畢赤酵母常用培養(yǎng)基與載體

1、畢赤酵母常用培養(yǎng)基與載體一、畢赤酵母表達常用載體:典型的巴斯德畢赤酵母表達載體載體包含醇氧化酶-1 （AOX1）基因的啟動子和轉錄終止子（5AOX1 和 3AOX1 ），它們被多克隆位點（MCS）分開，外源基 因可以在此插入。此載體還包含組氨醇脫氫酶基因（HIS4 ）選擇標記及 3AOX1 區(qū)。當整合型載體轉化受體時，它的 5AOX1 和 3AOX1 能與染色體上的同源基 因重組，從而使整個載體連同外源基因插入到受體染色體上，外源基因在 5AOX1 啟動子控制下表達。畢赤酵母本身不分泌內源蛋白，而外源蛋白的分泌需要具有 引導分泌的信號序列。而由 89個氨基酸組成的釀灑酵母的分泌信號 一 a交配

2、因 子（factor）引導序列已經(jīng)成功地引導了幾種外源蛋白的分泌。 分泌表達載體主要有:pPIC9 , pPIC9K ,pHIL-S1 , pPICZaA, pYAM75P等。胞內表達載體主要 有：pHIL-D2 ,pA0815 ,pPIC3K ,pPICZ , pHWO10 , pGAPZ , pGAPZa（Invitrogen） , pPIC3.5K 等。工程菌株 Y11430 ,MG1003 , GS115（AOX1 ）, KM71 , SMD1168。畢赤酵母宿主菌常用的有 GS115 和 KM71 兩種， 都具有 HIS4 營養(yǎng)缺陷標記。其中，GS115 茵株具有 AOX1 基因，是

3、 Mut+,即 甲醇利用正常型；而 KM71 菌株的 AOX1 位點彼 ARG4 基因插入，表型為 Muts , 即甲醇利用緩慢型，兩種菌株都適用于一般的酵母轉化方法。 多拷貝表達菌株的 獲得方式： 與自主復制的質粒型表達載體不同，整合型表達載體的拷貝數(shù)可以 有很大的變化。含多拷貝外源基因的表達菌株合成蛋白的量也較多。體內整合可通過高遺傳霉素抗性，篩選可能的多拷貝插入；而體外整合可通過連接產(chǎn)生外源 基因的申聯(lián)插入。多拷貝表達菌株的獲得方式有兩種：一種是利用SDS-PAGE電泳、免疫雜交或菌落點雜交方法在大量的轉化子中進行自然篩選。得到產(chǎn)量高的表達菌株。另一種在轉化前將多個表達盒拷貝插入到單個載

4、體中，而后再通過 交換整合到受體染色體上。表達蛋白純化方法：酵母系統(tǒng)表達的蛋白一般都具有活性，所以都采用較溫和的純化方式來純化目的蛋白， 分泌型表達的蛋白有利 于純化，可用硫酸鉉沉淀，然后用離子交換，凝膠過濾層析，疏水層析等方法進 一步純化。具體的方法和操作應按所處理的目的蛋白的性質選擇。二.畢赤酵母表達的培養(yǎng)基配制和用途2.1LB (Luria Bertani )培養(yǎng)基：Trypton l %Yeast Extract 0.5%NaCl lPH 7.0制作平板時加入 2 %瓊脂粉。121 C 高壓滅菌 20min?？捎谑覝乇４?。用于培養(yǎng) pPICZ a A 原核宿主菌 TOP10F時可加入

5、Zeocin 25ug / ml 。2.2LLB (Low Salt LB )培養(yǎng)基：Trypton l %Yeast Extract 0.5PH 7.0制作平板時加入 2 %瓊脂粉。121 C 高壓滅菌 20min?？捎谑覝乇４鏀?shù)月。用于培養(yǎng) pPICZ a A 原核宿主菌 TOP10F時，加入 Zeocin 25ug / ml ，可以 4C條件下保存 12 周.2.3YPD （乂稱 YEPD）Yeast Extract Peptone Dextrose Medium , （Yeast Extract Peptone Dextrose Medium ,酵母浸出粉/胰蛋白月東/右旋葡萄糖培養(yǎng)基

6、）Trypton2%dextrose (glucose)2%+agar2%+Zeocin100jjg/ml液體 YPD培養(yǎng)基可常溫保存，是畢赤酵母的最基本培養(yǎng)基，瓊脂YPD平板在 4C可保存幾個月。加入 Zeocin 100ug / ml ，成為 YPDZ 培養(yǎng)基，可以 4C條件下保存 12周。2.4BMGY 培養(yǎng)基Yeast extract1%Peptone2%磷酸鉀緩沖液（ pH6.0 ) 100mmol/LYNB1.34%Biotin(4X10 -5 ) %Glycerol1%畢赤酵母誘導表達前培養(yǎng)基，YNB 和 Biotin 過濾除菌。培養(yǎng) 24 小時后，一 般靜置過夜，待酵母沉淀后倒

7、掉 BMGY 培養(yǎng)基，改換 BMMY 培養(yǎng)基，進入誘導表 達階段。2.5BMMY 培養(yǎng)基Yeast extract1%Peptone2%磷酸鉀緩沖液（pH6.0 ） 100mmol/LYNB1.34%Biotin（4X10 -5 ） %NaCl0.5methanol3%畢赤酵母誘導表達培養(yǎng)基，YNB 和 Biotion 過濾除菌。搖瓶培養(yǎng)時每 24 小時 之后加入 3%的甲醇誘導，一般誘導 72 小時。2.6YPDS + Zeocin 培養(yǎng)基(Yeast Extract Peptone Dextrose Mediumyeast extract1%peptone2%dextrose （gluco

8、se） 2% sorbitol 1 M+agar2%+ Zeocin100 g/ml不管是液體 YPDS養(yǎng)基，還是 YPDS + Zeocin 培養(yǎng)基，都必須存放 4 C條件下，有效 期 12 周。2.7MGYMinimal Glycerol Medjum（最小甘油培養(yǎng)基）（34%YNB 1 知油；4*10-5旅物素）。將 800ml 滅菌水、100ml 的 10*YNB母液、2ml 的500*B母液和 100ml 的 10*GY母液混勻即可，4C保存，保存期為 2 個月。2.8MGYHMinimal Glycerol Medium + Histidine（最小甘油培養(yǎng)基 + 0.004% 組

9、氨酸）在 1000ml 的 MG 藉養(yǎng)基中加入 10ml 的 100*H母液混勻，4C保存，保存期為 2 個月。2.9RDRegeneration Dextrose Medium（葡萄糖再生培養(yǎng)基）（含有：1mol/L的山梨醇；2 咐萄糖；1.34%YNB 4*10-5旅物素；0.005%氨基酸）1.將 186g的山梨醇定容至 700ml，高壓滅菌；2.冷卻后于 45 C水??；3.將 100ml 的 10*D、100ml 的 10*YNB; 2ml 的 500*B; 10ml 的 100*AA 等母液和 88ml 無菌 水混勻，預熱至 45C后，與步驟 2的山梨醇溶液混合。4C保存。2.10R

10、DHRegeneration Dextrose Medium + Histidine（葡萄糖再生培養(yǎng)基 + 0.004% 組氨酸）在 RD培養(yǎng)基配制的第三步中，在加入 10ml 的 100*H母液，同時無菌水的體積減少至 78ml 即可，其余配制方法與 RD 相同。4C保存。2.11RD及 RDH平板的制備1.將 186g的山梨醇和 1520g瓊脂粉定容至700ml，高壓滅菌；冷卻后于60C水浴:2.參照 RD/RDH 夜體培養(yǎng)基配制的步驟 4， 將 100ml 的 10*D、 100ml 的 10*YNB; 2ml 的 500*B ; 10ml的 100*AA等母液、（10ml 的 100*

11、H母液）和 88 （78） ml 無菌水混勻，預熱至 45 C 后，與步驟 1的山梨醇/瓊脂液混勻；3.迅速制備平板。4C可保存數(shù)月。2.12RD及 RDH的 TOP瓊脂的制備（常用丁酵母菌的包被）1.將 186g的山梨醇和 7.510g 瓊脂粉定容至 700ml，高壓滅菌；冷卻后于 60C水浴；2.參照 RD/RDH 夜體培養(yǎng)基配制的步驟 4,將 100ml 的 10*D、100ml 的 10*YNB; 2ml 的 500*B ; 10ml的 100*AA等母液、（10ml 的 100*H母液）和 88 （78） ml 無菌水混勻，預熱至 45C 后，與步驟 1 的山梨醇/瓊脂液混勻；3.將

12、該 TOF脂置于 45 C水浴冷卻、保溫，備用。2.13MD 與 MDHMinimal Dextrose Medium +（ Histidine ）最小葡萄糖培養(yǎng)基 + （ 0.004 % 組氨酸）（含有：1.34%YNB； 4*10-5%生物素；2 淘萄糖）1.100ml 的 10*YNB; 2ml 的 500*B 和 100ml10*D 母液，用 800ml 的無菌水定容至 1000ml 即可；2.如配制 MDH 可在上述的 MD中加入 10ml 的 100*H 即可；3.如配制平板，可無囹水的滅囹前，加入1520g的瓊脂。4C可保存數(shù)月。2.14 SOC土口.Tryptonl%Yeast

13、 Extract0.5%NaCl0.05%Glucose （1mol / L） 2%121 C高壓滅菌 20min，冷卻后，4C保存。母液的配置注：10*YNB（含有硫酸鉉、無氨基酸的13.4%酵母基礎氮源培養(yǎng)基）4 C 保存。34g酵母基礎氮源培養(yǎng)基（無硫酸鉉）+100g硫酸鉉，溶于 1000ml 水中，過濾除菌。500*B（0.02%塵物素 Biotin ） 4 C 保存保存期為 1年。20mg的生物素溶于 100ml 水中，過濾除菌。100*H（0.4%Histidine 組氨酸）4 C 保存 保存期為 1 年。400mg 的 L-組氨酸溶于100ml 水中，（加熱至 50C 以促進溶解），過濾除菌。10*D（20%Dextrose葡萄糖）保存期為 1年。200g葡萄糖溶于 1000ml 水中，滅菌 15min或過濾除菌。10*M（5%Methanol甲醇）保存期為 2個月。將 5ml 的甲醇與 95ml 水混勻，過濾除菌。10*GY（10%Glycerol 甘油） 保存期為 1年以上。將 100ml 甘油和 900ml 水混勻后，高壓滅菌或過濾除菌。100*AA(0.5% of each Amino