川西獐牙菜體細胞雜交及其環(huán)烯醚萜類化合物合成相關(guān)基因香葉醇

1、川西獐牙菜體細胞雜交及其環(huán)烯醚萜類化合物合成相關(guān)基因香葉醇 -10 羥化酶的克隆和功能驗證中藥材有效成分的絕大多數(shù)都來源于次生代謝產(chǎn)物 , 利用細胞工程 ( 體細胞 雜交) 及次生代謝的基因工程 , 來改良中藥材品質(zhì)的研究具有重要意義。 體細胞雜 交可轉(zhuǎn)移并提高藥效成分含量 , 實現(xiàn)藥用成分合成基因在不同科、屬、種間的相 互轉(zhuǎn)移, 獲得含有高含量異源藥效成分的體細胞雜種。目前有關(guān)中藥材體細胞雜交研究已有一些成功的例證 , 其中狹葉柴胡與川西 獐牙菜體細胞雜交已獲得雜種植株 (向鳳寧等 ,2003), 但是雜種中異源染色體 /DNA的存在方式、異源有效成分合成相關(guān)基因表達與異源有效成分積累的相關(guān)

2、 性尚未進行深入分析。 次生代謝產(chǎn)物關(guān)鍵酶基因的克隆及轉(zhuǎn)化是植物次生代謝工 程的研究熱點。通過超量表達相關(guān)限速酶基因 , 來提高目標代謝物產(chǎn)量是植物代謝工程的主 要策略之一。目前在基因水平上萜類合成途徑研究較為清楚 , 單萜類代謝途徑中 的一些基因已被克隆 , 但有關(guān)中藥材有效成分合成相關(guān)基因的發(fā)掘才剛剛開始。高寒藏藥材川西獐牙菜 (Swertia mussotii Franch) 專治黃膽性肝炎及 病毒性肝炎 , 野生資源匱乏。其主要有效成分為芒果苷、 獐牙菜苦苷和龍膽苦苷。獐牙菜苦苷 (swertiamarin) 和龍膽苦苷 (gentiopicroside) 屬于環(huán)烯醚萜類 (irido

3、id) 化合物, 它們的生物合成途徑尚未完全已知。 , 香葉醇 (geraniol) 是環(huán) 烯醚萜類化合物 (iridoid) 生物合成途徑的重要組分 , 它的氧化被認為是烯醚萜 類化合物合成途徑中第一個限速步驟 , 此反應(yīng)由香葉醇 -10 羥化酶 (geraniol 10-hydroxylase, G10H) 催化香葉醇而生成 10 羥基- 香葉醇(10-hydroxygeraniol)本論文開展了狹葉柴胡與川西獐牙菜體細胞雜交研究 , 獲得了體細胞雜種再生植株；分析了不同雜種中的藥效成分含量；比較了川西獐牙菜（ 供體） 染色體、核基因組DNA及 SmG10基因在不同雜種細胞系中的差異；初步

4、確定了雜種中供 體核基因組組成及SmG10基因表達模式與異源藥效成分含量的關(guān)系。探討了 UV劑量對雜種生長、染色體消減和片段化的影響。通過狹葉柴胡與川西獐牙菜體細胞雜種及雙親細胞色素 P450（cytochrome P450）基因片段序列分析，發(fā)現(xiàn)了雜種中存在一個與川西獐牙菜香葉醇-10羥化 酶（G10H）基因同源的片段。在此基礎(chǔ)上，首次分離了川西獐牙菜的香葉醇-10羥 化酶的全長新基因（SmGI0H）;分析了在誘導(dǎo)子茉莉酸甲酯（MeJA）處理下,環(huán)烯醚 萜類化合物代謝途徑中相關(guān)酶基因表達水平的差異及其與藥效成分積累的關(guān)系。完成了 SmG10在原核大腸桿菌、真核酵母中的功能驗證及酶活力測定；實

5、 現(xiàn)了 SmG10對川西獐牙菜胚性愈傷組織的轉(zhuǎn)化,獲得了獐牙菜苦苷和龍膽苦苷 含量高的轉(zhuǎn)基因植株 , 為進一步研究轉(zhuǎn)基因植株及后代環(huán)烯醚萜類化合物代謝的 分子機制奠定了基礎(chǔ)。 主要研究過程及實驗結(jié)果包括： 1.狹葉柴胡與川西獐牙菜 體細胞雜交 1.1 體細胞雜種細胞系及其再生植株的獲得以高寒藏藥材川西獐牙 菜原生質(zhì)體為供體，經(jīng)380卩W/cm2的紫外線照射0sec、30 sec、1 min、2 min 和3 min后,與狹葉柴胡原生質(zhì)體（受體）在PEG誘導(dǎo)下進行融合,共產(chǎn)生194塊愈 傷組織,其中,3個克隆再生出完整綠苗 ,并移栽成活。經(jīng)染色體和同工酶分析 , 證明了 104個細胞系的雜種性質(zhì)

6、。 1.2 體細胞雜種 核基因組組成分析1.2.1雜種染色體和GISH分析雙親染色體數(shù)目：狹葉柴胡愈 傷組織染色體數(shù)目為 11-12 條, 川西獐牙菜愈傷組織染色體數(shù)目為 17-20條, 雜種 染色體數(shù)目為 11-20 條GISH結(jié)果顯示：雜種細胞系B24（具有分化能力,可再生植株）和C10（無分化 能力 ） 中狹葉柴胡染色體均為 11-13, 完整川西獐牙菜染色體及其染色體小片段 數(shù)目分別為：0-3/1-3和0-1/5-9。表明，隨UV射線劑量的增加，完整川西獐牙 菜染色體數(shù)目逐漸減少，供體染色體小片段數(shù)目增加，證明了 UV劑量在雜種川西 獐牙菜染色體消減及片段化中的作用。1.2.2 RAP

7、D分析200個隨機引物的PCRT增分析表明：1）雜種細胞系均含 有雙親特征譜帶或新帶；2）雜種中保留了 91.2%-96.0%的狹葉柴胡DNAf帶、 0.2%-2.6%的川西獐牙菜供體DNA譜帶。表明體細胞雜種的核基因組以受體狹葉 柴胡為主,受體對雜種的核基因組貢獻大于供體；3）除C10外,不同雜種的供體帶 比例及新帶比例差別較小，表明雜種中供體DNA組成相近；4）雜種中供體DNA和 重組DNA含量與紫外照射的時間成正相關(guān)。1.3體細胞雜種中藥效成分含量及醇溶性成分的代謝譜變化分析HPLC測定發(fā)現(xiàn),所有的 74個雜種細胞系中均不含有龍膽苦苷 ,雜種 B24、 B27、 B132、 C18、 C

8、26 C47和C124含有獐牙菜苦苷（含量為0.0074-0.0812 mg/g）, 雜種克隆B6 B40 B56 C10和 C121 僅含芒果苷（含量為 0.0863-0.8168 mg/g）,其中,B6、B56 和C10含量高于親本川西獐牙菜（0.6641 mg/g）,表明，供體川西獐牙菜的獐牙菜 苦苷和芒果苷已轉(zhuǎn)入受體狹葉柴胡中。GC-MS分析表明，雜種中含有大部分柴胡 （受體）的特征性物質(zhì) , 少量的川西獐牙菜特征性物質(zhì)及非雙親物質(zhì) （新物質(zhì)）。1.4細胞色素P450基因在雜種及雙親中的存在方式利用 CYP76的簡并引物 對川西獐牙菜、 狹葉柴胡及其體細胞雜種細胞系 A6、 A67、

9、B24、 B27、 B132、 C18、 C26 C47和 C124進行了 RT-PCRT增,獲得了 11 個長度約 1100-1200bp 的 G1OH基因的同源片段?；蚱涡蛄斜葘Πl(fā)現(xiàn)，狹葉柴胡的G10H與川西獐牙菜的同源 性為 45.7%;雜種 B24 B27、B132、C18 C26 C47和 C124 的 G10H與川西獐牙 菜(SmGlOH的完全相同,表明它們可能來源于供體川西獐牙菜。雜種A6 A67的G10H與狹葉柴胡的同源性(84.1%)遠高于與川西獐牙菜的同 源性(53.1%),表明,該基因片段可能來源于狹葉柴胡。研究表明,G1OH除了參與 吲哚生物堿的合成 ,亦可能參與了

10、環(huán)烯醚萜類代謝合成 , 而抗肝炎藥效成分獐牙 菜苦苷及龍膽苦苷均為此類物質(zhì) , 因此, 該基因亦可能參與了它們的合成 , 有必要 作為本實驗中的目標基因進行深入研究。1.5 SmGlOH在體細胞雜種中的表達及其與獐牙菜苦苷含量的關(guān)系半定量RT-PCF分析表明，SmG10H達水平：雜種B24 B132、C47低于親本川西獐牙菜； B24和B132接近,但高于C47; A6未見表達。表明，不同雜種SmG10的表達水平 存在明顯差異。HPLC分析表明,雜種中獐牙菜苦苷含量(0.0074-0.0812 mg/g)低于親本川西 獐牙菜(0.9298 mg/g),其中B24和B132高于C47; A6未檢

11、測出獐牙菜苦苷。表 明,A6的SmG10未表達,其不含獐牙菜苦苷；B24 B132表達水平較高,其獐牙菜 苦苷含量亦較高；C47的表達水平低,其含量亦低。由此而知，雜種SmG10l表達與獐牙菜苦苷含量呈正相關(guān)?？傊?，含有獐牙菜 苦苷體細胞雜種中存在可能來源于供體川西獐牙菜SmG1O該基因的表達量與雜種獐牙菜苦苷成正相關(guān)。2. 川西獐牙菜環(huán)烯醚萜類化合物相關(guān)基因的克隆和功能驗證 2.1 香葉醇 10- 羥化酶(SmG10H基因的克隆采用RACE-PC技術(shù),從川西獐牙菜中分離了 1個香葉 醇10-羥化酶基因的全長 cDNA命名為：SmG1OH(CYP76B10,Genba號為GU168041。序列

12、分析表明,它們的ORF核苷酸長度為1488 bp,編碼496個氨基 酸,蛋白質(zhì)分子量均為 55.5 kDa該基因全長為1637 bp,在882-1030 bp位置有一個大小為149 bp的內(nèi)含子。 系統(tǒng)樹分析表明，該基因氨基酸序列在進化上與長春花的 CYP76B6具有高的同源 性(80.2%) 。2.2 SmGlOK在川西獐牙菜基因組中的分布 Southern blot 分析表明，SmG10H 在川西獐牙菜基因組中以單拷貝的形式存在。 2.3 環(huán)烯醚萜類化合物代謝途徑中 相關(guān)基因的表達分析2.3.1 SmG1OH在川西獐牙菜中的表達分析半定量 RT-PCR 和Real-time PCR分析表明

13、,SmG1OHE川西獐牙菜葉片中高表達，在根和莖中的 表達量甚微。SmG1O在葉中的表達量是根中的 24.9倍，莖中的10.2倍。2.3.2 MeJA對環(huán)烯醚萜類化合物合成相關(guān)基因表達及藥效成分含量的影響克隆環(huán)烯醚萜類化合 物合成途徑相關(guān)的6個基因片段：SmG1OHDXS HMG、IPP-iso和MECSS因， 設(shè)計特異性引物，分析MeJA處理下，上述基因的表達變化。1) 不同濃度 MeJA誘導(dǎo)的SmGl0H表達選用0、10、20、50、100和150卩M 的MeJA處理川西獐牙菜再生植株，取處理6h的材料進行半定量RT-PCR分析，結(jié) 果表明，在50卩M下SmG1O表達量高，為適宜的處理濃度

14、。MeJA處理可顯著提高 SmG10表 達。2) 不同時間MeJA誘導(dǎo)的目標基因表達模式選用 50卩M的MeJA處理川西獐牙 菜，分別取0 h、6 h、12 h、24 h、36 h的再生植株進行半定量 RT-PCF和Real-time PCR分析，結(jié)果表明，再生植株在 MeJA處理6 h,SmG10H DXS HMGR.IPP-iso和 MECSS因表達開始上調(diào)，在24小時時表達量最高，然后呈現(xiàn)下降趨勢；在 MeJA處理24 h后,IPP-iso. MEC表達最強，然后呈現(xiàn)下降趨勢。3)MeJ處理川西獐牙菜對藥效成分含量的影響川西獐牙菜再生植株在50uM MeJA處理不同時間下的HPLC分析表

15、明,隨著處理時間的延長,獐牙菜苦苷、龍膽苦苷及芒果苷的含量均 持續(xù)增加 , 在 24 h-36 h 間其增長率最高 , 而到 15 d 時含量達到最高 , 分別為 2.62 mg/g,0.67 mg/g 和0.21 mg/g, 比對照(未處理)分別增加了 2.5 倍,2.2 倍和 2.7 倍。表明,MeJA能夠顯著提高川西獐牙菜抗肝炎藥效成分含量。4)MeJA處理下SmG10表達與環(huán)烯醚萜類化合物含量的關(guān)系 MeJA處理12 h后,SmG1O表達水平 高，獐牙菜苦苷和龍膽苦苷含量亦增加,表明,SmG10Hg達水平與環(huán)烯醚萜類化 合物含量呈正相關(guān)。2.4 SmG10H基因的功能鑒定241 SmG

16、10H在原核細胞大腸桿菌的表達驗證1)表達產(chǎn)物的蛋白特性分析構(gòu)建了帶有 SmG10的大腸桿菌表達載體 pET28a-SmG10H轉(zhuǎn)化到表達型菌株BL21中，陽性克隆經(jīng)IPTG誘導(dǎo),提取蛋白進行SDS-PAG分析,均獲得了分子量大小為60 kDa的SmG1O譜帶。對帶有His標簽 的SmG10進行純化和等電聚焦實驗,發(fā)現(xiàn)該蛋白等電點為8.63 ± 0.3。2) 表達產(chǎn)物的LC-MS分析對純化的SmG10蛋白在體外加入底物香葉醇后進 行液相-質(zhì)譜法(LC-MS)分析，發(fā)現(xiàn)催化反應(yīng)的目標產(chǎn)物同10-hydroxygeraniol 標準品均在8.3 min處存在一個峰，質(zhì)譜分析證實該峰為10

17、羥基香葉醇。從而表 明,SmG1O在體外具有催化底物香葉醇生成10羥基香葉醇的活性。3) 酶活力測定為了進一步測定酶活力大小 ,對純化蛋白體外反應(yīng)的催化條件 進行了優(yōu)化,確定其最佳催化條件為：pH7.7± 0.1,溫度為30C。在此條件下,測 得該蛋白的酶活力大小為 0.36±0.02(pkat/mg protein) 。2.4.2 SmG10在真核細胞酵母的功能驗證1)SmG10H在酵母的表達驗證構(gòu)建 了酵母表達載體pPICZa-SmG10轉(zhuǎn)入畢赤酵母GS115中,SDS-PAGE分析發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)基因酵母菌與對照相比均含有 SmG10合成酶譜帶，分子量大小為60.0 kDa。

18、分 離轉(zhuǎn)SmG10酵母的膜蛋白，加入底物香葉醇，通過LC-MS分析發(fā)現(xiàn)，該膜蛋白的催 化產(chǎn)物同 10羥基香葉醇標準品的保留時間均為 8.3 min, 且質(zhì)譜峰型一致。證明SmG10能夠表達,其產(chǎn)物具有酶活性，可在酵母中直接催化底物香葉醇 生成10羥基香葉醇，而未轉(zhuǎn)基因酵母未檢測出10羥基香葉醇。2）SmG10H»催化 特性在體外催化反應(yīng)中，加入100卩gSmGlO蛋白，反應(yīng)時間為30 min時，催化反 應(yīng)的目標產(chǎn)物成線性。以此為最佳反應(yīng)條件，對轉(zhuǎn)基因酵母SmG1O蛋白進行體外酶催化活性分析， 測得該酶的Km=5.2± 0.2卩M 2.4.3 SmG10在植物中的功能驗證1）川西獐牙菜 胚性愈傷組織的基因轉(zhuǎn)化利用基因槍法，將過表達載體pBGWF7-SmG10HRNAi 載體pK7GWIWG-SmG分別轉(zhuǎn)入培養(yǎng)7 d的川西獐