DNA提取方法和試劑作用匯總

1、1試劑的作用氯仿的作用？氯仿：克服酚的缺點(diǎn)；加速有機(jī)相與液相分層。最后用氯仿抽提：去除核酸溶液中的跡量酚。(酚易溶于氯仿中)用酚-氯仿抽提細(xì)胞基因組DNA時(shí)，通常要在酚-氯仿中加少許異戊醇，為什么?異戊醇：減少蛋白質(zhì)變性操作過(guò)程中產(chǎn)生的氣泡。異戊醇可以降低表面張力 ，從 而減少氣泡產(chǎn)生。另外，異戊醇有助于分相，使離心后的上層含 DNA的水相、中 間的變性蛋白相及下層有機(jī)溶劑相維持穩(wěn)定。用乙醇沉淀DNA時(shí)，為什么加入單價(jià)的 陽(yáng)離子？用乙醇沉淀DNA時(shí)，通常要在溶液中加入單價(jià)的陽(yáng)離子，如 NaCl或 NaAc, Na+中和DNA分子上的負(fù)電荷，減少 DNA分子之間的同性電荷相斥力， 而易于聚集沉淀

2、。2 DNA提取分為三個(gè)基本步驟每個(gè)步驟的具體方法可根據(jù)樣品種類、影響提取的物質(zhì)以及后續(xù)步驟的不同而有區(qū)別。.細(xì)胞的破碎細(xì)菌有堅(jiān)硬的細(xì)胞壁，首先要破碎經(jīng)胞。方法有三種 ；機(jī)械方法：超聲波處理 法、研磨法、勻漿法：化學(xué)試劑法：用SDS處理細(xì)胞；酶解法：加入溶菌酶或 蝸牛酶，都可使細(xì)胞壁破碎。利用研磨或者超聲破碎細(xì)胞，并通過(guò)加入去污劑以除掉膜脂。加入蛋白酶，醋酸鹽沉淀，或者酚/氯仿抽提，以除掉細(xì)胞內(nèi) 的蛋白，如與DNA 結(jié)合的組蛋白。 將DNA在冷乙醇或異丙醇中沉淀，因?yàn)?DNA在醇中不可溶而 黏在一起，這一步也能除掉鹽分。另外，目前也有利用吸附過(guò)柱的方法提取DNA的商業(yè)化試劑盒。DNA提取的幾種

3、方法(1).濃鹽法A.利用RNA和DNA在電解溶液中溶解度不 同，將二者分離，常用 的方法是用1M 氯納抽提彳馬到的DNA粘液與含有少量蛋白質(zhì)氯仿一起搖蕩，使乳化,再離心除去 蛋白質(zhì)，此時(shí)蛋白質(zhì)凝膠停留在水相及氯仿相中間，而 DNA位于上層水相中，用2倍 體積95%乙醇可將DNA鈉鹽沉淀出來(lái).B.也可用0.15 MNaCL液反復(fù)洗滌細(xì)月fi破碎液除去 RNA再以IMNaCL提取脫氧 核糖蛋白，再按氯仿-異醇法除去蛋白.兩種方法比較，后種方法使核酸降解可能少一些.C以稀鹽酸溶液提取DNA時(shí)，加入適量去污劑，如SDS可有助于蛋白質(zhì)與DNA的 分離。在提取過(guò)程中為抑制組織中的 DNase對(duì)DNA的降

4、解作用，在氯化鈉溶液 中加入檸檬酸鈉作為金屬離子的烙合劑.通常用.15MNaCL,0.015M檸檬鈉，并稱 SSC§液，提取DNA. (2) .陰離子去污劑法；用SDS或二甲苯酸鈉等去污劑使蛋 白質(zhì)變性,可以直接從生物材料中提取DNA.由于細(xì)胞中DNA與蛋白質(zhì)之間常借 靜電引力或配位鍵結(jié)合，因?yàn)殛庪x子去污劑能夠破壞這種價(jià)鍵，所以常用陰離子去 污劑提取DNA(3) .苯酚抽提法：苯酚作為蛋白變性劑，同時(shí)抑制了 DNase的降解作用.用苯酚 處理勻漿液時(shí)，由于蛋白與DNA聯(lián)結(jié)鍵已斷，蛋白分子表面又含有很多 極性基團(tuán) 與 苯酚相似相溶。蛋白分子溶于酚相，而 DNA溶于水相。離心分層后取出水

5、層， 多次重復(fù)操作，再合并含DNA的水相，利用核酸不溶于醇的性質(zhì)，用乙醇沉淀 DNA。此時(shí)DNA是十分粘稠的物質(zhì)，可用玻璃漫漫繞成一團(tuán)，取出。此法的 特 點(diǎn)是使提取的DNA保持天然狀態(tài)(4) .水抽提法：利用核酸溶解于水的性質(zhì)，將組織細(xì)胞破碎后，用低鹽溶液除去 RNA,然后將沉淀溶于水中，使 DNA充分溶解于水中，離心后收集上清液.在上清 中加入固體氯化鈉調(diào)節(jié)至2.6M.加入2倍體積95%乙醇，立即用攪法攪出.然后 分別用66% , 80%?口 95%乙醇以及丙銅洗滌，最后在空氣中干燥，既得DNA樣品. 此法提取的DNA中蛋白質(zhì)含量較高，故一般不用.為除蛋白可將此法加以改良，在 提取過(guò)程中加入

6、SDS.1.動(dòng)物來(lái)源的DNA的提取1. 1經(jīng)典提取方法酚抽提法、異丙醇沉淀法以及甲酬:胺裂解法是提取DNA最為經(jīng)典的方法，目前很多 方法的改進(jìn)都是在這些方 法的基礎(chǔ)上進(jìn)行的，這三種方法均利用蛋白酶K和十二烷基硫 酸鈉(SDS)消化破碎細(xì)胞。在前兩種方法中裂解?先用酚/氯仿去除蛋白質(zhì)，再分別用乙醇或異 丙醇沉淀DNA。甲酬:胺法是利用高濃度的甲 酬:胺解聚蛋白質(zhì)與 DNA的結(jié)合，然后利用透 析來(lái)處理DNA樣品。這些經(jīng)典方法獲得的 DNA純度很高，能夠滿足各種試驗(yàn)的要求，但 操作繁瑣，用時(shí)長(zhǎng)， 且所用試劑具有一定的毒性。1.2 玻璃棒纏繞法該法用鹽酸肌裂解細(xì)胞，然后將細(xì)胞裂解物小心鋪在離心管中的乙

7、醇上，用一 個(gè)帶鉤的或前端為U形的玻璃棒在這兩層液體的交界面慢慢攪動(dòng)，沉淀出的膠狀 DNA纏繞在玻璃棒上。玻璃棒上的 DNA經(jīng)多次乙醇浸泡并于室溫下 蒸干乙醇，由膠狀逐漸回縮，然 后浸人 TE中過(guò)夜，使其重新吸水膨脹進(jìn)而和玻璃棒分離。這種方法對(duì)操作技術(shù)要 求較高，但 簡(jiǎn)單快速。1.3 血細(xì)胞DNA的快速提取法采用 非離子變性劑NP40(乙基苯基聚乙二醇)代替SDS裂解細(xì)胞，提取細(xì)胞核，然后用酚/氯仿抽提DNA。這樣從血液中分離獲得的DNA純度高，能夠滿足各種臨床 檢驗(yàn)和實(shí)驗(yàn)的 需要。也可采用 NP40和Tween -20同時(shí)作用破碎細(xì)胞膜，以 避免SDS對(duì)以后 步驟的負(fù) 面作 用。Ba sun

8、 i等'采用了 4種常用的從血液 中提取DNA的方法:High Pure Viral Nucleic 試劑盒法、QlAamp試劑盒法、Tri- PureTM試劑分離提取法以及經(jīng)典酚抽提法，對(duì)通常作拋棄處理的血凝塊進(jìn)行人DNA及病毒DNA的抽提，發(fā)現(xiàn)前兩種方法可以迅速高效獲得目的DNA,從而建立了由血凝塊中提 取DNA的方法，擴(kuò)大了臨床 檢驗(yàn)樣本的來(lái)源。1.4 玻璃顆粒吸附法在該法中首先利用含異硫鼠酸肌的細(xì)胞裂解液裂解細(xì)胞，然后加人含有能夠與 DNA結(jié)合的玻璃顆粒的緩沖 液，經(jīng)沉淀收集結(jié)合染色體DNA的玻璃顆粒，利用洗脫液進(jìn)行洗脫獲彳導(dǎo)DNA。不僅玻璃顆粒可以與 DNA進(jìn)行結(jié)合，一定大小

9、的硅膠顆粒也可以與DNA進(jìn) 行結(jié)合，據(jù)此，不少 實(shí)驗(yàn)工作者實(shí)踐了很多利用顆粒結(jié)合DNA的提取方法。Pichler等2在從抹香鯨(Physeter macrocephalus) 牙齒及骨骼中抽提 DNA時(shí)采用了一種以二氧 化硅為吸附介質(zhì)的方 法，從抹香鯨標(biāo)本骨骼組織中鉆取的少量粉末中獲得了足夠用于分析的DNA產(chǎn)物，此方法 擴(kuò)大了對(duì)稀有哺乳動(dòng)物 DNA研究的取材范圍。Caldarelli-stefano 等3在從福爾馬林固定、石蠟包埋的人體組織標(biāo)本中提取 DNA時(shí)利用小磁珠作為結(jié)合核，也獲得了理想的純化 DNA。很多試劑公司也依 此設(shè)計(jì)生產(chǎn)了許多顆粒提取試劑盒，Pinto等4就探討了采用 Gibc

10、。公司的GlassMAX系統(tǒng)，對(duì)福爾馬林固定 的組織進(jìn)行DNA提取 的具體操作 方法，目前這些試劑盒在臨床上廣為應(yīng)用，省時(shí)省 力。1.5 三乙醇胺月桂基硫酸鹽 (TLS)法由于常規(guī)方法中使用的蛋白酶 K的水解條件不好掌握，采用 TLS來(lái)提取組織、細(xì)胞以 及外周血DNA可以克服這一弊端。 TLS是一種較強(qiáng)的表面活性劑，將其直接作用于細(xì)胞 或組織勻漿，可迅速 溶解細(xì)胞膜、核膜，而且蛋白質(zhì)與其結(jié)合后即失去對(duì) DNA的結(jié)合，進(jìn)一步的純化可采用常規(guī)方法。1.6 臨床病理標(biāo)本的DNA提取方法由于PC R技術(shù)不僅可用于基因分離、核酸序列分析 ，還可用于突變體和重組體的構(gòu)建、基因表達(dá)調(diào)控研究、基因病的診斷及腫

11、瘤發(fā)生機(jī)理的探討等。近年來(lái)，PCR技術(shù)已廣泛應(yīng)用于病理學(xué)研究，尤其對(duì)福爾馬林固定石蠟包埋病理標(biāo)本進(jìn)行相關(guān)的研究更成為關(guān)注的焦點(diǎn)。對(duì)于從這些病理 標(biāo)本中提取 DNA的方法研究也很多。一般采用酚/氯仿抽提法，該法雖然效率較高，但費(fèi) 時(shí)費(fèi)力，而且其操作中要求多次離心，增加了樣品污染的可能性。近 年來(lái)很多高效靈敏的 方法在實(shí)踐中得以采用，這些方法通常采用加熱或微波法s去除包 埋的石蠟，使用Sephadex G- 5。柱色譜或鹽析法s7等去除蛋白質(zhì)。高文濤71等在研究 福爾馬 林固定石蠟包 埋組織DNA提取方法對(duì)PCR的影響時(shí)，發(fā)現(xiàn)在組織切片中加人鰲合 樹(shù)脂（Chelating Resin ,亞氨基二乙

12、酸）提取獲得的 DNA可取得較好的PCR擴(kuò)增結(jié)果。Coombs等s則采用熱循環(huán)方法，將標(biāo)本上的蠟融人樣品溶液，在酶的作用下進(jìn)行裂解，然后用Chelex-100進(jìn)行吸附，離心去蠟，這種 方法安全、簡(jiǎn)便、有效、經(jīng)濟(jì)。1.7 鹽析法該法用飽和氯化鈉代替有機(jī)溶劑去除蛋白質(zhì)，所獲得的 DNA質(zhì)量可以滿足PCR模板的要求，但產(chǎn)率相對(duì) 較低，純度較差。譚建明等 9對(duì)上述鹽析法進(jìn)行了改進(jìn)，即將處理過(guò) 的樣本加人SDS和蛋白酶K后，在56'C消化1h,然后用飽和氯化鈉沉淀蛋白質(zhì)，并經(jīng)離心除去，上清直接 用乙醇沉淀DNA。該法簡(jiǎn)化了 DNA的抽提步驟，可用于人體各 種樣 本DNA的提取，所獲DNA的純度可

13、以滿足各種檢測(cè)的需要。2植物來(lái)源的DNA提取利用基因工程手段對(duì)植物進(jìn)行定向改造，已成為當(dāng)今植物育種學(xué)發(fā)展的一個(gè)新領(lǐng)域，植 物基因工程操作離不 開(kāi)植物基因組總 DNA的制備，不同植物的核酸結(jié)合蛋白的情況各不相同,因而要采取不 同的提取方法10。由于植物中次生代謝 產(chǎn)物一多酚類化合物可介導(dǎo) DNA降 解，而多糖的 污染也是影響植物 DNA純度最常見(jiàn)的問(wèn)題，這些多糖能抑制限制酶、連接酶及DNA聚合酶等酶類的生物活性。因此要 從富含多酚和多糖的植物組織中分離獲得高質(zhì)量的基因組DNA也并非易事11l。目前采用 的方法有以下幾種。2.1十六烷基三乙基澳化按 （CTAB）法CTAB是一種陽(yáng)離子去污劑，它能與

14、核酸形成復(fù)合物，這些復(fù)合物在低鹽溶液中會(huì)因溶解度的降低而沉淀，而在高鹽溶液中可解離，從而使 DNA和多糖分開(kāi)，再用乙醇沉淀DNA而除去CTAB。在該法中使用的聚維酮 （PVP）與多酚結(jié)合形成復(fù)合物，從而可有效 避免多酚類化合物介 導(dǎo)的DNA降解121。王卓偉等13在對(duì)桑葉DNA提取方法研究過(guò)程中發(fā)現(xiàn)PVI還能有效地去除多糖。羅志勇等 14在研究中對(duì)這種方法進(jìn)行了幾點(diǎn)改進(jìn)：提高CTAB的濃度：對(duì)于含多酚類較多的植物，增加 CTAB提取緩沖液中琉基乙醇的 含量，同時(shí)加人PVP使其與多酚類物質(zhì)Z合形成復(fù)合物：增加低鹽沉淀緩沖液的量;增加高鹽溶液中鹽的濃 度。用改進(jìn)的方法從人參、西洋參、三七等藥用植物

15、中分離獲得了高純度的DNA, Porebski等1s在沉淀粗提 DNA時(shí)，將提取緩沖液中氯化鈉的濃度提高至2.5 m o卜L-'以使DNA在高鹽緩沖條件下優(yōu)先沉淀，可更有效地除去多糖。Stein等16對(duì)傳統(tǒng)的CTAB法進(jìn)行了優(yōu)化，創(chuàng)建了一種從新鮮草本植物樣本中提取DNA的方法。首 先在特制的有96個(gè)孔的托盤上種植植物樣本，并依照不同樣本在托盤中的位置進(jìn)行編號(hào)，然后取適量植物葉子 分裝在充滿提取液的塑料袋中，除去袋中的空氣并封口，再用特制的手工勻化器將各袋中 的樣本混勻，56'C孵育1h后將袋中的液體取出進(jìn)行離心以及 DNA的 沉淀。Xin等17則采用簡(jiǎn)易的96孔托盤作為提取時(shí)的

16、容器，將多種植物樣本經(jīng)研磨處理后分別放在不同的孔中進(jìn)行提取，在一天內(nèi)由一人就可完成上千個(gè)樣本的 DNA提取，為高通量植物基因分析及篩選提供了極大的便利。2.6 SDS 法為了避免CTAB法試驗(yàn)步驟多、操作繁瑣的不足之處，近年來(lái)又提出了利用 SDSTris-Cl- EDTA等直接裂解細(xì)胞使其釋放出 DNA的方法。在該法后續(xù)的 DNA純化過(guò)程中通常 采用酚/氯仿處理，但對(duì)于植物 DNA純化不是一個(gè)很好的選擇，因?yàn)榉拥氖褂每山档?DNA 的提取效率和純度。在用該法提取DNA的過(guò)程中采用較大的離心力和較長(zhǎng)的離心時(shí)間，然后用氯仿一異戊醇代替酚來(lái)去除變性蛋白質(zhì)，從而克服了由于酚的摻人及殘留對(duì)以后酶切帶來(lái)的

17、困難。用琉基乙醇代替SDS,對(duì)大豆DNA分離提取能夠更有效地 去除蛋白質(zhì)， 而且可以有效防止褐 變，獲得天然雙鏈高分子量的DNA產(chǎn)物，并且減少了 SDS對(duì) PCR、隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性 DNA技術(shù)(Random amplified polymorphic DNA, RAPD)等操作的 影響。在對(duì)辣椒DNA進(jìn)行提取時(shí)為了提高 DNA的產(chǎn)率將待提取的植物材料首先在液氮中研磨成粉末，并且針 對(duì)辣椒葉子中多酚類物質(zhì)極少的特點(diǎn)將其中的加人PVP的步驟省去，消除了 PVP對(duì)以后操作的影響.2.7 氯化千法在對(duì)稱猴桃的基因組DNA提取過(guò)程中選用了氯化節(jié)法，與其他方法相比該法的得率較高，其原 因可能是氯化節(jié)不僅可與

18、植物細(xì)胞壁上的多糖經(jīng)基反應(yīng)生成醍，而且與細(xì)胞液中多糖物質(zhì) 的All基反應(yīng)，起到破壞糖鏈的作用，利于 DNA的釋放和提純。2.8 高鹽低pH法該法中 所用的提純?cè)噭﹥H為無(wú)機(jī)鹽和異丙醇。通常采用的無(wú)機(jī)鹽為醋酸鉀，低pH的醋 酸鉀是有效的蛋白質(zhì) 沉淀劑。與一般氯仿一異丙醇反復(fù)抽提去 除蛋白質(zhì)的操作相比該法操 作更方便省時(shí)，所需 樣品量少，適用于瀕危植物DNA的提取。2.9 果膠酶法Ste ve n等2s采用果膠酶對(duì)植物細(xì)胞破 碎后的抽提混合物進(jìn)行 消化處理使與 DNA共沉 淀的膠狀物質(zhì)分解成 小的片段，從而無(wú)法與 DNA 一起沉淀下來(lái)，降低了 DNA的純化難度， 提高純化效率。3微生物來(lái)源DNA的提

19、取常規(guī)的微生物DNA提取多是根據(jù)某種微生物的 具體特點(diǎn)選擇合適的方法。在實(shí)際的科學(xué)研究過(guò)程中，很多 科學(xué)工作者通過(guò)實(shí)踐總結(jié)出許多快速實(shí)用的提取方法，現(xiàn)擇其中比較典型的加以總結(jié)。3.1 細(xì)菌質(zhì)粒的提取方法質(zhì)粒是獨(dú)立于細(xì)菌染色體 DNA之外的環(huán)狀DNA,它能攜帶外源基因進(jìn)人細(xì) 菌 進(jìn)行擴(kuò)增，或表達(dá)外源基因，是基因工程中常用的載體，在 DNA重組技術(shù)、 DNA測(cè)序、轉(zhuǎn)基因等方面具有廣泛的應(yīng)用。對(duì)于細(xì)菌質(zhì)粒的提取比較經(jīng)典的方法有：堿裂解法、煮沸法、SDS裂解法以及Thton-溶菌酶裂解法 等。這些方法的選擇取決于質(zhì)粒的大小、細(xì)菌菌株的性質(zhì)等。Keunosky等GE_發(fā)展了一種以Zn'+誘導(dǎo)DN

20、A沉淀的方法，在該法中利用一定濃度的 ZnCl:溶液使 一定體積的細(xì)菌菌液質(zhì)粒 DNA大量沉淀，無(wú)需多次離心，大大簡(jiǎn)化了抽 提的步 驟。近年來(lái)，一些生物技術(shù)公司，比如 Promega公司及Qiagen公司等紛紛推出 質(zhì)粒抽提試劑盒，這些試劑盒多運(yùn)用樹(shù)脂材料或硅膠來(lái)特異性的吸附質(zhì)粒 DNA,提取過(guò)程用時(shí)少，效率高。3.2 真菌DNA提取方法對(duì) 真菌DNA的提取關(guān)鍵是破碎細(xì)胞，通 常采取酶解破壁法或以 液氮冷凍處理增加細(xì)胞壁脆性的物理破壁法。在這兩種方法中酶解破壁法較為簡(jiǎn)單，易于 操 作和控制，而物理破壁法在處理過(guò)程中容易造成細(xì)胞核的大量破損。在提取 獲 得核酸一蛋白質(zhì)復(fù)合物后，對(duì)其中蛋白質(zhì)的沉淀

21、也多采用傳統(tǒng)的氯仿一異戊醇沉淀法或高鹽沉淀法。韓利剛等 C25用CTA13法直接從絲狀真菌的新鮮菌絲 中提取DNA,并將所提取的DNA進(jìn)行RAPD,得到了較清晰的擴(kuò)增圖譜。Loeffler等Z6為滿足快速靈敏準(zhǔn)確的臨床檢驗(yàn) 的需要，利用MagNA Pure LC 系統(tǒng)建立了一種實(shí)用的快速提取方法，該法自動(dòng)化程度高，避免了可能的交叉污染。Manian等z7在對(duì)真菌進(jìn)行DNA抽提時(shí)采用幾個(gè)循環(huán)的快速制冷、煮 沸以破碎真菌細(xì)胞壁，并通過(guò) Qiagen公司的QIAquick DNA純化柱，迅速?gòu)?極微量的真菌中獲得高純度的 DNA大分子。3.3 結(jié)核桿菌DNA的提取方法利用PC R微孔板雜交技術(shù)檢測(cè)臨

22、床標(biāo)本中結(jié)核桿菌 DNA是診斷結(jié)核桿菌感 染的一種快速靈敏和特異的方法。從不同的臨床標(biāo)本中獲得DNA是檢測(cè)準(zhǔn)確和成功的關(guān)鍵。而不同來(lái)源的結(jié)核桿菌又分別受到不同來(lái)源材料的影響，所 以 提取方法各不相同。同時(shí)由于結(jié)核桿菌的細(xì)胞壁比較厚不易破碎，一般的微波法、異硫氟酸肌法、凍融法等難以破壞結(jié)核桿菌的細(xì)胞壁。通常采取的方法有：經(jīng)典酶一酚一氯仿法，堿一 SDS裂解法，堿裂解煮沸法，超聲裂解法， Chelex-100法，玻璃粉一硅吸附法等。楊正林等28通過(guò)對(duì)以上幾種方法的 比較發(fā)現(xiàn)玻璃粉一硅吸附法操作簡(jiǎn)單，假陽(yáng)性低，適合臨床檢測(cè)使用。3.4 土壤微生物總DNA的提取方法土壤中細(xì)菌的含量豐富，種類齊全，從中

23、提取細(xì)菌DNA可用于檢測(cè)不可培 養(yǎng)的細(xì)菌，跟蹤某些目標(biāo)菌或重組基因在自然環(huán)境中的行為，也可用來(lái)解釋 土 壤微生物生態(tài)系統(tǒng)中的基因的多樣性及其隨環(huán)境的變化。從土壤中提取和純化DNA是最關(guān)鍵的技 術(shù)之一。Courtoi:等29對(duì)比了在土壤中直接裂解微生物體、 然后提取DNA和先將微生物菌體通過(guò)梯度離心與土壤顆粒分開(kāi)再進(jìn)行提取的方法，利用PCR技術(shù)以及雜交技術(shù)檢測(cè)不同方法獲得DNA的種類和純度，發(fā) 現(xiàn) 前一種方法具有更高的效率，能夠提取獲得較多微生物物種的DNAo張瑞福等30采用SDS高鹽提取法和透析袋回收法對(duì) 9種不同來(lái)源的土壤進(jìn)行微生物DNA的提取，與通常采用的對(duì)菌體細(xì)胞的超聲破碎法以及對(duì)粗提

24、DNA的微 型柱純化法相比，既保證了一定提取與回收效率，又兼顧了 DNA的質(zhì)量，使 DNA在提取和純化 過(guò)程中不會(huì)受到損傷。4海洋生物DNA的提取方法海洋是地 球上最大的生物資源庫(kù)，同時(shí)由于海水的保護(hù)使海洋生物變化很少， 物種得到較好的保存，這樣就為研究生命現(xiàn)象的基本問(wèn)題提供了豐富的資料。在利用這些資源探討諸如生命的起源、生物進(jìn)化、生物與環(huán)境的關(guān)系、改造 海洋生 物以為人類服務(wù)(如生產(chǎn)某種藥物)時(shí)離不開(kāi)對(duì)生物核 酸的研究。對(duì)于海洋 來(lái)源的 動(dòng)物、植物、微生物由于其不同于陸生生物的組織和細(xì)胞結(jié)構(gòu)特點(diǎn)往往采用不同的DNA提取方法。張海 琪 等31_在對(duì)不同方法保存的大黃魚(yú)(Pseudosciaen

25、a crocea)肌肉樣品 基 因組DNA進(jìn)行提取時(shí)發(fā)現(xiàn)，經(jīng)福爾馬林、乙醇及含有 EDTA的乙醇保存的 樣品 可以同鮮活樣品和冷凍樣品一樣獲得基因組 DNA,但相比之下采用乙醇作 為固 定劑更方便快速，所提取的DNA用于RAPD分析，獲得了滿意的效果。 楊文新 等32利用75%的乙醇固定鮑魚(yú)(Haliotis discus)樣本并進(jìn)行DNA的提 取，證 明用乙醇固定海洋動(dòng)物組織是一種切實(shí)可行的方法，材料處理后可同 步提取，增 加了實(shí)驗(yàn)的同步性、可比性，適用于大量樣本的提取。由于組織中含 有許多DNA酶，絕大多數(shù)DNA酶需要一個(gè)二價(jià)陽(yáng)離子作 為輔助因子，因此采 用含適量 EDTA的乙醇固定劑是野

26、外標(biāo)本采集和運(yùn)輸?shù)囊环N更簡(jiǎn)便有效的方 法。韓兵社等33:針對(duì)傳統(tǒng)的有機(jī)溶劑提取工藝進(jìn)行改進(jìn)，應(yīng)用多種萃取液體系 從廢棄物就魚(yú)肝臟中提取核酸，與原工藝相比，核酸提取產(chǎn)量提高30%-60% ,整體工藝得到簡(jiǎn)化，而且避免了有機(jī)物的殘留。赤潮是在特定的環(huán)境前提條件下，海水中的某些浮游生物、原生動(dòng)物或細(xì)菌爆發(fā)性增殖或高度聚集而引起水體變色的一種有害生態(tài)現(xiàn)象，對(duì)海洋漁業(yè)、水產(chǎn)資源以及人類的健康造成很大的威脅。發(fā)生赤潮的生物類型主要為藻類，銅綠微囊藻(Microcytis aeruginosa)是造成赤潮的藻類之一。陸源等34用乙醇乙醴混合液對(duì)純化的銅綠微囊藻作預(yù)處理，破壞了其膠質(zhì)鞘，從而使蛋白酶K和SDS

27、能更好地直接作用于其細(xì)胞壁，細(xì)胞內(nèi)的DNA釋放完全，提高了總 DNA的得率。通過(guò)提取獲得的DNA有助于開(kāi)展對(duì)有害藻類的 研究，為防范赤 潮提供依據(jù)。在對(duì)紫菜(Porphyras p.)進(jìn)行DNA提取時(shí)，郭寶太等35先用海螺酶處理 樣品制備紫菜體細(xì)胞，然后用 SDS和蛋白酶K裂解細(xì)胞提取總DNA,再用 Wizard DNA clean-up;樹(shù)脂進(jìn)行純化。經(jīng)海螺酶處理的紫菜細(xì)胞 解決了通常采 用的液氮破碎細(xì)胞后裂解物勃稠、DNA得率低且有嚴(yán)重的多糖污染等難題。但 這種方法對(duì)植物組織需求量較多，不適于個(gè)體體積小的紫菜。劉必謙等36采用美國(guó)Roche公司的DNA Isolation Kit for

28、Cell and Tissue和上海生工公司的 UNIQ- 10小量柱式基因組DNA提取試劑盒對(duì)個(gè)體體積較小的圓紫菜(Porphyra suborbiculato卜鐵釘菜(Ishige okamurae)等進(jìn)行DNA 的提取，獲得高純度的 基因組DNA,完全能滿足酶切片段長(zhǎng)度多態(tài)性 (Amplified Fragment Length Polymorphism, AFLP)技術(shù)的需要。陳子 桂 等371以海洋尾絲蟲(chóng)(Uronema marinum)為材料，針對(duì)纖毛蟲(chóng)難以建 立培養(yǎng)以及個(gè)體豐度不高等特點(diǎn)，就微量條件下提取DNA的方法進(jìn)行了探討，成功地獲得了活體直接提取、活體酚 /氯仿抽提、固定標(biāo)

29、本直接提取以及固定標(biāo) 本酚/氯仿抽提等四種簡(jiǎn)便有效的微量 DNA提取方法，解決了纖毛蟲(chóng)微量 DNA 提取的困難。綜合DN A的提取方法，雖然不同生物DNA的提取方法不盡相同，但各種提 取方法也有很多相通之處，可以相互借鑒。隨著生物技術(shù)的飛速發(fā)展，對(duì)這 一 技術(shù)的經(jīng)驗(yàn)總結(jié)將會(huì)越來(lái)越多，一些生物領(lǐng)域新的DNA提取方法也將逐漸固DNA.定下來(lái)，更為簡(jiǎn)捷、高效的方法也必將出現(xiàn)，為基因工程提供更高純度的CTAB法原理（植物DNA提取經(jīng)典方法）CTAB （ h exadecvl tri methyl a mmonium bromide. 十六燒范 三甲基溪化錢是一種陽(yáng)離子去污劑,可溶解細(xì)胞膜， 并與核酸形

30、成復(fù)合物。該復(fù)合物在高鹽溶液中（>0.7mol/LNaCl）是可溶的，核 討有機(jī)溶劑抽提.去除蛋白.多地.甑類等雜質(zhì)后加入乙 斛或異內(nèi)醉沉淀即可使核酸分離出來(lái)）注：CTAB洛淞在低于15。時(shí)會(huì)形成沆江折出.因此在將其加入冰療 的植物材科之刖必很預(yù)熱.H離心耳溫度小要低才15 c.除蛋白質(zhì):氯仿/異戊醇抽提以偽對(duì)侵上門成知片仙H波，!?！皺C(jī) 心川的分a：異膻解劇什曲卜浦除抽提過(guò)以中出現(xiàn)的氣泡）.，使用變性劑變性，sis,甘情帆內(nèi)依等,，高鹽洗滌，蛋白府處理：.14*>0PVP聚乙烯毗咯烷SO是的的絡(luò)合物，能叮多酚 形成一種不溶的結(jié)合物質(zhì)，有效去除多酚,減少 DNA中價(jià)的污染；同時(shí)它也

31、能和多糖結(jié)合,有效 去除多糖。CT A B提取級(jí)次液的統(tǒng)妝配方 WHO （pH8.0）擢供 個(gè)諼沖環(huán)埴，防止核魔被破壞1 EDTA聯(lián)介Mg?忠或MW忠丁,抑:WDNase活懼.NMI提供個(gè)防鹽”收.使DNP先分淵MT,存右J液相中: CTAB潮岬制胭聯(lián)并結(jié)介收糧.使桎糕伙于分崗， B維基乙的是抗?jié)饣?有效地防d晌H化成池,超免灼交使的容易去除除多糖:高鹽法：用乙醉沉淀時(shí),在持沉淀溶液中加入1/2體積 的5MN&CL高鹽可溶豺多糖.用多相木解腦將多帖降解.一在:提取緩沖液中加一定量的氟木（1/2體積），氯米可以 與多袖的羥基作用，從而去除多糖。除酚類物質(zhì):，在抽提液中加入防止的類氣化的

32、試劑，|“筑址 乙醉、抗壞血酸、半胱氮根、.硫蘇精醉等,加入易與酚類結(jié)合的試劑：如PVP、PEG（聚乙二 即），它們與酚類有較強(qiáng)的親和力,可防止酚類 與DNA的結(jié)合除鹽離子:70%的乙醛洗法TE中成分的作用, TE中的EDTA能螯和Mp或MN離子,抑制DNase，pH值為8.0.可防止DNA發(fā)生版解J j工加,力C區(qū)注意的問(wèn)題DNA玩淀，用乙齡或異內(nèi)的都可以，R內(nèi)刑沉沆的效率要高J無(wú)水乙 K .試?yán)渲兄晃?.64;體根的界內(nèi)B7沉沁而力裳2k；體 稅的無(wú)水乙析伴足棄內(nèi)桁沉淀衣?lián)P柑小成分超沉淀， ILaDNA沉淀中弄西B?虛以押發(fā)除去.DNAAi Uk I DNA. il乙肝允分揮發(fā).ZA/斛；

33、若長(zhǎng)期儲(chǔ)存建議使用TE緩沖液溶也DNA提取常見(jiàn)問(wèn)題%題一，DNA樣品不純，抑制后續(xù)酹解和PCR反應(yīng).1. DNA中*W. >* >»山»2. DNAR»*5T, WW 0磯，«WW« me*3. DMA*MLWW*«* 子4. #RNA婚安， «Mft1UDNAv 姓G*除一白、 0-T *>H9U<DNA, If *3d70% 乙次盤(2-3*) 加入RNastRMR'港 問(wèn)題二工DNA降解.問(wèn)題三士 DNA提取量少.1.(Q*)_二,Td i *, ,>111）學(xué)習(xí)并掌握動(dòng)物組織總

34、DNA的提取方法及其原理。（2）從肝臟組織中提取到一定量的純凈的DNA樣品?！緦?shí)驗(yàn)原理】DNA是一切生物細(xì)胞 的重要組成成分，主要存在于細(xì)胞核中 。通過(guò)研磨和SDS作用破碎 細(xì)胞；苯酚和氯仿可 使蛋白質(zhì)變性，用其混合液（酚：氯仿： 異戊醇）重復(fù)抽提，使蛋白 質(zhì)變性，然后離心除 去變性蛋白質(zhì)；RNase降解RNA ,從而得到純凈的DNA分子。 【儀器、材料、試劑】 （一）儀器1 .高速離心機(jī)2 .烘箱3 .冰箱4 .水浴鍋5 .微量移液器6 .高壓滅菌鍋 （二）材料1 ,生理鹽水2 .十二烷基硫酸鈉（SDS ）3 .三羥甲基氨基甲烷 （Tris）4 .乙二胺四乙酸（EDTA）5 .飽和酚6 .氯

35、仿7 .異戊醇8 .無(wú)水乙醇9 . 75%乙醇10 .蛋白酶K11 . RNase 酶12 .手術(shù)剪刀、鐐子、 吸水紙13 .微量取液器14 .研缽、1.5mL離心管、一次性手套、1.5mL離心管架、記號(hào)筆（三）試劑配制1. Tris -HCL 1mol/L PH8.0 50ml配制方法：40ml雙蒸水，6.057g固體Tris放入燒杯中溶解，用濃鹽酸調(diào)PH值到8.0,轉(zhuǎn)移到50ml容量瓶中，加入雙蒸 水定容，搖勻后，轉(zhuǎn)到準(zhǔn)備好的輸液瓶中，貼上標(biāo)簽，高壓滅菌后，降至室溫，4 c保存?zhèn)溆谩?,生理鹽水：0.85%NaCL 100ml配制方法：在20ml雙蒸水中溶解 0.85g固體NaCL ,加水

36、定容至100ml ,搖勻后，轉(zhuǎn)到準(zhǔn)備好的輸液 瓶中，貼上標(biāo)簽，高 壓滅菌后，B等至室溫,4 c保存?zhèn)溆谩?. EDTA 0.5mol/L PH8.0 50ml配制方法：將9.08g的EDTA Na2 - 2H2O溶解于40ml雙蒸水，用1g的NaOH顆粒（慢慢逐步加入） 調(diào)PH值到8.0 ,用50ml容量瓶定容，如果 EDTA難溶，先加NaOH溶解，然后逐步加 EDTA- Na2 2H2O。4. TES緩沖液（釋放DNA） 100ml配制方法：將0.5844g 的5 mol/lNaCl溶解于80ml雙蒸水，在分別加入 1ml的0.5 mol/l EDTA、0.2ml的Tris-HCl （pH=8.