PCR技術(shù)及其醫(yī)學(xué)應(yīng)用精

1、PCR技術(shù)及其醫(yī)學(xué)應(yīng)用 Polymerase chain reaction The polymerase chain reaction (PCR)：to amplify a sequence of DNA using a pair of primers each complementary to one end of the the DNA target sequence.1985年，美國(guó)Cetus 公司和加利福尼亞大學(xué)聯(lián)合創(chuàng)建了一種核酸體外擴(kuò)增技術(shù)。 第一節(jié) PCR原理與特點(diǎn)一、PCR基本原理 PCR是一種選擇性擴(kuò)增DNA或RNA的方法， 其基本原理是依據(jù)體內(nèi)細(xì)胞分裂中的DNA半保留復(fù)制機(jī)理

2、，以及在體外DNA分子于不同溫度下雙鏈和單鏈可以互相轉(zhuǎn)變的性質(zhì)，人為地控制體外合成系統(tǒng)的溫度，以促使雙鏈DNA變成單鏈；單鏈DNA與人工合成的引物退火，以及在dNTP存在下，耐高溫的DNA聚合酶使引物沿單鏈模板延伸成為雙鏈DNA。高溫變性，低溫退火，適溫延伸等步反應(yīng)循環(huán)進(jìn)行，使目的DNA得以迅速擴(kuò)增。 Denaturation （變性）: The target DNA (template) is separated into two stands by heating to 95 Primer annealing （引物退火）: The temperature is reduced to ar

3、ound 55 to allow the primers to anneal. Polymerization (elongation, extension): The temperature is increased to 72 for optimal polymerization step which uses up dNTPs and required Mg+How PCR works PCR proceeds by sequential cycles of: 1.DNA denaturationThe sample DNA is denatured with heat to form s

4、ingle stranded DNA. 與體內(nèi)DNA解鏈過(guò)程不同，PCR中作為模板的雙鏈DNA是通過(guò)95 左右的高溫使其產(chǎn)生變性，形成單鏈DNA而游離于反應(yīng)溶液中。2 . 單 鏈 D N A 模 板 與 引 物 退 火(annealing) The primers are annealed to the single stranded DNA by cooling the sample. 通常需要兩個(gè)寡核苷酸作DNA合成的引物(primer)，這兩個(gè)引物分別與待擴(kuò)增順序兩側(cè)的模板DNA互補(bǔ)，在降低溫度的過(guò)程中，通過(guò)控制退火條件， 引物就能準(zhǔn)確地配對(duì)在擴(kuò)增區(qū)域的兩側(cè)。Primers 引物PCR

5、primers：about 18 to 30 nt long and with similar G+C contents. Tm=2(a+t)+4(g+c): determine annealing temperature. If the primer is 18-30 nt, annealing temperature can be Tm5oC3.引物的延伸(extension)The primers are extended in the presence o f D N A p o l y m e r a s e a n d deoxyribonucleoside triphosphat

6、es, and complementary copies of the target DNA is produced PCR在PCR反應(yīng)體系中的DNA聚合酶，能夠催化反應(yīng)體系中游離的單核苷酸(dNTP)按引物5-3方向，按堿基配對(duì)的原則延伸，形成兩條與模板DNA互補(bǔ)的半保留復(fù)制鏈，新合成的鏈又作為下輪循環(huán)反應(yīng)的模板。Enzymes for PCRThe most common is Taq polymerase from Thermus aquaticus. It has no 3 to 5 proofreading exonuclease activity. Accuracy is low,

7、 not good for cloning. The cycle is then repeated 以上“變性、退火、延伸”三步曲，被確定為PCR的一輪循環(huán)，整個(gè)PCR過(guò)程一般只需30個(gè)循環(huán). This process will amplify the original DNA exponentially so that about 1 million copies of the original sequence are present after 20 cycles (220), and 1 billion are present after 30 cycles (230). PCR的擴(kuò)增

8、倍數(shù)為(1+x)n，x為擴(kuò)增效率，平均為75，n 為PCR的循環(huán)次數(shù)。 盡管PCR擴(kuò)增DNA非常有效，但目的DNA 順序的指數(shù)擴(kuò)增并不是一個(gè)無(wú)限制的過(guò)程。通常在正常的反應(yīng)條件下，經(jīng)30次循環(huán)之后，酶的催化反應(yīng)趨于飽和，就會(huì)出現(xiàn)“平臺(tái)效應(yīng)”，產(chǎn)物的量不再增加?！捌脚_(tái)效應(yīng)”出現(xiàn)的遲早還取決于酶的性能，模板DNA的拷貝數(shù)，底物dNTP濃度及多種因素。 二、PCR技術(shù)的特點(diǎn) 1.高度的敏感性 單拷貝基因經(jīng)25次循環(huán)后，其基因拷貝數(shù)也在一百萬(wàn)倍以上，即可將極微量(pg級(jí))DNA，擴(kuò)增到紫外光下可見的水平(gg級(jí))。 它可對(duì)單拷貝基因、單個(gè)細(xì)胞、單根頭發(fā)、一滴血等微量標(biāo)本進(jìn)行分析。2.高度的特異性 PCR

9、擴(kuò)增的特異性依賴于兩個(gè)引物設(shè)計(jì)的特異性， 依賴于引物與模板結(jié)合的正確性。PCR反應(yīng)時(shí)退火的溫度對(duì)特異性也有影響. 在PCR實(shí)驗(yàn)中，只要引物設(shè)計(jì)合理，反應(yīng)溫度適宜，采用高溫啟動(dòng)法PCR 擴(kuò)增的特異性是相當(dāng)高的。 3.操作簡(jiǎn)便、快速 4.適用樣品的廣泛性 既可是DNA，也可是RNA；既可是純化的，又可是粗制的；既可是新鮮組織，也可是陳舊樣品；既可是細(xì)胞(刮片細(xì)胞、培養(yǎng)細(xì)胞、血細(xì)胞），又可是體液（大小便、血清、淋巴液等）；既可是完整的大分子，也可是部分降解的DNA。第二節(jié) PCR系統(tǒng)的組成及PCR最適條件 PCR系統(tǒng)是由耐熱DNA聚合酶、引物、脫氧核苷酸、待擴(kuò)增的DNA(RNA)和緩沖液組成。一、耐

10、熱DNA聚合酶 耐熱DNA聚合酶引入PCR后，使其操作大大簡(jiǎn)化。TaqDNA聚合酶的特性： 以DNA為模板，從結(jié)合在特定DNA模板上的引物為出發(fā)點(diǎn)， 將種脫氧核苷酸以堿基配對(duì)方式，按引物5-3的方向，合成新的DNA鏈；有逆轉(zhuǎn)錄活性， 而無(wú)Klenow 酶所具有的3-5外切酶活性；可在新合成雙鏈產(chǎn)物的末端加上一個(gè)非模板依賴的堿基， 且優(yōu)先聚合A，利用這種特性可以構(gòu)建dT-載體來(lái)克隆帶dA尾的PCR產(chǎn)物。 因TaqDNA酶沒有3-5外切酶活性，故無(wú)校正功能，錯(cuò)誤頻率為0.25，即在25輪循環(huán)后，其擴(kuò)增產(chǎn)物的順序中400個(gè)堿基可能出現(xiàn)一個(gè)篡改（錯(cuò)誤摻入）堿基。二、寡核苷酸引物P C R r e q

11、u i r e s t h e s y n t h e s i s o f oligonucleotide primers complementary to the target DNA. The entire sequence of the target DNA does not need to be known, only the flanking regions. 就整個(gè)PCR擴(kuò)增技術(shù)而言，引物的設(shè)計(jì)占有十分重要的地位， 它的優(yōu)劣直接關(guān)系到PCR的特異性與成功與否。 引物的設(shè)計(jì)原則：引物長(zhǎng)度在1530堿基。引物過(guò)短，會(huì)使特異性降低。引物中堿基的分布是隨機(jī)的，避免個(gè)以上的嘌呤或嘧啶的連續(xù)排

12、列，G+C含量宜在4550左右 避免兩引物間的互補(bǔ)，特別是3端互補(bǔ)，以免形成二聚體。 引物自身不應(yīng)存在連續(xù)超過(guò)3bp的互補(bǔ)序列， 否則引物自身會(huì)折疊成發(fā)夾結(jié)構(gòu)或引物本身變性。 引物的3端不能有任何修飾，也不能有形成任何二級(jí)結(jié)構(gòu)的可能。引物的5端限定著PCR產(chǎn)物的長(zhǎng)度，可根據(jù)產(chǎn)物的要求不同， 可以選用不同的引物修飾法。引物與非擴(kuò)增序列的同源性不應(yīng)超過(guò)70。如擴(kuò)增編碼區(qū)域，引物3端不要終止于密碼子的第位。 目前，國(guó)內(nèi)外已有許多專門用于引物設(shè)計(jì)的計(jì)算機(jī)程序，簡(jiǎn)化了引物的設(shè)計(jì)過(guò)程。三、三磷酸脫氧核苷酸(dNTP) dNTP是dATP、dCTP、dGTP和dTTP的總稱。在PCR循環(huán)中，高濃度的dNTP

13、可加快反應(yīng)速度， 但增加了堿基的錯(cuò)誤摻入率和實(shí)驗(yàn)成本；反之，低濃度的dNTP會(huì)導(dǎo)致反應(yīng)速度下降，但可提高實(shí)驗(yàn)的精確性。 四、PCR反應(yīng)緩沖液 用于PCR反應(yīng)的緩沖液一般都有Tris-clPH8.3-8.8) Kcl、NH42SO4, Mgcl2，明膠和甲酰胺。 其中以Mg2+最為關(guān)鍵，它是TaqDNA 聚合酶所必需的，Mg2+濃度可影響酶活性與精確度， 以及產(chǎn)物的特異性等。Mg2+濃度過(guò)低時(shí)，酶活力顯著降低；過(guò)高時(shí)則酶催化非特異性擴(kuò)增。五、模板DNA PCR可以以DNA或RNA為模板進(jìn)行核酸的體外擴(kuò)增. 核酸標(biāo)本來(lái)源廣泛. 注意核酸標(biāo)本中不要含DNA聚合酶抑制劑。 六、PCR循環(huán)數(shù)其它參數(shù)選定

14、后，PCR循環(huán)次數(shù)主要取決于模板DNA的濃度。理論上說(shuō)25次循環(huán)后，PCR產(chǎn)物的積累即達(dá)最大值。實(shí)際操作中由于每步反應(yīng)不可能達(dá)100效率，一般按75計(jì)算，30次是比較合理的循環(huán)次數(shù)。七、易發(fā)生的問(wèn)題及解決方法(1)沒有得到所希望的PCR產(chǎn)物（假陰性）：是否加入了TaqDNA酶，及酶活性如何。DNA解鏈?zhǔn)欠癯浞?。要注意是否達(dá)到了解鏈溫度（解鏈不完全往往是失敗的重要原因）；樣品中可能有酶抑制劑，用95加熱10分鐘將其失活；使用多組合引物，作雙PCR。(2)所有樣品均為陽(yáng)性（假陽(yáng)性）：設(shè)立陰性對(duì)照，空白對(duì)照；樣品收集、處理時(shí)避免操作污染；避免陽(yáng)性對(duì)照樣品對(duì)檢測(cè)樣品的污染。(3)PCR產(chǎn)物呈片狀：減少

15、聚合酶濃度；增加退火溫度；減少循環(huán)周期。(4)出現(xiàn)非特異性擴(kuò)增 基因組DNA作為模板時(shí)，由于其數(shù)量的龐大及結(jié)構(gòu)復(fù)雜，除了特異擴(kuò)增外，往往很容易產(chǎn)生非特異擴(kuò)增產(chǎn)物。增加退火溫度，減少退火時(shí)間及延伸時(shí)間；降低引物及TaqDNA酶濃度；改變Mg2+的濃度。第三節(jié) PCR技術(shù)的發(fā)展 隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，PCR技術(shù)本身也在不斷地完善和發(fā)展。目前PCR及其衍生技術(shù)已應(yīng)用于外源基因的分離、基因重組、DNA測(cè)序、構(gòu)建克隆與表達(dá)載體、 定點(diǎn)突變、檢測(cè)某基因多態(tài)性、轉(zhuǎn)座子插入位點(diǎn)繪圖、檢測(cè)基因修飾等。 一、PCR克隆技術(shù) PCR克隆技術(shù)有：粘端克隆法、鈍端克隆法、無(wú)連接酶的亞克隆法等。P C R 產(chǎn) 物 粘 端

16、 可 用 多 種 方 法 產(chǎn) 生 ： 引 物 5 端 附 加 堿 基 修 飾 法 ； 利 用TaqDNA 聚合酶的類似TdT酶活性產(chǎn)生粘端；T4 DNA聚合酶在限制核苷酸的條件下使產(chǎn)物產(chǎn)生粘端。 二、定量PCR 隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，特異核酸的定量在生物學(xué)中與臨床上的重要性日趨增加，有關(guān)基因的定量工作大部分是對(duì)mRNA定量。一個(gè)理想的定量PCR實(shí)驗(yàn)應(yīng)設(shè)立內(nèi)參照， 使內(nèi)參照與待研究基因在同一反應(yīng)管中進(jìn)行。內(nèi)參照可以是有限制位點(diǎn)的突變靶序列，也可以是與靶序列不相關(guān)的“報(bào)告者”(reporter) RNA。 三、PCR與突變的分子水平分析已知突變的檢測(cè)和未知突變的篩選方法較多，有：ASO法、AS-P

17、CR法、單鏈構(gòu)象多態(tài)性PCR、 引物競(jìng)爭(zhēng)PCR法等。單鏈構(gòu)象多態(tài)性(single-strand conformation polymorphisms, SSCP)是根據(jù)大小極相近的單鏈核酸分子在非變性條件下，電泳遷移率與其序列有關(guān)。八、逆轉(zhuǎn)錄PCR(RT-PCR) 逆轉(zhuǎn)錄PCR(RT-PCR)又稱RNA-PCR。PCR不僅可以檢測(cè)DNA，也能對(duì)RNA 進(jìn)行分析和研究。反應(yīng)的第一步是提取總RNA，加入一個(gè)與mRNA3端互補(bǔ)的引物， 在逆轉(zhuǎn)錄酶作用下合成cDNA；第二步是以cDNA為模板，再加入與cDNA互補(bǔ)的另一引物（兩引物應(yīng)位于不同的外顯子上，以避免基因組DNA污染）進(jìn)行PCR擴(kuò)增。 RT-P

18、CR 可使所需模板mRNA 量大大減少， 因此對(duì)于低豐度mRNA 的cDNA克隆及cDNA文庫(kù)的構(gòu)建非常有利。 第四節(jié) PCR技術(shù)在醫(yī)學(xué)上的應(yīng)用 人類疾病的發(fā)生，常涉及到內(nèi)源基因的改變和外源基因的侵入。前者可引起各種遺傳性疾病或腫瘤；后者如細(xì)菌、病毒、寄生蟲等感染機(jī)體，把它們的基因也帶入人體。不論其致病是否由基因所致，也不管其基因是否整合到人體基因組中，只要病原體存在，機(jī)體就會(huì)有其核酸存在，因此PCR及其相關(guān)技術(shù)的發(fā)展為臨床診斷提供了行之有效的方法。一、感染性疾病病原體的診斷和研究 1.對(duì)形態(tài)和生化反應(yīng)不典型的微生物病原體的鑒定 2.解決混合標(biāo)本問(wèn)題 3.生長(zhǎng)緩慢或難于培養(yǎng)的病原體鑒定 4.難

19、以鑒定的病原體診斷 5.鑒定新病毒二、遺傳病相關(guān)基因的檢測(cè)三、惡性腫瘤的診斷和研究四、法醫(yī)學(xué)研究五、在骨髓移植配型中的作用How PCR works PCR proceeds by sequential cycles of: 1.DNA denaturationThe sample DNA is denatured with heat to form single stranded DNA. 與體內(nèi)DNA解鏈過(guò)程不同，PCR中作為模板的雙鏈DNA是通過(guò)95 左右的高溫使其產(chǎn)生變性，形成單鏈DNA而游離于反應(yīng)溶液中。3.引物的延伸(extension)The primers are extended in the presence o f D N A p o l y m e r a s e a n d deoxyribonucleoside triphosphates, and complementary copies of the target DNA is produced PCR在PCR反應(yīng)體系中的DNA聚合酶，能夠催化反應(yīng)體系中游離的單核苷酸(dNTP)按引物5-3方向，按堿基配對(duì)的原則延伸，形成兩條與模板DNA互補(bǔ)的半保留復(fù)制鏈，新合成的鏈又作為下輪循環(huán)反應(yīng)的模板。 The cy