微載體培養(yǎng)技術

1、微載體培養(yǎng)技術(microcarrier culture technique)一、微載體培養(yǎng)應用此技術于1967 年被用于動物細胞大規(guī)模培養(yǎng)。經(jīng)過三十余年的發(fā)展，該技術目前已漸日趨完善和成熟，并廣泛應用于生產(chǎn)疫苗、基因工程產(chǎn)品等。 微載體培養(yǎng)是目前公認的最有發(fā)展前途的一種動物細胞大規(guī)模培養(yǎng)技術，其兼具懸浮培養(yǎng)和貼壁培養(yǎng)的優(yōu)點，放大容易。目前微載體培養(yǎng)廣泛用于培養(yǎng)各種類型細胞，生產(chǎn)疫苗、蛋白質(zhì)產(chǎn)品，如293 細胞、成肌細胞、Vero 細胞、 CHO 細胞。使用較多的反應器有兩種： 貝朗公司的 BIOSTAT?B反應器，使用雙槳葉無氣泡通氣攪拌系統(tǒng)；NBS 公司的 CelliGen、 CelliG

2、enPlusTM 和 Bioflo3000 反應器，使用 Cell-lift 雙篩網(wǎng)攪拌系統(tǒng)。兩種系統(tǒng)都能實現(xiàn)培養(yǎng)細胞和收獲產(chǎn)物的有效分離。二、微載體 是指直徑在 60-250 m，能適用于貼壁細胞生長的微珠。一般是由天然葡聚糖或者各種合成的聚合物組成。自 Van Wezel 用 DEAE-Sephadex A 50 研制的第一種微載體問世以來， 國際市場上出售的微載體商品的類型已經(jīng)達十幾種以上，包括液體微載體、 大孔明膠微載體、聚苯乙烯微載體、PHEMA 微載體、甲殼質(zhì)微載體、聚氨酯泡沫微載體、藻酸鹽凝膠微載體以及磁性微載體等。常用商品化微載體有三種： Cytodex1、2、3，Cytopo

3、re 和 Cytoline 。微載體的大小：增大單位體積內(nèi)表面積（S/F）對細胞的生長非常有利。使微載體直徑盡可能小，最好控制在 100-200 m 之間。微載體的密度：一般為1.03-1.05g/cm2 ，隨著細胞的貼附及生長，密度可逐漸增大。微載體的表面電荷：據(jù)研究， 控制細胞貼壁的基本因素是電荷密度而不是電荷性質(zhì)。若電荷密度太低，細胞貼附不充分，但電荷密度過大，反而會產(chǎn)生“毒性”效應。三、微載體培養(yǎng)原理與操作1.原理：其原理是將對細胞無害的顆粒-微載體加入到培養(yǎng)容器的培養(yǎng)液中，作為載體，使細胞在微載體表面附著生長，同時通過持續(xù)攪動使微載體始終保持懸浮狀態(tài)。貼壁依賴性細胞在微載體表面上的增

4、殖， 要經(jīng)歷黏附貼壁、 生長和擴展成單層三個階段。 細胞只有貼附在固體基質(zhì)表面才能增殖， 故細胞在微載體表面的貼附是進一步鋪展和生長的關鍵。黏附主要是靠靜電引力和范德華力。 細胞能否在微載體表面黏附， 主要取決于細胞與微載體的接觸概率和相融性。2. 攪拌轉速：由于動物細胞無細胞壁，對剪切力敏感，因而無法靠提高攪拌轉速來增加接觸概率。通常的操作方式是：在貼壁期采用低攪拌轉速，時攪時停；數(shù)小時后，待細胞附著于微載體表面時，維持設定的低轉速，進入培養(yǎng)階段。微載體培養(yǎng)的攪拌非常慢，最大速度75r/min 。3.細胞與微載體的相融性，是與微載體表面理化性質(zhì)有關。一般細胞在進入生理表面帶負電荷。 若微載體

5、帶正電荷， 則利用靜電引力可加快細胞貼壁速度。PH 值時，若微載體帶負電荷，因靜電斥力使細胞難于黏附貼壁，但培養(yǎng)液中溶有或微載體表面吸附著二價陽離子作為媒介時，則帶負電荷的細胞也能貼附。4. 細胞在微載體表面的生長影響細胞在微載體表面生長的因素很多，主要有三個方面。在細胞方面，如細胞群體、狀態(tài)和類型。在微載體方面， 如微載體表面狀態(tài)、 吸附的大分子和離子； 微載體表面光滑時細胞擴展快，表面多孔則擴展慢。在培養(yǎng)環(huán)境中，如培養(yǎng)基組成、溫度、 pH、 DC 以及代謝廢物等均明顯影響細胞在微載體上的生長。如果所處條件最優(yōu)，則細胞生長快；反之生長速度慢。5. 微載體培養(yǎng)操作要點培養(yǎng)初期：保證培養(yǎng)基與微球

6、體處于穩(wěn)定的 PH 與溫度水平，接種細胞（對數(shù)生長期，而非穩(wěn)定期）至終體積 1/3 的培養(yǎng)液中， 以增加細胞與微載體接觸的機會。 不同的微載體所用濃度及接種細胞密度是不同的。常使用 2-3g/L 的微載體含量，更高的微載體濃度需要控制環(huán)境或經(jīng)常換液。貼壁階段 （ 3-8d）后，緩慢加入培養(yǎng)液至工作體積， 并且增加攪拌速度保證完全均質(zhì)混合。培養(yǎng)維持期：進行細胞計數(shù)（胞核計數(shù)） 、葡萄糖測定及細胞形態(tài)鏡檢。隨意細胞增殖，微球變得越來越重，需增加攪拌速率。經(jīng)過 3d 左右，培養(yǎng)液開始呈酸性，需換液：停止攪拌，讓微珠沉淀5min ，棄掉適宜體積的培養(yǎng)液，緩慢加入新鮮培養(yǎng)液（37），重新開始攪拌。收獲細

7、胞：首先排干培養(yǎng)液，至少用緩沖液漂洗1 遍，然后加入相應的酶，快速攪拌（ 75-125r/min ） 20-30min 。然后解離收集細胞及其產(chǎn)品。微載體培養(yǎng)的放大：可以通過增加微載體的含量或培養(yǎng)體積進行放大。使用異倍體或原代細胞培養(yǎng)生產(chǎn)疫苗、干擾素，已被放大至4000L 以上。四、微載體大規(guī)模細胞培養(yǎng)的生物反應器系統(tǒng)此技術大規(guī)模培養(yǎng)，細胞擴增的效率受到諸多因素的影響和限制，其中主要的限制性因素包括：細胞對剪切力的敏感性、氧的傳遞以及傳代和擴大培養(yǎng)等。 而研制的各種類型生物反應器系統(tǒng)則可針對上述限制性因素，為微載體細胞培養(yǎng)與擴增提供低剪切力、高氧傳遞效率、 易于細胞傳代等適宜的外部環(huán)境。已較多

8、使用的微載體培養(yǎng)系統(tǒng)生物反應器，可以實行計算機控制操作， 培養(yǎng)攪拌速度及懸浮均勻程度、溫度變化、 PH 穩(wěn)定及溶氧供應（O2、N2、 CO2、空氣四種純化氣體按比例調(diào)節(jié)）、罐壓、培養(yǎng)體積和通氣量等參數(shù)全部由電腦自動控制。因此，應用生物反應器系統(tǒng)進行微載體細胞大規(guī)模擴增具有明顯優(yōu)勢， 目前國外相繼研制了數(shù)種適合進行微載體大規(guī)模細胞培養(yǎng)的生物反應器系統(tǒng)，如攪拌式生物反應器系統(tǒng)、 旋轉式生物反應器系統(tǒng)以及灌注式生物反應器系統(tǒng)等。1、攪拌式生物反應器系統(tǒng)攪拌式生物反應器系統(tǒng)在微載體細胞大規(guī)模擴增研究領域已有較長的研究歷史， 但因該細胞培養(yǎng)系統(tǒng)容易產(chǎn)生過大的剪切力， 從而限制了其應用范圍。 盡管如此，

9、由于該系統(tǒng)具有簡單、 實用及價格低廉等特點， 國內(nèi)外仍有不少應用該系統(tǒng)成功進行細胞大規(guī)模擴增的研究報道。例如， Werner A（ 2000 年）成功地在該系統(tǒng)內(nèi)進行了肝細胞大規(guī)模擴增的研究。2、灌注式生物反應器系統(tǒng)灌流培養(yǎng)是目前研究熱點之一。它的特點是不斷地加入新鮮培養(yǎng)基以及不斷地抽走含細胞代謝廢物的消耗培養(yǎng)基，使細胞得以在一個相對穩(wěn)定的生長環(huán)境內(nèi)增殖，即省時省力，又減少了細胞發(fā)生污染的機會，且可以提高細胞密度10 倍以上。3、旋轉生物反應器近年來，旋轉生物反應器系統(tǒng)（RCCS）已經(jīng)成為應用微載體技術進行細胞大規(guī)模擴增的一種較常用細胞培養(yǎng)系統(tǒng)。 該系統(tǒng)是基于美國航空航天局為模擬空間微重力效應而設計的一種生物反應器。 RCCS既可以用于微載體大規(guī)模細胞培養(yǎng)，又能在其內(nèi)培育細胞與支架形成的三維空間復合體。 至今，近百種組織細胞均在該系統(tǒng)內(nèi)成功進行了大規(guī)模擴增。五、微載體培養(yǎng)優(yōu)點