體內(nèi)小鼠試驗方案

1、實驗報告抗腫瘤藥物體內(nèi)活性研究一、實驗原理聚合物膠束的粒徑約為0-200 nm,可以利用月中瘤組織的增強滲透保存效應(yīng)(EPR),選擇性地透過月中瘤血管并積累在月中瘤組織，實現(xiàn)被動靶向；被特定官能 團修飾的聚合物膠束那么能響應(yīng)部位的物理化學(xué)變化，實現(xiàn)靶向部位的載體聚集和藥物定點釋放?？乖轮辛鏊幬锏姆磸?fù)使用容易導(dǎo)致月中瘤細胞產(chǎn)生多藥耐藥性(MDR),月中瘤細胞對一種抗月中瘤藥物產(chǎn)生耐藥性后，對結(jié)構(gòu)與作用機制不同的其 它抗月中瘤藥產(chǎn)生交叉耐藥的現(xiàn)象極大的限制了化療藥物的療效。納米藥物傳遞系統(tǒng)如脂質(zhì)體、膠束、納米粒等作為MDR逆轉(zhuǎn)策略越來越引起關(guān)注。膠束能通過EPR效應(yīng)使藥物選擇性地在月中瘤部位累積和

2、釋放， 增加細胞內(nèi)藥物濃度，緩控釋 藥物，并通過靶向細胞上特異受體對應(yīng)的配體修飾，到達主動靶向，從而逆轉(zhuǎn)月中瘤細胞耐藥。鹽酸阿霉素(DOX HCl),屬于慈環(huán)類抗生素，能夠抑制癌細胞遺傳物質(zhì)核 酸的合成，具有廣譜的惡性月中瘤的治療效果，廣泛用于宮頸癌細胞、卵巢癌、乳 腺癌、惡性淋巴瘤、肺癌、肝癌等的治療。然而，阿霉素的急性和慢性毒副作用 限制了其在臨床上的廣泛應(yīng)用，急性毒副作用包括惡心、嘔吐、骨髓抑制和心率 失常;慢性毒性表現(xiàn)為肝臟、大腦和腎臟的損傷，對心臟具有不可逆的劑量依賴 性的損傷。用聚合物構(gòu)建新型藥物膠束傳遞系統(tǒng)，提高對疏水性藥物的包載能力 和藥物穩(wěn)定性；通過小分子修飾實現(xiàn)被動和主動靶

3、向。此外，通過相關(guān)實驗考察作 為藥物載體的聚合物膠束的耐藥能力，以此來證明聚合物膠束的生物平安性好、穩(wěn)定性高、載藥量高、響應(yīng)性強、靶向性準、緩控釋性能好。二、實驗?zāi)康?.運用抗月中瘤藥物在小鼠體內(nèi)評價方法，篩選出具有高表達、特異性、高親和力 的主動/被動靶向、無細胞毒性、抗月中瘤效果好的聚合物膠束。2.動物體內(nèi)抑瘤實驗基于活體成像技術(shù)，建立藥物抗月中瘤效果活體動物影響研究方法。三、實驗內(nèi)容1 1.動物模型將狀態(tài)良好的細胞消化，用培養(yǎng)液稀釋至1X 106cells/mL細胞密度，吹勻后 于每只小鼠參加細胞懸液100人，培養(yǎng)。受試溶液每孔參加100 pL,每個濃度3-5個平行孔，每組10-15只裸

4、鼠；對照組，即不加待測藥液，單一補加100小 生理鹽水，培養(yǎng)02 2.體內(nèi)抑瘤實驗給藥后觀察裸鼠體內(nèi)月中瘤體積變化情況。3 3.近紅外成像的研究裸鼠在給藥2和12天后處死，取血液、心臟、肝臟、脾臟、肺、腎臟、月中 瘤組織，置于近紅外成像系統(tǒng)觀察。四、實驗方案1 1.動物模型的建立通過MTT實驗選取生物活性好、穩(wěn)定性高、載藥量高的聚合物納米顆粒NPs,為了考察不同給藥劑量的DOX-NPs阿霉素負載聚合物納米顆粒和DOX HCl溶液的抗月中瘤效果，選取HeLa細胞常規(guī)培養(yǎng)，待細胞擴增至一定數(shù) 量，且生長狀態(tài)良好，取對數(shù)生長期的細胞用0.25%胰酶消化2 min, 1000rpm離 心5min,棄去

5、上清液，用新鮮無血清的DMEM培養(yǎng)基重懸細胞沉淀，配制成1X106個細胞/mL的細胞懸液。然后用注射器吸取細胞懸液，排空氣泡，注射于體重在520-22g左右的BALB/C雌性裸鼠左腋皮下組織中，每只接種100 L,約含1M0個細胞，大約共接種120只。觀察裸鼠月中瘤生長情況，并定期稱裸鼠體重，測量 月中瘤大小。實驗期間動物正常飲食喝水。2 2.給藥及抑制月中瘤效果評價當(dāng)月中瘤體積長到100150 mm3時， 將裸鼠隨機分成4組， 每組10只裸鼠n=4 ,分別為陰性對照組生理鹽水組,DOX - HCl, NPs和DOX-NPs。陰性 對照組通過尾靜脈注射100山對照生理鹽水。DOX HCl, N

6、Ps和DOX-NPs組 分別通過小鼠尾靜脈注射100人的用無菌生理鹽水配制的DOX HCl。并記為 第一天。給藥劑量分別為：5 mg/kg、10 mg/kg、15 mg/kg。隔天給藥一次，給 藥后小鼠正常飼養(yǎng)，每天觀察小鼠的生存狀況，每兩天記錄一次小鼠體重，并用 游標卡尺測量小鼠腫瘤的長短徑，根據(jù)公式計算月中瘤體積 V和相對月中瘤體積Relative tumor volume, RTV,繪制時間-小鼠相對體重和時間-小鼠相對月中瘤 體積變化曲線。給藥后第12天處死小鼠，摘取皮下月中瘤并稱重。月中瘤體積：V=axb2/2 a為月中瘤的最長徑，b為月中瘤的最短徑公式1相對月中瘤體積：RTV =

7、Va/VoVa為每日月中瘤體積，V0為起始月中瘤體積 公式2按照以下公式：計算各給藥組的抑瘤率：Tumor inhibiton ratio % = 1 Vtest/Vcontroi x 100%公式3其中，Vtest為第12天時給藥組的相對月中瘤體積，Vcontrol為第12天時生理鹽水組 的相對月中瘤體積。3 3.藥物體內(nèi)臟器分布實驗由于DOX HCl自身具有紅色熒光，故可通過近紅外成像儀觀察藥物在裸 鼠體內(nèi)各臟器的分布情況。在尾靜脈注射5mg/kg生理鹽水、游離DOX HCl、NPs和DOX-NPs組生理鹽水溶液后，于第2、12天處死裸鼠，取血液、心臟、肝臟、脾臟、肺、腎臟以及腫瘤置于在體

8、近紅外成像系統(tǒng)觀察，分析給藥后阿霉素在各 器官組織的分布情況，4 4.組織切片分析通過腫瘤以及心臟組織切片可以判斷不同制劑對月中瘤的抑制作用以及阿霉素對心臟的損傷情況。在尾靜脈注射生理鹽水、5mg/kg游離DOX - HCl、NPs和DOX-NPs組生理鹽水溶液后，在預(yù)設(shè)時間處死給藥后的裸鼠，剖取心臟以及月中 瘤組織，通過10%多聚甲醛對組織進行固定12小時以上。依次經(jīng)過50%酒精、70%酒精、80%酒精、90%酒精、95%酒精、100%酒精兩次進行脫水處理每級35-45分鐘。100%酒精與二甲苯1:1透明處理30-40分鐘，再移入二甲苯中15-20分鐘。將透明后的組織塊置于剛過溶點的融化石蠟中浸漬，取代組織中含有的透明劑，將浸蠟后的組織置于融化的固體石蠟中，石蠟?zāi)毯螅M織即被包埋在其中。修整蠟塊，并進行切片。經(jīng)過蘇木精-伊紅染色HE染色