了。因此，我們通常用0.45叩 和0.2叩 兩種規(guī)格的硝酸纖 維素膜。大于20kD的蛋白就可以用0.45叩 的膜，小于20kD的蛋 白就要用0.2叩的膜了，如果用0.45頃的膜就會發(fā)生“Blowthro昭h的現(xiàn)象。從膜的質(zhì)地上來看，最重要的指標就是單位面積上能夠結合 的蛋白的量。硝酸纖維素膜的結合能力主要與膜的硝酸纖維素的純度 有關，市場上有些硝酸纖維素膜通常會還有大量的醋酸纖維素，因而降低了蛋白的結合量。S&S公司采用的是100%純度的硝酸纖維素， 保證了最大的蛋白結合量，可達80-150昭/cm2。由于100%的純度, 因而也大大減少了非特異性的結合， 降低雜交背景，無需

33、高嚴謹度的 洗脫步驟。其次，膜的強度和韌性也是需要考慮的因素。常規(guī)的硝酸 纖維素膜比較脆，漂洗一兩次就會破損，不能反復使用。PVDF轉(zhuǎn)移膜：PVDF是一種高強度、耐腐蝕的物質(zhì)，通常是用來制 造水管的。PVDF膜可以結合蛋白質(zhì)，而且可以分離小片段的蛋白質(zhì)， 最初是將它用于蛋白質(zhì)的序列測定，因為硝酸纖維素膜在Edman試劑中會降解，所以就尋找了PDVF作為替代品，雖然PDVF膜結合 蛋白的效率沒有硝酸纖維素膜高，但由于它的穩(wěn)定、耐腐蝕使它成為 蛋白測序理想的用品，一直沿用至今。PVDF膜與硝酸纖維素膜一樣， 可以進行各種染色和化學發(fā)光檢測，也有很廣的適用范圍。這種PVDF膜，靈敏度、分辨率和蛋白親

34、和力在精細工藝下比常規(guī)的膜都 要高，非常適合于低分子量蛋白的檢測。但PVDF膜在使用之前必 需用純甲醇進行浸泡飽和1-5秒鐘。離子交換型轉(zhuǎn)移膜：硝酸纖維素和PVDF膜是靠疏水作用結合蛋白 的，還有一類膜是根據(jù)離子交換的方式結合生物大分子的。由DEAE（二乙氨乙基）修飾的纖維素制成的DEAE陰離子交換膜同樣可以 作為蛋白質(zhì)印跡的固相支持物。DEAE可以有效的結合陰離子基團， 包括那些高于其等電點的蛋白質(zhì)。在pH10以下，DEAE基團都能帶 電荷，在低離子強度的轉(zhuǎn)移液中結合蛋白分子。其最適的pH環(huán)境為5-7。DEAE膜可以用于蛋白多糖、病毒、酶以及血紅蛋白的研究。這種0.45孔徑的DEAE膜，除了

35、可以做Western Blotting夕卜，還可以用于核酸結合研究。還有一種離子交換型膜是愈甲基(CM)修飾的纖維素膜，它可以結合蛋白和多肽分子，以及其他的一些帶正電荷的樣品，最適結合pH范圍在4-7。結合的多肽分子可以從CM膜上洗脫下來，用于氨基酸 系列分析或微測序。5. Marker的相關疑問MM.我用的是可視marker (BIO_RAD ),但是電泳總跑不全8條帶, 請問什么原因？怎樣改善？膠用過8%, 10%, 12%，都是這樣。marker是新買的。解答：一般來說，是小分子量Marker跑走了，增加膠濃度或減少電 泳時間試試看。當然梯度膠也是不錯的選擇。NN.用的是Roche mo

36、lecular Biochemicals公司的由100kd , 75kd , 45kd , 30kd ,20kd , 10kd組成的marker。開始做Western Blot時 還能夠看到marker,當然也僅能看見其中最多三條帶。用80V進行SDS-PAGE電泳，用恒壓10V45min轉(zhuǎn)印的。前幾次做Western Blot時沒有進行麗春紅染色，但盡管用了此方法也僅能看到marker有一 條大約是30KD的條帶出現(xiàn)。再就是把70KD和130KD兩個目的蛋 白同時在一塊膠上進行分析，用培養(yǎng)基樣品進行分析，沒有用間接法， 而是直接用融合蛋白C端的V5表位的酶聯(lián)抗體(Anti-V5-HRP )。

37、但就是出不來結果，我很茫然。謝謝您過給予指點!解答：1、“我用的是Roche molecular Biochemicals公司的由100kd , 75kd ,45kd , 30kd , 20kd , 10kd組成的markero開始做Western Blot時還能夠看到marker,當然也僅能看見其中最多三條帶。”有的時候,Prestained Marker放久了效果就會變差，電泳是條帶不清晰，擴散。但是你的問題可能還有其他的方面的問題，可能是蛋白跟膜結合的不緊密。轉(zhuǎn)移是多加點甲醇。2、 “前幾次做WesternBlot時沒有進行麗春紅染色，但盡管用了此方 法也僅能看到marker有一條大約是

38、30KD的條帶出現(xiàn)?！鞭D(zhuǎn)移時半干 法建議用恒流，你這樣的也就30kd-50kd的轉(zhuǎn)移地比較好。3、 “再就是把70KD和130KD兩個目的蛋白同時在一塊膠上進行分析，用培養(yǎng)基樣品進行分析，沒有用間接法，而是直接用融合蛋白C端的V5表位的酶聯(lián)抗體(Anti-V5-HRP )?！笔欠駲z測了表達量，二抗是否是好的，你做了陽性對照？你要做這么 大的蛋白最好轉(zhuǎn)移時間延長到1.5hrs。6.染色的選擇OO. Western Blot哪種染色好？解答：(1)陰離子染料是最常用的，特別是氨基黑，脫色快，背景低檢測極限可達到1.5四，考馬雖然與氨基黑有相同的靈敏度，但脫 色慢，背景局。麗春紅S和快綠在檢測后容易

39、從蛋白質(zhì)中除去，以便進行隨后的氨基酸分析。缺點是：溶劑系統(tǒng)的甲醇會引起硝化纖維素膜的 皺縮或破壞。不能用語正電賀的膜。靈敏度低。(2)膠體金，靈敏度高，檢測范圍可到pg級，但染色比穩(wěn)定。(3)生物素化靈敏度位于1、2之間，可用于任何一種膜。7.參照的疑問PP.是否Western Blot實驗半定量一定要加ACTIN內(nèi)參？解答：對于發(fā)表文章的實驗最好加內(nèi)參，實驗嚴謹。QQ.用BANDSCAN分析結果行嗎？解答：分析一般的結果沒問題。RR.核內(nèi)抗原Western Blot內(nèi)參選擇什么合適？解答：可以選用組蛋白，組蛋白在細胞核中的表達是很穩(wěn)定的，有很 多都可以當成內(nèi)參，在網(wǎng)上查查就可以選出你要的內(nèi)參

40、。SS.轉(zhuǎn)膜時采用電流是否比電壓準確，是否根據(jù)0.8mA/cm2 ,一般1小時左右？解答：不是的，半干法推薦用恒流，一般根據(jù)目的蛋白的大小來確定電流和時間。TT.做半定量人卵巢癌細胞系的Western Blot，內(nèi)參B-actin ,GAPDH ,那個好？解答：選用beta-actin就可以。8.緩沖液配方的常見問題UU.轉(zhuǎn)膜后的脫脂奶粉封閉時，所用的防沫劑A是什么？還有Tris-HCl是不是就是用Tris和鹽酸配出來的呢？解答：轉(zhuǎn)膜后的脫脂奶粉封閉液是5%的TBST脫脂奶粉。Tris - HCl就是Tris鹽用HCl調(diào)ph值，配置而成。VV.準備做大鼠腦子的Western Blot,蛋白質(zhì)位

41、于細胞核中，請問此 蛋白質(zhì)的提取液及操作方法是？每一步都必須要低溫嗎？這種蛋白 質(zhì)是磷酸化的蛋白質(zhì)，操作時如何防止去磷酸化的發(fā)生？解答：可以用提取總蛋白的buffer提核蛋白，可以加NaF防止去磷 酸化。WW.想問一下細胞裂解液選擇蛋白酶抑制劑時有什么原則嗎？受不 受組織來源的影響？胞膜和胞漿有區(qū)別嗎？解答：一般來說提取時加入光譜的蛋白酶抑制劑就可以了，操作時保持低溫。除非有文獻特別指明用特殊的方法，一般來說都沒有區(qū)別。XX.最近作了兩次Western Blot,不但沒陽性結果，顯色背景都沒有， 電泳和轉(zhuǎn)膜都染過，有條帶。底片和顯色液及DAB顯色液均試過，沒問題。1、檢測GAD-分子量67kd

42、 ,提取液有蔗糖，其余同三去污 裂解液。蔗糖不會有影響把？樣本-20度放置一周內(nèi)測。2、一抗放 置2年，可能效價不高！用的是1:100。如果是一抗的原因，不會背 景都沒有把？ 3、第一次有不均勻背景，因為一抗過夜時密封袋不均 勻。后兩次無背景顯色。4、封閉液用的是含15%脫脂奶粉TBST,漂洗液用的是含 1%BSA 的 TBST 液，TWEEN-20 為0.1% ,不會是 封閉液的問題吧?解答：可以在下面幾個問題上找找原因。1.封閉液用5%Milk,漂洗 液(washingbuffer用TBST) 2.看看一抗是否能work,降到1： 20。3.看看二抗是否有問題。YY.加甲醇的目的是什么？解

43、答：加甲醇起著一定的固定作用，因為小分子蛋白質(zhì)容易轉(zhuǎn)出去.(特 別是在硝酸纖維素膜上，因為NC膜結合蛋白質(zhì)的能力較弱)。ZZ.“轉(zhuǎn)膜后的脫脂奶粉封閉液是5%的TBST脫脂奶粉”， 其中TBST最后那個T是Tween嗎，濃度多大？解答：是Tween，配方如下：Tris-Buffered Saline Tween-20 (TBST), Dissolve8.8g of NaCl , 0.2g of KCl , and 3g of Tris base in 800ml of distilled H2O, Add500ul of Tween-20, Adjust the pH to 7.4 with H

44、Cl, Add distilled H2O to 1L,Sterilize by autoclaving.AAA.封閉，一抗，二抗時的溫度有沒有什么規(guī)定呢，比如現(xiàn)在我就 在室溫里做，或者要在4度下？解答：均可在室溫進行，如果時間不夠，一抗孵育可以先在室溫進行 一個小時，然后4度過夜。BBB.實驗室暫無NP40我用sds可以嗎？另外有過用尿素和硫月尿提 取膜蛋白嗎？配方如下：7M尿素，2M硫月尿，Triton-x-1000.2ml ,新鮮加入：65mM DTT蛋白酶抑制劑：試劑盒HaltTM Protease inhibitor cocktail kit 1%（v/v）是用于抽提雙向電泳用蛋白的

45、配方。 不止用于抽提細胞全蛋白（主要 是想得到其中的膜蛋白）是否可行？改良的RIPA裂解緩沖液（Tris.HCl , 50 mmol/L , pH 7.5; NaCl , 150 mmol/L;NP-40 , 1%;脫氧膽酸鈉，0.5%; SDS , 0.1%; EDTA , 1 mmol/L; PMSF , 1 mmol/L;Leupeptin , 2四/ml）不知對于膜蛋白 效果如何？此外該方中的EDTA ,是否用做蛋白酶抑制劑？ 解答：做2 D絕對不推薦使用NP-4 0（因為即使進口的NP- 4 0也不純，其中的雜質(zhì)會影響質(zhì)譜結果）。對于動物細胞，其蛋 白酶活性較弱（相對于組織和大腸桿菌

46、等），可以不使用cocktail ,因為7M尿素+2 M硫月尿+4 %CH AP S構成的變性環(huán)境已經(jīng)足 以抑制大部分蛋白酶的活性，2 M硫月尿+4 %CH AP S對于抽提膜 蛋白有很大的幫助，不過如果您專職做膜蛋白建議采用分級抽提法。 此外還可以采用梯度離心法和一些基于去垢劑的方法。EDTA用于滅活金屬蛋白酶（主要是其鰲合作用）。加過多的蛋白酶抑制劑可以 導致蛋白質(zhì)的修飾，做WB無所謂，做MAILD I時會給正確鑒定 帶來麻煩。裂解緩沖液中少了兩性電解質(zhì)（在2-D裂解緩沖液中，兩 性電解質(zhì)起的作用：提供連續(xù)的PH梯度，從很大程度上增加蛋白質(zhì) 的溶解性；還可以去除一部分核酸）；也不推薦采用S

47、DS，因SDS會 與蛋白質(zhì)結合導致其等電點發(fā)生改變，如果您實在要用，終濃度降到0.1%以下METHOD2(50ml總量)：？-mercaptoethanol 342底20% SDS 5 ml ; Tris-Cl pH 6.7 3.125ml;力口ddH2O至50 ml。方法：將用過的膜浸入stripping buffer中，置50 C水浴箱中30min，間斷振搖。之后用TTBS洗3*5min就好。此 時你已經(jīng)可以按新的轉(zhuǎn)移好的膜來再次使用了。該方法的優(yōu)點：省事，省力，省錢，符合國際慣例。METHOD31、beta-metaptoethanol 35ul2、10%SDS 1ml3、tris (

48、0.5M , pH6.7) 625ul4、dH2O 3.34ml50 -55 C , 30min。METHOD4stripping buffer應該是可以放置很久的。不過我習慣于現(xiàn)配- 畢竟，加了6-mercaptoethanol以后太難聞了，配了就用；而且，有了 現(xiàn)成的Tris-HCl緩沖液和SDS的母液，現(xiàn)配還是很方便的。每次用 量5ml少了點，我每次用50ml。METHOD5 0.5M NaCl , 0.5M HAc ;室溫搖床15min。METHOD6將用過的膜泡在1*TBS中室溫振搖過夜，中間可以換液2-3次，然 后封閉，加一抗，二抗（同第一次發(fā)光），實踐證明方法完全可行。不管用那種

49、方法，洗脫后都要用PBS或TBS再洗幾次。9.條件的摸索DDD.用的是SantaCruz的抗體， 也實驗過一抗和二抗肯定能結合， 二抗加DAB肯定能顯色。電泳的膠用考馬斯亮藍染色沒問題，但是 不知道與Marker對應的條帶是否是我要的（我目的蛋白的分子量分 別是55KD、29KD）。半干法2小時轉(zhuǎn)膜后，麗春紅染色發(fā)現(xiàn)大分 子量蛋白轉(zhuǎn)過去的較少。難道是裂解液出了問題？我用的是三去污 劑，但沒加疊氮鈉和大概叫Apoptin的那種蛋白酶抑制劑。冰上裂解-80度凍存的細胞，4度12000g離心5分鐘，取上清，與分子克隆 （第二版）上的加樣buffer混合，沸水變隹5分鐘，上樣。不知道是 哪里出了問題？

50、 解答：建議：1、首先確定您提的蛋白質(zhì)量如何？可用PIERCE公司 的BCA試劑盒測蛋白的濃度，一般來講，其濃度應該在幾-20微克/微升。2、若是蛋白沒問題，哪就看是不是電泳的問題，首先要看膠的濃度， 您目的蛋白的分子量分別是55KD、29KD，建議分別用10%和12%的膠。60-80V, 1小時左右。跑過積層膠與分離膠的線時，換用100V , 3-4小時。3、轉(zhuǎn)膜，建議恒壓，15V，不用轉(zhuǎn)2小時，45分鐘足以。您所說的 大蛋白轉(zhuǎn)過去的，并不是真正的少，而是因為在提的蛋白中大蛋白本 身就很少。我曾經(jīng)也轉(zhuǎn)過2小時，但和45分鐘的區(qū)別并不大。4、根據(jù)MARKER的條帶 （我的是7條帶：14、18、

51、25、35、45、66、116KD） ,您根據(jù)MARKER的條帶剪下25與35之間（29KD）的條帶，45-66之間（50KD）的條帶。這樣第一，可以節(jié)省抗體， 第二，您要的目的條帶肯定在上面。5、延長1抗、2抗孵育時間（我曾室溫1小時，4度過夜），適當 加大1抗?jié)舛取?、我買的也是Santa Cruz的抗體，我覺得質(zhì)量還可以，我想您應該 先找其他方面的原因。EEE.電泳用的是恒流， 一塊膠，20mA ,100分鐘左右。 轉(zhuǎn)膜也是恒 流，38mA ,100分鐘。而且我用別人的細胞和一抗在我的整個反應 體系下做出來了，當然彼此的目的蛋白不同。所以，我想問題應該出 在抗原和一抗上，不知對不對。解答

52、：電泳的條件：樣品的分子量決定了膠的濃度，一般使樣品跑至 膠的中部即可。正常條件下，電泳時漠酚藍和10kd左右蛋白跑在一FFF. BIO-RAD的半干轉(zhuǎn)運系統(tǒng)有一個很致命的弱點就是無法控溫起。由此可以決定電泳的電壓和時間。建議你用恒壓80100伏（我用的就是這種），當電流過高，而系統(tǒng)的散熱又比較差，濾紙的 吸水性比較差的情況下，就很容易燒膠。就轉(zhuǎn)膜時，是采取恒壓還是恒流的問題，我想和大家探討一下，我感 覺我這個系統(tǒng)用恒流很容易燒膠，我的膠有68cm2，用50mA恒流來轉(zhuǎn)膜，剛開始電壓就很高，有20 v左右，而用恒壓，開始電流有110mA,但15min后，電流就降到8OmA , 30min后就穩(wěn)

53、定在40mA ,不就相當于恒流嗎？解答：恒流時電壓逐漸升高的原因是濕濾紙逐漸變干因而電阻逐漸增 大的緣故，如果電壓升得太快，可以使濾紙更濕一些以克服。就我的 感覺，20V的電流30min以后20Kd以下的分子丟失很多，不過我用 的是小膠40cm2 ,不知有無不同。GGG.我想盡量提高轉(zhuǎn)膜的效率（我的實驗要求轉(zhuǎn)到膜上的蛋白越多 越好，不管是什么大小蛋白）不知道有那些辦法？解答：不管怎么轉(zhuǎn)都會存在蛋白轉(zhuǎn)移不完全（電壓過小時間過短）或 過度轉(zhuǎn)移（電壓過大時間過長）的問題，魚（小分子量蛋白）和熊掌（大分子量蛋白）不可得兼呵呵。建議把膠切成兩半，比如以35KD為界，分別進行轉(zhuǎn)膜，下半時間短，上半時間長一

54、點，應該會好一些。HHH.請問一下PVDF膜和硝酸膜結合蛋白的原理是什么？解答：一般而言，硝酸纖維素膜是通過疏水作用來和蛋白質(zhì)相聯(lián)，這 樣的話，反復洗幾次后，蛋白容易掉下來，結果較差。尼龍膜主要通過它膜上的正電荷和蛋白接合（注：常用的PVDF即帶正電荷的尼 龍膜），同時也有疏水作用，但相對較弱。這樣的話，PVDF膜和蛋白接合較牢，不易脫落，結果較好。III. 1、煮好后的樣品，若沒有及時上樣分離，應如何保存，可以保存 多久？2、有沒有人在用bio-rad的小型垂直電泳槽，有沒有操作手 冊？3、濕式轉(zhuǎn)移時是否必須要用bio-rad的專用濾紙？4、恒壓轉(zhuǎn)移 的條件如何確定，因為我要分離小至21KD

55、，中至66KD，大致170KD的蛋白質(zhì)，轉(zhuǎn)移條件能夠相同嗎？5、凝膠的濃度是不是可以用一個濃度？書上寫不同的凝膠濃度分離的分子量范圍不同，還給出了一個線形范圍，是不是不在這個范圍內(nèi)也能分離，只是就不是線性范圍 了？解答：1、煮好后的樣品，放到-20,我們在一個月后此樣品，效果一 樣。2、bio-rad的小型垂直電泳槽的操作手冊在他們的主頁Bio-Rad USA上有。3、轉(zhuǎn)移時一般的WATERMEN濾紙就可以。4、轉(zhuǎn)移條件是和蛋白質(zhì)大小有關的：以次確定電壓和時間。具體可 讓ptglab幫你定奪。5、凝膠的濃度也是和分離蛋白質(zhì)大小有關。不是隨心所欲選的，否 則分離效果可能不是你所期望的。JJJ.怎

56、樣設計實驗來確定最佳的條件？ 解答：隨便說一點，具體的還是需要白己想：1、在每個上樣孔里上同樣的蛋白樣品，量也一樣，最好是組織樣，（也可以跑1個大well,不插梳子，多上樣，）SDS-page ;2、轉(zhuǎn)移， 設定電流或電壓；3、每隔1 （orn）小時，取一點膜染色，看轉(zhuǎn)移效果。KKK.我要測兩種抗體，一種為磷酸化的目的蛋白，一種為總的目的 蛋白，不知道用什么方法strip最好，我用甘氨酸（PH2.9）漂洗15分鐘，似乎沒什么效果？解答：你可以加筑基乙醇（loadingbuffer一樣的濃度），56度，30mins ,看看。LLL. 1、在用PBS洗滌抗原-抗體-ProteinA-Agarose

57、復合物時，每次 要重懸多長時間合適？2、最后用2xSDS重懸抗原-抗體復合物離心 后，由于2XSDS中已經(jīng)加入了漠芬蘭，因此下面的Agarose珠子幾 乎看不到，所以吸取上清加樣時也不知道里面是否吸進了Agarose。不知有什么方法可以解決這個問題，或者即使吸進了一些Agarose也不要緊呢？解答：1、不用重懸多久，重懸起來了就可以離心了。2、力口2X BUFFER前大體上已經(jīng)知道有多少膠粒了，吸到那個位置 時小心點就是了。我也試過一些次，首先離心稍微長一點，長20秒 吧，希望膠粒能沉得結實點（我想象的），再吸取。如果感覺槍頭不是很順暢的時候可能就是碰到膠粒了。彳艮難一點膠粒也吸取不上來 的，

58、盡力做好就是了。MMM.磷酸化抗體的檢測樣本制備時是否一定要加NaF等？解答：NaF是一種廣譜磷酸化酶的抑制劑，一般最好加。但是不加也 可以，大部分時候是不用加的。我做的時候從未加過，都做出來了。NNN. Western Blot中block的最短時間？解答：每一步1小時足夠了，中間換抗體要洗的話多換液幾次，每 次時間10分鐘就夠，洗3次只要半小時。跑膠1小時，轉(zhuǎn)移1小 時，block半小時就行，1抗1小時，洗半小時，2抗1小時，洗半 小時，顯色10分鐘。一般跑兩塊膠，一塊染色，一塊westerno一天肯定完事，一般不用等到第二天。OOO.想用Western檢測基因轉(zhuǎn)染后細胞培養(yǎng)上清中表達的目

59、的蛋 白（定性），分子量為20KD，濃度約為幾百ng/ml。蛋白樣品需濃 縮、純化嗎？如何濃縮、純化上清液中的目的蛋白？對小分子蛋白Western blot時需特別注意哪些條件？解答：按照你提供的濃度，如果做Western Blot ,是不用濃縮樣品的 對于20kd的小分子的蛋白，Western Blot中要注意的是：1、轉(zhuǎn)移時的時間，2、轉(zhuǎn)移時的電流或電壓.3、transfer buffer中加20%的甲醇.4、可以用13-15%的分離膠.PPP.蛋白分子量大小分別為21kd、28kd ,用的是濕轉(zhuǎn)，請問多大電流，多長時間比較合適？解答：分子量比較小，最好是用干轉(zhuǎn)，濕轉(zhuǎn)效率太高，易轉(zhuǎn)過了。干

60、 轉(zhuǎn)的話，用2.5 A/cm2 , 30min就應該夠了。濕轉(zhuǎn)，按照bio-rad的說明，用100mA,也得要半個多小時吧。QQQ.需要測同一種蛋白質(zhì)的總量與磷酸化的量， 但相互間干擾太 大， 怎么辦？解答：將膜放入stripping buffer (SDS 2% ,Tris Cl (PH=6.7) 62.5mM , beta-筑基乙醇100mM )中，50C孵育30分鐘，TTBS西三次， 再重新加入一抗，進行另一種抗原的檢測。RRR.做Western Blot實驗時，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)膜時的電流總是偏小， 轉(zhuǎn)膜的 效率也偏低.100V恒壓轉(zhuǎn)膜時的電流只有190mA左右，而以前都有250mA。體系和條件都和以前一