抗凍基因KN2表達載體的構建及大麥遺傳轉化的研究

1、 分類號 密級華中農業(yè)大學碩士學位論文抗凍基因表達載體的構建及大麥遺傳轉化研究研究生:萬萌學 號:指導教師:孫東發(fā)教授指導小組:孫東發(fā)教授孫根樓教授專 業(yè):作物遺傳育種 研究方向:麥作遺傳育種獲得學位名稱:農學碩士 獲得學位時間:年月華中農業(yè)大學植物科學技術學院二。一三年六月華中農業(yè)大學學位論文獨創(chuàng)性聲明及使用授權書學位論文如需保密,解密時間 年 月 日是否保密雷獨創(chuàng)性聲明本人聲明所呈交的論文是我個人在導師指導下進行的研究工作及取得的研究成果.盡我所知,除了文中特別加以標注和致謝的地方外,論文中不包含其他人已經發(fā)表或撰寫過的研究成果,也不包含為獲得華中農業(yè)大學或其他教育機構的學位或證書而使過的

2、材料,指導教師對此進行了審定。與我一同工作的同志對本研究所做的任何貢獻均已在論文中做了明確的說明,并表示了謝意。蝴:矽弓年鄉(xiāng)月弓日研究生簽名:湯鱺學位論文使用授權書本人完全了解華中農業(yè)大學關于保存、使用學位論文的規(guī)定,即學生必須按照學校要求提交學位論文的印刷本和電子版本;學校有權保存提交論文的印制版和電子版,并提供目錄檢索和閱覽服務,可以采用影印、縮印或掃描等復制手段保存、匯編學位論文。本人同意華中農業(yè)大學可以用不同方式在不同媒體上發(fā)表、傳播學位論文的全部或部分內容,為存在館際合作關系的兄弟高校用戶提供文獻傳遞和交換服務,同時本人保留在其他媒體發(fā)表論文的權力。注:保密學位論文即涉及技術秘密、商

3、業(yè)秘密或申請專利等潛在需要提交保密的論文在解密后適用予本授權書.四黼張乃翻翩始參歡簽名日期:勱心年易月弓日 簽名日期:凇乃年么月歲日注:請將本表壹接裝訂在學位論文的扉頁和目錄之間抗凍基因表達載體的構建及遺傳轉化研究目錄摘 要?.?.?.第一章文獻綜述.大麥遺傳轉化技術研究現(xiàn)狀與進展?.大麥的遺傳轉化方法.基因槍轉化法?.電穿孔?.顯微注射?.花粉管通道法?.農桿菌介導法?.轉基因技術在大麥研究中的應用?.大麥抗病害研究.環(huán)境脅迫抗性應用?.大麥品質改良應用?.植物抗凍基因工程研究進展?.抗凍基因的來源.抗凍基因的應用.抗凍蛋白基因?.脯氨酸基因?.脂肪酸去飽和酶基因?.超氧化物歧化酶基因?研究

4、的目的意義第二章大麥幼胚再生體系的建立材料和方法.材料.培養(yǎng)基?.大麥愈傷組織的誘導、繼代培養(yǎng)、分化及植株再生華中農業(yè)大學屆碩士學位畢業(yè)論文結果統(tǒng)計及分析.統(tǒng)計方法?.幼胚愈傷組織的誘導與再生?.不同基因型對幼胚愈傷組織誘導及分化的影響. 對幼胚愈傷組織誘導的影響.第三章基因表達載體的構建與遺傳轉化實驗材料與方法.材料?.實驗方法.基因表達載體的構建.基因表達載體構建策略?.引物設計與反應條件.割膠回收目的片段.載體的連接?.法制備大腸桿菌感受態(tài)細胞.質粒向大腸桿菌的轉化?.測序?.質粒提取:.質粒酶切與連接?.載體的構建.農桿菌介導的大麥遺傳轉化?.大麥組織培養(yǎng)過程中的培養(yǎng)基制備.電轉化農桿

5、菌感受態(tài)細胞的制備.質粒轉化農桿菌?.農桿菌標準培養(yǎng)物的制備.侵染和共培養(yǎng)?.篩選培養(yǎng)和植株再生.轉基因大麥植株檢測結果與分析?抗凍基因表達載體的構建及遺傳轉化研究.基因表達載體的構建.基因的擴增與載體連接?.表達載體 的構建向農桿菌的轉化?.表達載體.農桿菌介導的遺傳轉化?.農桿菌介導幼胚的轉化及植株再生.轉基因大麥植株檢測?.第四章討論大麥幼胚再生體系的建立表達載體構建中的影響因素?農桿菌介導的遺傳轉化參考文獻?附錄:縮略語表附錄:常用培養(yǎng)基及其它試劑和抗生素母液配方?附錄:基因編碼序列致射.抗凍基因表達載體的構建及遺傳轉化研究摘要大麥.是世界重要的糧食作物,在全球范圍內廣泛種植,是啤酒和

6、飼料的主要原料。經過近十年的發(fā)展,大麥基因工程研究得到了廣泛的應用,在大麥品質改良、抗病研究和抗脅迫等領域獲得了很多具有積極意義的成果。近年來,全球氣候變化無常,自然災害頻繁發(fā)生,其中凍害已經對大麥的生產造成了嚴重的影響,隨著轉基因技術的發(fā)展,將優(yōu)良的外源抗凍基因轉化到大麥中去,可顯著提高大麥的抗凍性。本研究以不同大麥品種為材料建立了大麥幼胚再生體系,構建了高效的抗凍基因表達載體,并且對其進行了遺傳轉化研究。得到的研究結果如下:以個大麥品種美里黃金,華大麥號,華大麥號的幼胚為試驗材料,建立了大麥再生體系并對比了這四個品種之間的差異。研究結果表明:這四個品種的離體培養(yǎng)效果都很好,均可作為遺傳轉化

7、的受體,誘導培養(yǎng)基中添加./的對胚性愈傷組織的形成和再分化有促進作用。以植物表達載體為基礎,通過在引物的兩端分別設計酶切位點和,采用載體與擴增的目的基因連接。分別酶,膠回收酶切產物并連切帶有目的基因的載體和高效表達載體,并將其導入農桿菌接,得到含抗凍基因的高效表達載體菌株,為農桿菌介導的抗凍基因遺傳轉化研究夯實了基礎。農桿菌介導大麥的遺傳轉化研究:試驗中以美里黃金、華大麥號和華大麥號這四個基因型的幼胚作為轉化受體,采用農桿菌介導法對抗凍基因進行了遺傳轉化研究。最后得到株抗性大麥植株,初步分子檢測結果顯示,其中的株為陽性植株。關鍵詞:大麥;再生體系;幼胚;抗凍基因;農桿菌介導的遺傳轉化華中農業(yè)大

8、學屆碩士學位畢業(yè)論文 ., ,.,., .?. : /.,./ .?. . , ,.? . ; ; ;:;? 抗凍基因表達載體的構建及遺傳轉化研究第一章文獻綜述大麥遺傳轉化技術研究現(xiàn)狀與進展大麥的種植總面積和種植總產量僅低于小麥、水稻、玉米,是禾本科大麥屬的一年或越年生草本植物。大麥是自花授粉的二倍體植物中基因組比較小的、適于遺傳學和生理學研究的重要模式作物,在全球范圍內廣泛種植。在大麥的多個品種中,二棱大麥亞種和多棱大麥亞種是種植面積最為廣泛的品種。大麥主要用于動物飼料、啤酒生產、健康食品、醫(yī)藥原料等許多方面 .,。大麥還有許多優(yōu)良特性如:早熟、短生育期、極強的氣候適應性以及輪作適合等。在以

9、往大麥的育種研究領域中,主要采用的是常規(guī)的雜交育種手段,傳統(tǒng)的育種技術具有諸多缺點,如一般只能在生物種內實現(xiàn)基因轉移,可利用的基因資源受限,基因在轉移的過程中無目的性,大量的不良基因也可能一起轉移,后代的基因分離具有不缺點性,后期的育種工作量巨大,穩(wěn)定性差,育種年限長等。為加快農業(yè)的快速發(fā)展,促進農作物新品種的形成,轉基因技術在作物育種領域得到了廣泛的應用,轉基因技術可以將優(yōu)良基因有目的性的轉移到作物中去,基因的來源廣泛,打破了不同物種間的雜交障礙,基因在后代的表現(xiàn)可精確預期,縮短了育種年限,而且轉基因技術還可以與常規(guī)育種技術緊密結合,培育出更多的優(yōu)良品種。自第一株轉基因大麥獲得后 .,特別在

10、組織培養(yǎng)技術不斷進步的支持下,轉基因技術在大麥育種中廣泛應用,并得到了許多有益成果。.大麥的遺傳轉化方法隨著大麥轉基因技術的不斷發(fā)展,其遺傳轉化方法也趨于多樣化,包括直接轉化法如:微粒轟擊 ,電穿一孑,花粉管通道法,顯微注射等,而農桿菌轉化法則是主要的間接轉化法。.基因槍轉化法基因槍法的原理是采用高壓氣體或者火藥爆炸等產生動力并驅動表面含有轉華中農業(yè)大學屆碩士學位畢業(yè)論文化基因的金屬顆粒,以極快的速度射入生物體內,由于速度極快,植物體不需要去除細胞壁和細胞膜,就可以將目的基因導入細胞內,從而整合入作物基因組中,實現(xiàn)了基因的轉移。該法由美國生物學家率先提出,通過近年的發(fā)展,現(xiàn)在基因槍轉化技術已經

11、在水稻、小麥、玉米、大豆等許多作物上得到了應用,而且該技術還可以轉化很多其他方法難以轉化的植物。基因槍法在實際的應用方面具有很多優(yōu)點,由于采用的是高壓氣體驅動,其中的許多條件可精確控制;金粉上附著的基因來源廣泛,可以從不同生物體內獲得;目標受體的類型不受限制,可以是幼胚、愈傷組織、原生組織;而且基因槍法還是細胞器遺傳轉化的有效技術。但是基因槍技術也有缺點,在高壓氣體驅動過程中,外源基因可能會發(fā)生斷裂,導致插入的基因失活;基因槍轉化法常常會將多拷貝導入受體基因組中,導入的基因會發(fā)生多種重排,而且同源序列會以多種方式相互作用,導致基因沉默現(xiàn)象的發(fā)生;同時基因槍法的隨機性和高費用也是其主要缺點。和首

12、次將含基因與基因的質粒通過基因槍法導入大麥中去,得到轉基因植株,目的基因在后代中穩(wěn)定遺傳和表達,并且在實驗中以大麥幼胚、愈傷組織、小孢子等建立起來的基因槍轉化體系具有高效、快速、可行性高等優(yōu)點。近年來,基因槍法在大麥育種領域中應用廣泛,已將不同來源不同用途的優(yōu)良基因導入大麥中去,獲得了許多優(yōu)良成果。 .,。.電穿孔電穿孔又稱電擊法,該技術可以將等其他類的生物大分子導入細胞內部進行研究,如蛋白分子、糖類分子、病毒顆粒等。其主要原理是利用高壓電磁脈沖,使處在高壓電場中的細胞的細胞壁和細胞膜表面發(fā)生小孔,改變細胞壁與細胞膜的通透性,促進其他生物大分子的導入。電穿孔具有操作方便、低毒性、用途廣泛等優(yōu)點

13、。在大麥的遺傳轉化領域得到應用,并取得了一些成果。年,.等通過高壓電場處理大麥愈傷組織的原生質體,通過電擊法成功的將外源基因導入原生質體中,在得到的株轉基因植株中,目的基因在后代中都得到了穩(wěn)定的表達。電擊法在實際的操作過程中往往會造成原生質體的嚴重損傷,并且電擊儀也比較昂貴。在大麥轉化中,電擊法并不常用。抗凍基因表達載體的構建及遺傳轉化研究.顯微注射顯微注射法是使用毛細微管一般針尖的直徑為.,在顯微鏡下將外源物質如外源基因、片段、信使核糖核酸、蛋白質等注入植物細胞或原生質體的一種直接而完善的方法。采用此方法轉化植物時需要嚴格的操作技術和組織培養(yǎng)技術。在植物的基因轉化方面,成功的案例不多,年,等

14、采用此技術將基因注入大麥的原生質體細胞中,成功的獲得了兩個穩(wěn)定遺傳的柱系,表明顯微注射技術在作物轉基因領域具有良好的前景。.花粉管通道法在植物開花授粉后的一段時間內,通過向子房中注射一定量的溶液,使溶液能沿著花粉管滲入,通過珠心管道進入胚囊中,將目的基因整合到植株基因組中的方法便是花粉管通道法,該方法是年由周光宇發(fā)現(xiàn)并建立起來的?；ǚ酃芡ǖ婪ㄞD化實質是受精過程轉化。這種技術的原理可以應用于任何開花的植物。近年來花粉管通道法發(fā)展迅速。雖然學術界對花粉管通道法還存在諸多爭議,但由于該轉化技術在設備和技術上的低要求,還可以轉移多基因控制的數(shù)量性狀,目前花粉管通道法已經在大麥、棉花、大豆等作物的遺傳轉

15、化方面成功應用,并獲得了相應的轉化植株。.農桿菌介導法雙子葉植物在生長時根部往往會出現(xiàn)冠癭瘤的形成。年,等發(fā)現(xiàn)在土壤中無農桿菌的情況下,植株依然會發(fā)生冠癭瘤的形成,對此,他猜測是一種可以脫離農桿菌的遺傳因子導致了冠癭瘤的形成,并提出了冠癭瘤誘導因子假說。和 發(fā)現(xiàn)農桿菌的致病能力與其體內的質粒的存在與否有著明顯的關系,通過實驗發(fā)現(xiàn),喪失致病能力的農桿菌菌株中質粒全部丟失,并推測冠癭瘤誘導因子就是質粒。等在產生冠癭瘤的植株中發(fā)現(xiàn)一段外源片段,通過對其基因序列的比對發(fā)現(xiàn),其與農桿菌中質粒的一段序列高度吻合,從而推測從致病植株中發(fā)現(xiàn)的是通過農桿菌介導進入植株體內的。此后,由農桿菌介導的植物遺傳轉化進入

16、了新的發(fā)展時期。華中農業(yè)大學屆碩士學位畢業(yè)論文目前,應用于植物的遺傳轉化技術主要是基因槍法和農桿菌介導法,由于基因槍介導法的隨機性、不穩(wěn)定性、易丟失和基因沉默現(xiàn)象的普遍存在,導致了外源基因不能在宿主植株內穩(wěn)定遺傳和表達,而農桿菌介導法是一種天然的遺傳轉化體系,具有較高的轉化效率、低拷貝數(shù)、遺傳穩(wěn)定、轉基因沉默現(xiàn)象少等優(yōu)點,。由于單子葉植物對農桿菌沒有明顯的創(chuàng)傷反應,該轉化技術對單子葉植物進行遺傳轉化時比較困難。在大麥遺傳轉化研究方面,農桿菌介導法的起步較晚,但大量的研究成果表明,該技術是有效的大麥遺傳轉化方法。在農桿菌介導的大麥遺傳轉化中,轉化受體有幼胚、成熟胚誘導的愈傷組織、花藥或小孢子愈傷

17、組織等多種形式。其中幼胚由于較高的愈傷組織誘導率、技術成熟、操作簡便且轉化效率高,已經成為大麥農桿菌轉化的主要受體。等利用農桿菌介導法得到的大麥轉基因植株中,發(fā)現(xiàn)其中的%是單拷貝。在農桿菌介導大麥遺傳轉化的實際操作過程中,良好的組織培養(yǎng)技術對轉化效率有明顯的促進作用。研究表明,不同大麥品種之間其愈傷組織的誘導能力存在著明顯差異,目前大麥轉基因研究的主要品種是 ,其再生體系建立相,對容易,是最早被基因槍介導法和農桿菌轉化法成功轉化的品種。不受病害影響、營養(yǎng)充分、未噴灑農藥的大麥植株會獲得比較好的轉化結果,。研究表明,大麥幼胚的大小對農桿菌介導的轉化效率有很大影響,一般.一.直徑的大麥幼胚是最合適

18、的,等用基因槍對大麥幼胚進行創(chuàng)傷預處理,發(fā)現(xiàn)農桿菌侵染更加容易。等研究表明,將未成熟胚進行天的預培養(yǎng)處理,農桿菌轉化后的報告基因瞬時表達量明顯增加。目前,、和等農桿菌菌株廣泛應用于植物的遺傳轉化。其中農桿菌具有極高的毒性,轉化效率是普通菌株的數(shù)倍以上,但是極高的毒性導致其在轉化后期的抑菌難度加大 ,。等認為,共培養(yǎng),對農桿菌的轉化效率有顯著提升。等發(fā)現(xiàn)在侵染液中添加乙酰丁香酮可以速進向受體細胞的轉移。在大麥再生體系建立過程中,培養(yǎng)基可促進幼胚愈傷組織的誘導能力有助于其遺傳轉化 ,在激素的使用方面,的效果要優(yōu)于,. 。抗凍基因表達載體的構建及遺傳轉化研究.轉基因技術在大麥研究中的應用.大麥抗病害

19、研究黃花葉病,是由大麥黃花葉病毒引起。病狀主要表現(xiàn)為輕病株大麥抽穗后,上半部葉片的癥狀有所消退,重病株不能抽穗,黃色花葉轉成黃色條斑,葉脈呈黃綠色,穎殼也生黃斑。二棱大麥染病現(xiàn)銹褐色壞死斑紋,后期葉片變深黃色,植株略矮,易枯死或不抽穗。黃花葉病是長江流域及江蘇、安徽、湖北、上海等省市大麥上的主要病害。年,等利用農桿菌介導法將具有黃花葉病抗性大麥品種和.基因編碼序列轉入敏感品種中去,發(fā)現(xiàn)后代轉基因植株的抗病能力顯著增強。.基因是一種對大麥黃花葉病毒產生抗性的功能基因,其在病毒侵染過程中具有調控能力。白粉病,自幼苗到抽穗均可發(fā)病,由白粉菌感染而發(fā)病的一種真菌性病害,白粉病的發(fā)病區(qū)域主要在潮濕溫和的

20、地方,其主要危害大麥葉片,也危害莖和穗子。一般情況下部葉片比上部葉片病害嚴重,得病期間葉片的光合作用降低,新陳代謝紊亂,進而造成產量的嚴重損失。由于近年來,大麥種植密度的不合理,氮肥等施用量增加,進而造成白粉病染病區(qū)域不斷擴大,對大麥生產造成不利影響。片細胞對白粉病病毒的敏感性。大麥條紋病是大麥的重要病害和防治對象,嚴重危害大麥葉片的生長,初期葉片現(xiàn)黃斑或細小的條紋,后隨葉片生長,下部葉片和新生葉片依次發(fā)病,至拔節(jié)抽穗期,多數(shù)發(fā)病葉片邊緣褐化,并長出黑色霉層,病株矮小或枯死,最終導致大麥減產。等在大麥品種分離出條紋病抗性基及其啟動子區(qū)域,并采用農桿菌介導法將其轉入無抗性品種 ,獲得了轉基因抗性

21、植株。大麥黃矮病是由大麥黃矮病毒引起,依靠蚜蟲在作物植株間傳播,在全國范圍內普遍發(fā)生,常導致大麥、小麥、玉米、水稻等禾本科作物大規(guī)模減產。病狀表現(xiàn)為植株矮小、葉片變黃,早期發(fā)病植株會嚴重矮化,抽穗期發(fā)病常造成大華中農業(yè)大學屆碩士學位畢業(yè)論文麥產量的減少或品質的下降。等通過基因槍轉化法將外殼蛋白品種,并得到個株系的轉基因苗,通過抗病檢測發(fā)現(xiàn)基因轉入大麥共有顆植株具有黃矮病抗性。等采用農桿菌介導法將構建好的含有中,由于這段序列可以形成病毒基因序列的片段轉入大麥發(fā)卡結構,可抑制病毒的感染,發(fā)現(xiàn)個株系的植株產生極強的抗病性。.環(huán)境脅迫抗性應用隨著氣候的無常變化及生態(tài)環(huán)境的破壞,干旱、凍害、鹽堿、金屬離

22、子等不良環(huán)境因素已經對作物的生長發(fā)育造成嚴重危害。許多植物在進化與適應過程中,其體內積累了很多可以協(xié)助其抵御這些環(huán)境脅迫的基因。通過轉基因技術,可充分利用這些基因,促進農業(yè)的發(fā)展。硫氧還蛋白 是大部分生物中共有的小蛋白家族成員,其中包含一個二硫鍵的氧化還原活性中心。近期的研究發(fā)現(xiàn)硫氧還蛋白與抗氧化脅迫有關,硫氧還.,使其在植物應對氧化脅迫損傷蛋白可以與多種抗氧化酶相互作用中具有重要作用。等通過基因槍介導法將硫氧還蛋白基因轉入大麥,得到了轉基因植株。通過對轉基因植株后代生理代謝分析,發(fā)現(xiàn)后代對亞硒酸鹽攝取速度顯著加快,亞硒酸還原能力也得到明顯提高。在高濃度的亞硒酸鹽生長環(huán)境下,轉基因株系具有更好

23、的適應性。等采用農桿菌介導法將小麥基因導入大麥品種中,成功獲得了轉基因植株,該基因的表達產物蘋果酸運輸載體可以協(xié)助大麥抵抗鋁離子迫害。通過對轉基因植株的檢測,發(fā)現(xiàn)其中株大麥的基因表達量與耐鋁小麥基因的表達量相同。并且這株轉基因大麥在含有高濃度鋁離子的土壤中表現(xiàn)出很強的抗鋁脅迫能力,生長勢良好。同時,等還發(fā)現(xiàn)成功轉入基因的大麥植株吸收土壤中磷離子的能力顯著增強。等在小麥中發(fā)現(xiàn)了極為重要的兩個/轉錄因子和并采用農桿菌介導法將其分別轉入大麥,在干旱的實驗環(huán)境下,轉基因株系的生長狀況明顯要優(yōu)于對照株系。并且后續(xù)實驗顯示轉基因大麥中過量表達的和可以顯著提高植株的抗寒性。抗凍基因表達載體的構建及遺傳轉化研

24、究.大麥品質改良應用大麥的品質對啤酒釀造和動物飼料的生產至關重要,隨著飼料產業(yè)的快速發(fā)展及啤酒工業(yè)的需求增加,大麥品質改良已成為大麥育種的重要目標之一。其中利用轉基因技術從植物、細菌或動物細胞中分離具有重要價值、有益健康的目的基因轉移到大麥中去,以改善原有的品質特性,使農作物產品成為健康食品、功能食品和營養(yǎng)食品,因此它是改良品科,培育高產、優(yōu)質、高抗性農作物新類型和新品種的有效途徑。藍色黑鴨草 中的基因是硫氧還蛋白基因家族中的一員,其表達產物可增加淀粉酶和蛋白質酶的活力,還可以促進貯藏蛋白的水溶性和增強營養(yǎng)物質的分解等功能。劉雷等通過基因槍介導法將基因導入大麥幼胚,得到轉基因大麥植株,并對轉基

25、因植株代進行淀粉酶的活性檢測,得到的結果顯示在發(fā)芽天的大麥種子中,成功轉化的植株其淀粉酶活性相對于對照植株顯著提高。衛(wèi)麗禾用基因槍介導法成功將基因轉化到啤酒大麥品種中,在對轉基因后代酶活性的分析中發(fā)現(xiàn),發(fā)芽天的種子中【.淀粉酶和.淀粉酶的活性比對照高.%,并且外源基因還可以提高大麥中.氨基酸和可溶性氮的含量,改善糖化率等功能。鋅離子對作物的產量和營養(yǎng)價值至關重要,通過轉基因方法可以促進大麥對土壤中鋅離子的吸收。等在擬南芥中發(fā)現(xiàn)了鋅運輸載體基因并采用農桿菌介導法將其轉入大麥品種中,通過對后代轉基因大麥的生理檢測發(fā)現(xiàn),在基因過量表達的植株中,鋅元素攝取速度比對照顯著提高,并且大麥籽粒鋅含量也比對照

26、高。為促進單胃動物如家禽對營養(yǎng)物質的吸收,通常在飼料中加入一定比例的木聚糖酶和一葡聚糖酶以改善飼料的品質。由于品質改良相關基因的發(fā)現(xiàn),通過轉基因方法可將其轉入大麥的胚乳細胞并過量表達可以長期穩(wěn)定儲存的相關酶類,改善飼用大麥的品質。等采用農桿菌介導法將一種雜合的熱穩(wěn)定,.葡聚糖酶基因.轉入大麥 品種中,在后代的籽粒中,.葡聚糖酶以及,.,.葡聚糖酶的活性比非轉基因植株明顯增強,并且籽粒中酶蛋白活性因產物具有極高的酶催化活性。等采用農桿菌介導法將來源于真菌的木聚糖酶基轉入大麥,在代轉基因植株中木聚糖酶的表達量持續(xù)穩(wěn)定,其最高酶活性比非轉基因株系的酶活性高出倍,而且木聚糖酶在高溫條件下仍具有極高的酶

27、活性,在長期儲存后種子中木聚糖酶活性仍然穩(wěn)定。植物抗凍基因工程研究進展隨著耕地面積的減少,以及人口的快速增加,糧食作物的需求量越來越大,擴大種植面積和增加單產是解決糧食壓力的有效途徑。在我國的北方地區(qū),由于低溫造成的冷害和凍害會限制作物的增產并且顯著降低了作物的品質,在災情嚴重的地區(qū)往往會造成作物大規(guī)模的減產或絕收,而通過轉基因技術將外源抗凍基因轉入糧食作物可有效提高作物的抗凍性并擴大了作物的種植區(qū)域和面積,是作物抗凍新品種選育的有效途徑。隨著各種類型的抗凍基因不斷的被發(fā)掘和利用,促進了作物抗凍育種的發(fā)展。.抗凍基因的來源抗凍基因的來源廣泛,近年來的研究成果表明,許多與抗凍相關的基因普遍存在于

28、各種生物體內,如魚類、昆蟲、植物、微生物等?？箖龌蜃畛跏菑聂~類中發(fā)現(xiàn)的,魚類抗凍蛋白從結構上可分為多種類型謝秀杰,。比目魚中的基因等表達一種抗凍蛋白可以有效阻止生物體內冰晶的形成,年,人利用農桿菌介導法將其轉入番茄中,結果表明轉基因番茄抗凍能力得到增強,其組織提取液具有極強的冰晶抑制能力。在隨后的研究中,科研人員在一些昆蟲體內發(fā)現(xiàn)抗凍基因,而且與魚類和植物相比,昆蟲抗凍蛋白的活性高,從黃粉甲和云杉卷葉蛾等昆蟲中篩選和分離的抗凍基因其表達產物抗凍能力往往是魚類中相應基因的百倍以上趙干,。等在蚜蟲中發(fā)現(xiàn)了基因,將其與啟動子連接并采用農桿菌介導法轉化煙草中,在基因穩(wěn)定表達的后代轉基因植株中,組織液

29、的冰晶抑制能力顯著增強。目前在昆蟲中已經提取出多種抗凍基因。植物抗凍基因工程近年來發(fā)展迅速,目前已從菠菜、大麥等植物中發(fā)現(xiàn)多種抗凍基因李璐,。等在胡蘿卜中發(fā)現(xiàn)一個基因并構建了表達載體,抗凍基因表達載體的構建及遺傳轉化研究通過農桿菌介導法將其轉入煙草中,對轉基因后代進行凍害處理,發(fā)現(xiàn)其抗凍能力明顯高于非轉基因煙草。.抗凍基因的應用近年來,研究人員在多種生物體內發(fā)現(xiàn)了許多功能各不相同的抗凍基因,隨著轉基因技術的快速發(fā)展,這些基因得到了不同程度的利用,已成為作物抗凍育種的一種有效途徑,促進了農業(yè)的發(fā)展。.抗凍蛋白基因抗凍蛋白.,可以顯著提高生物體內組織液抑制冰晶形成的能力,提高其抗凍性?？箖龅鞍鬃钤?/p>

30、是在魚類中發(fā)現(xiàn)的,隨后在植物和昆蟲等生物體內也發(fā)現(xiàn)和分離了抗凍蛋白.,; .,并得到了其基因序列?？箖龅鞍子捎谄鋸姶蟮谋б种颇芰?一經發(fā)現(xiàn)就得到了科學家們的重視,而且大部分抗凍蛋白是由單基因控制,特別適合采用轉基因技術對其加以利用,目前,已有多種抗凍蛋白基因得到分離和克隆并將其應用于作物的抗凍育種中去。等將魚類基因整合構建到高效表達載體上,通過農桿菌介導法將其轉入花卉、煙草、油菜等,獲得了一定的抗凍能力。等人工合成了一段基因,與啟動子連接后轉入馬鈴薯中,對轉基因后代進行表型鑒定和基因表達水平鑒定,發(fā)現(xiàn)基因表達量越高的植株其抗凍害的能力越強。等發(fā)表了胡蘿及其基因,從而改變了長期以來人們只能應用

31、源于魚類的基因來從事植物的抗凍基因工程研究狀況,為植物抗凍基因工程研究開辟了新的道路。黃永芬等將源于昆蟲擬蝶中的抗凍蛋白基因采用花粉管通道法將其轉化番茄中,轉基因植株在低溫下的生長勢明顯優(yōu)于對照。.脯氨酸基因脯氨酸是植物蛋白質的組織成分之一,并可以游離的狀態(tài)分布于植物的組織液中,在干旱、鹽漬、低溫等環(huán)境脅迫下,植物體內會積累大量的,其可協(xié)助植物抵抗上述脅迫的壓力。親水能力極強,可穩(wěn)定原生質膠體及組織內的代謝華中農業(yè)大學屆碩士學位畢業(yè)論文過程,從而降低植物組織液的凝固點,防止植物細胞脫水,提高了植物的抗凍抗寒能力。等將轉基因的擬南芥放置于極低的溫度下,經過長時間的凍害處理,非轉基因的植株全部死亡

32、而轉基因的植株存活。年,基因整合到質粒,采用農桿菌將其轉化到落葉松,目的基等人將因穩(wěn)定表達的植株中的含量明顯增加,且轉基因植株的抗凍能力也隨之增強。.脂肪酸去飽和酶基因大量的研究成果表明,植物細胞膜在低溫處理下其通透性會發(fā)生變化,特別是當溫度在以下時,植物細胞膜液晶狀態(tài)逐漸變?yōu)槟z狀態(tài),細胞膜的生物活性降低,進而致使植物的新陳代謝紊亂,阻礙植物的正常生長。如果在植物細胞膜中添加不飽和脂肪酸的比例,可以促進低溫下植物細胞膜液晶狀態(tài)的穩(wěn)定,防止細胞膜固化,提高植物的抗凍性。近年來,脂肪酸去飽和酶相關基因不斷的被發(fā)現(xiàn)被予以利用,得到了具有積極意義的成果。年,等人在擬南芥葉綠體中發(fā)現(xiàn)并分離了一種脂肪酸

33、脫氫酶基因并將其導入煙草中,后代轉基因植株的抗凍性提高。.超氧化物歧化酶基因植物在低溫條件下,其細胞膜的穩(wěn)定性變差,細胞內活性氧的含量增加,導致細胞膜功能下降,結構破壞,影響植物的正常生長與發(fā)育。而超氧化物歧化酶簡稱可清除活性氧,維護膜系統(tǒng)穩(wěn)定性。超氧化物歧化酶是生物體內重要的抗氧化酶,分布及其廣泛,從人類到單細胞生物,他都普遍存在。可抵抗與阻斷因氧自由基對植物細胞的損害,并可修復受損細胞,而且還是生物抗氧化機制中重要核心酶。自從發(fā)現(xiàn)在植物中的抗凍作用以來,研究人員就致力于發(fā)現(xiàn)、分離、克隆基因并應用于作物抗凍育種中去,特別是對于一些冷敏感的作物,有著積極的意義。等與等分別在煙草與擬南芥中發(fā)現(xiàn)并

34、克隆了基因,并將其轉化到冷敏感植物中,得到的轉基因植株都具有明顯的抗凍性。大量的研究表明在轉入基因的植物中,轉化柱的抗凍能力都得到了提升,主要是由于基因的表達產物減少了活性氧對植株的損害。程焉平,抗凍基因表達載體的構建及遺傳轉化研究基因具有廣闊的應用前景。但目前超氧化物歧化酶基因轉化過程中還存在諸多問題,工作機制仍不明確,還需要進一步的研究。研究的目的意義大麥是啤酒釀造的主要原料,同時也是動物飼料的重要成分,隨著啤酒工業(yè)和飼料產業(yè)的迅速發(fā)展,大麥的需求量也極度擴大,但目前的大麥產量遠遠不能滿足社會需求,特別是在中國耕地面積逐漸減少的情況下,提高大麥的單產尤為重要。隨著人類對自然環(huán)境的破壞以及氣

35、候的異常變化,作物的生長環(huán)境也趨于惡劣,干旱、澇害、凍害、冷害等自然災害時常發(fā)生張國存等,。大麥凍害是一種常見的自然災害,在全球范圍內普遍發(fā)生,;,在我國北方地區(qū)常常會發(fā)生“倒春寒”現(xiàn)象,對大麥的生殖生長造成損害。本試驗通過對南極魚類的超氧化物歧化酶基因基因轉化大麥的研究增強大麥品種的抗凍性。華中農業(yè)大學屆碩士學位畢業(yè)論文第二章 大麥幼胚再生體系的建立材料和方法.材料試驗選用的大麥品種有美里黃金 ,以及本實驗、室育成的華大麥號、華大麥號共個基因型,種植于華中農業(yè)大學試驗田。.培養(yǎng)基?. .誘導培養(yǎng)基:無機./ /酸水解酪/ /麥芽糖. /蛋白.肌醇.脯氨酸. 。?. .繼代培養(yǎng)基:無機./ /

36、 /酸水解酪/蛋./肌醇.脯氨酸/ 麥芽糖. 。分化培養(yǎng)基:無機去掉其中 / ./. .。./ /肌醇.脯氨酸. /麥芽糖. /。.生根培養(yǎng)基:無機./酸水解酪蛋白./肌醇.脯氨酸朗麥芽糖. / 。所有培養(yǎng)基調至.,.高壓濕熱滅菌分鐘。脯氨酸、過濾除菌后加入已滅菌培養(yǎng)基。培養(yǎng)基不可重復加熱融化。大麥愈傷組織的誘導、繼代培養(yǎng)、分化及植株再生在個大麥品種開花后.時收集穗子,去麥芒及穎殼,用%乙醇消毒,.%升汞消毒,無菌水沖洗.次,期間要不停的搖晃三角瓶使大麥在消毒和沖洗時均勻充分。用鑷子和解剖刀將幼胚剝離,盾片朝上接種于誘導培養(yǎng)基上。放置在的條件下暗培養(yǎng)以誘導愈傷組織,形成的愈傷組織每隔轉移到新鮮

37、繼代培養(yǎng)基繼代一次。幼胚愈傷組織培養(yǎng)到合適的大小時,將其轉入分化培養(yǎng)基中進行綠苗分化,光照條件下培養(yǎng)。當分化出的小苗長至時,將其轉移到抗凍基因表達載體的構建及遺傳轉化研究生根壯苗培養(yǎng)基上。待生成新根,并長成一個完整的植株后葉心,敞開瓶口,加入少許水,煉苗,洗去根部的培養(yǎng)基,將苗移栽到營養(yǎng)缽中。結果統(tǒng)計及分析.統(tǒng)計方法出愈率%出愈的幼胚總數(shù)/接種的幼胚總數(shù)×%分化率%分化綠苗數(shù)/接種的愈傷總數(shù)×%發(fā)芽率%幼胚發(fā)芽數(shù)/接種的幼胚總數(shù)×.幼胚愈傷組織的誘導與再生大麥幼胚在誘導培養(yǎng)基中進行培養(yǎng),開始時所誘導的愈傷組織質地松散,水分較多,需要進一步培養(yǎng)成分化能力強的胚性愈傷

38、圖.,此過程需要周的時間,期間培養(yǎng)基需周更換一次。將長勢良好的胚性愈傷轉接到分化培養(yǎng)基上,兩周后,大部分愈傷組織形成綠芽圖.,再經過周左右的光照培養(yǎng),葉片長至至厘米時,便可轉移至生根培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)圖.。再生苗長至合適的大小時,經過馴化,便可移栽至營養(yǎng)土中培養(yǎng)并結實。華中農業(yè)大學屆碩士學位畢業(yè)論文.?:幼胚愈傷組織:分化出綠芽:生根的綠苗:再生植株: :.不同基因型對幼胚愈傷組織誘導及分化的影響實驗中研究了不同基因型對大麥幼胚愈傷組織誘導率的影響,由表.可知,所選大麥各個品種都表現(xiàn)出較高的愈傷組織誘導率和分化率,其中對照品種拘誘導率和分化率都最高,個試驗品種的愈傷組織誘導率都達至%以上。特別是

39、華大麥號、華大麥號均表現(xiàn)出極強的誘導率;在所選品種愈傷組織分化率方面,美里黃金和華大麥號達到以上%。華大麥號的分化率低于其他品種。個品種都具有極好的愈傷組織誘導率和分化率,是良好的大麥遺傳轉化受體?？箖龌虮磉_載體的構建及遺傳轉化研究表不同基因型愈傷組織誘導率及綠苗分化率品種平均出愈率% 平均分化率%. .美里黃金. .華大麥號. .華大麥號.對幼胚愈傷組織誘導的影響在愈傷組織誘導過程中,在培養(yǎng)基中添加可有效抑制幼胚直接發(fā)芽,促進愈傷組織的形成。本實驗通過在誘導培養(yǎng)基中添加不同濃度的,統(tǒng)計在各種濃度下幼胚的生長及分化情況,找出最合適的配比,并應用于大麥再生體系的建立。實驗中所采用的濃度為.,并

40、統(tǒng)計前兩周三個不同基因型的幼胚誘導率及發(fā)芽率,結果見表.。結果顯示,在未添加的誘導培養(yǎng)基中,幼胚極易發(fā)芽并嚴重影響了愈傷組織的誘導。隨著濃度的增加,抑制幼胚直接發(fā)芽的能力逐步增強,但是在高濃度的誘導培養(yǎng)基中,幼胚誘導的愈傷組織生長緩慢,誘導率有所下降。從得到的數(shù)據中發(fā)現(xiàn),./的濃度未顯著影響幼胚愈傷組織的誘導率及其生長速度,并有效抑制了幼胚直接發(fā)芽。表:誘導培養(yǎng)基中濃度對大麥幼胚愈傷組織誘導的影響:品種 濃度 接種數(shù) 出芽數(shù) 出芽率 出愈數(shù)出愈率朗 .% .%.% .%.% .%.% .% .% .%華大麥號.% .%.% .%. %.% .% .%華大麥號.% .%.% .%.% .%華中農

41、業(yè)大學屆碩二匕學位畢業(yè)論文第三章基因表達載體的構建與遺傳轉化實驗材料與方法.材料質粒:載體,?實驗室改造,命名為菌種:感受態(tài)大腸桿菌實驗室自備,根瘤農桿菌實驗室自備。植物品種:,美里黃金 ,華大麥號,華大麥號,種植于華中農業(yè)大學試驗田。限制性內切分子試劑:反應所用試劑、和酶、連接酶以及 均為公司生產。膠回收試劑盒、質粒提取試劑盒為天根公司生產。.實驗方法.基因表達載體的構建,在的基礎上改造,在過表達的基本載體是和 之間加入了終止區(qū)。和 之間加入了啟動子,圖載體圖譜. 抗凍基因表達載體的構建及遺傳轉化研究.基因表達載體構建策略首先,以載體上的目的基因為模板,用方法擴增出目的片段;回收后與 載體連

42、接后測序,并雙酶切連接有目的片段的載體,隨后將再次回收的目的片段和同樣酶切后回收的載體片段用連接酶連接;利用法制備新鮮的大腸桿菌感受態(tài),再用熱擊法將連接產物轉入大腸桿菌,提取質粒,經酶切驗證篩選得到含有目的基因的重組質粒,命名為;然后用電擊法將構建好的表達載體轉的農桿菌菌入農桿菌中;驗證,獲得帶有重組質粒株。.引物設計與反應條件試驗所用引物根據基因序列設計,正向引物端添加了酶切位點,反向引物端添加了 酶切位點。正向引物為: .:.反向引物為:反應體系:成分 加入量模板./ / “各/.酶/ .無菌雙蒸水補至總體積華中農業(yè)大學屆碩士學位畢業(yè)論文反應程序:.割膠回收目的片段片段的回收,使用天根割膠

43、回收試劑盒,具體方法如下柱平衡步驟:向吸附柱中吸附柱放入收集管中加入微升平衡液,.離心分鐘,倒掉收集管中的廢液,將吸附柱重新放入收集管中。將單一的目的片段條帶從瓊脂糖凝膠中切下盡量切除多余部分放入干凈的離心管中,稱取重量。向膠塊中加入倍體積的溶膠液。水浴放置分鐘,期間不斷溫和地上下翻轉離心管,以確保膠塊充分溶解。如果還有未溶的膠塊,可以補加一些溶膠液或繼續(xù)放置幾分鐘,直至膠塊完全溶解。將上一步所得溶液加入一個吸附柱中吸附柱放入收集管中,室溫放置分鐘,.離心至秒,倒掉收集管中的廢液,將吸附柱放入收集管中。向吸附柱中加入微升漂洗液,.離心至秒,倒掉收集管中的廢液,將吸附柱放入收集管中。向吸附柱中加

44、入微升漂洗液,.離心至秒,倒掉廢液。將吸附柱放回收集管中,.離心分鐘,盡量除去漂洗液。將吸附柱置于室溫數(shù)分鐘,晾干,防止殘留的漂洗液影響下一步的實驗。將吸附柱放到一個干凈的離心管中,向吸附膜中間位置懸空滴加適量的緩沖液,室溫放置分鐘,.離心分鐘收集溶液?？箖龌虮磉_載體的構建及遺傳轉化研究回收得到的片段可用瓊脂糖電泳和紫外分光光度計檢測濃度與純度。.載體的連接在微量離心管中加入下列溶液,全量為。 一 割膠回收產物雙蒸水“反應分鐘。.法制備大腸桿菌感受態(tài)細胞質粒繁殖的受體菌株采用.工程菌。接種單菌落.?于 液體培養(yǎng)基中,。條件下培養(yǎng)過夜;按:將過夜培養(yǎng)菌液接種于 液體培養(yǎng)基中,。條件下培養(yǎng)至&#

45、168;為.;將菌液分裝于.無菌離心管中,冰浴分鐘,。條件下離心分鐘收集細胞;菌體重懸浮于預冷的溶液中,。條件下離心分鐘收集菌體,棄上清液:注:溶液含有/ 的和體積為%的甘油,用調至.。菌體重懸浮于 預冷的溶液中,冰浴分鐘,溫度下離心分鐘收集菌體;每管菌體沉淀用.預冷的溶液重懸浮,立即凍存于一。注:該方法制備的感受態(tài)細胞比常規(guī)方法轉化效率提高.個數(shù)量級,可達轉化體/。.質粒向大腸桿菌的轉化事先將恒溫水浴鍋溫度調至。:華中農業(yè)大學屆碩士學位畢業(yè)論文將一管.感受態(tài)細胞握在手上使菌液迅速融化后插入冰上,冰浴.;加入質粒,輕輕震蕩混勻,冰置分鐘;輕輕搖勻后插入水浴中熱激.分鐘,迅速置于冰上冷卻.分鐘;

46、培養(yǎng)液不含,。搖床振蕩培養(yǎng)分加入.鐘;取菌液均勻涂布于含抗生素的平板上,。倒置培養(yǎng)小時:挑選白色菌落,確認載體中插入片段的長度大小。.測序保存菌種,寄出菌液,由安基生物公司提供測序服務。.質粒提取:的平柱平衡步驟:向吸附柱中吸附柱放入收集管中,倒掉收集管中的廢液,將吸附柱重新衡液, 離一放回收集管中。請使用當天處理過的柱子取.過夜培養(yǎng)的菌液加入離,管中, 離心,盡量吸除上清。向留有菌體沉淀的離一管中加入 溶液請先檢查是否已加入,使用移液器或渦旋振蕩器徹底懸浮細菌細胞沉淀。向離一管中加入.溶液,溫和地上下翻轉次使菌體充分裂解。注意:溫和地混合不要劇烈震蕩,以免污染基因組。此時菌液應變得清亮粘稠,

47、所用時間不應超過 ,以免質粒受到破壞。如果未變得清亮,可能由于菌體過多,裂解不徹底,應減少菌體量。向離管中加入此溶液,立即溫和地上下翻轉?次,充分混勻,此時會出現(xiàn)白色絮狀沉淀。 ,此時在離,管底部離,形成沉淀。將上一步收集的上清液分次加入過濾柱過濾柱放入收集管中,小心地將離,后收集管中得到的溶液分次加入離心抗凍基因表達載體的構建及遺傳轉化研究吸附柱中吸附柱放入收集管中,如果過濾柱中有殘余的液體說明步驟吸取的上清中雜質過多,可以延長離心的時間;如果離心后收集管底部有少量的沉淀.盡量地吸取上清。,倒掉收集管中的廢液,將吸附柱放離心入收集管中。,向吸附柱中加入去蛋白液,離心倒掉收集管中的廢液,將吸附

48、柱放入收集管中。向吸附柱中加入漂洗液請先檢查是否已加入無水乙醇,倒掉收集管中的廢液,將吸附柱放入收集離心管中。注意:加入漂洗液后,如果室溫靜置. ,有助于更好地去除雜質。,向吸附柱中加入漂洗液,離心倒掉收集管中的廢液。,將吸附柱重新放回收集管中置于離心目的是將吸附柱中殘余的漂洗液去除。將吸附柱自科置于一個干凈的離心管中,向吸附膜的中間部位懸空滴加將.洗脫緩沖液,室溫放置 ,離心質粒溶液收集到離心管中。得到的質?？捎铆傊悄z電泳和紫外分光光度計檢測濃度與純度。電泳可能為單一條帶,也可能為到條條帶,這主要與提取物培養(yǎng)時間長短、提取時操作劇烈程度等有關。.質粒酶切與連接將提取的 質粒和含有目的片段

49、的質粒分別用和進行雙酶切,均采用如下體系:成分 體積 ×質粒雙蒸水華中農業(yè)大學屆碩士學位畢業(yè)論文。反應過夜,瓊脂糖凝膠電泳檢測并回收條帶?；厥辗椒ㄒ?的片段連接采用目的基因片段和載體采用體系,方法如下:在微量離心管中加入下列連接反應液。× 片段載體肛肛反應過夜,直接用于大腸桿菌感受態(tài)的轉化。轉化方法見.。由于的瓊脂平板載體是卡那霉素抗性,因此,最后菌液涂于含有/培養(yǎng)基上,倒置培養(yǎng)。.載體的構建通過對.中平板單克隆的搖菌和菌液鑒定,以及提取質粒進行和 雙酶切鑒定,確定得到含有目的片段的質粒,保存質。粒,命名為.農桿菌介導的大麥遺傳轉化大麥遺傳轉化的方法主要來自于等倉建和等以及等修改的方法。.大麥組織培養(yǎng)過程中的培養(yǎng)基制備/雙丙胺膦.電轉化農桿菌感受態(tài)細胞的制備的平板上劃線培養(yǎng),。,;農桿菌在含有/抗凍基因表達載體的構建及遺傳轉化研究挑單菌落接種于含有/ 的液體培養(yǎng)基中,。,震蕩培養(yǎng)過夜;將菌液轉移至含有/ 的液體培養(yǎng)基中,。,震蕩培養(yǎng)至.左右;將菌液分裝于離心管中,冰上處理分鐘,。,離心,棄上清。用預冷的無菌水重懸,。,離心,棄上清并重復清洗.次;棄去上清,用預冷的%甘油重懸,用槍頭吸打均勻之后,以的規(guī)格分裝于滅菌.離心管,并放入.保存。.質粒轉化農桿菌在冰上解凍電感受態(tài)細胞,添加.質粒,用槍吸動混勻;將細胞混合物轉移至冷卻后的電轉化池中;液體培養(yǎng)基,