蛋白酶活性的測定

1、 實驗四蛋白酶活力的測定 一、 實驗目的 1、 了解蛋白酶活力測定的原理； 2、 掌握蛋白酶活力測定的方法。 二、 實驗原理 蛋白酶在一定條件下不僅能夠水解蛋白質中的肽鍵， 也能夠水解酰胺鍵和酯 鍵，因此可用蛋白質或人工合成的酰胺及酯類化合物作為底物來測定蛋白酶的活 力。 本實驗選用酪蛋白為底物，測定微生物蛋白酶水解肽鍵的活力。 酪蛋白經蛋 白酶作用后，降解成相對分子質量較小的肽和氨基酸， 在反響混合物中參加三氯 醋酸溶液，相對分子質量較大的蛋白質和肽就沉淀下來， 相對分子質量較小的肽 和氨基酸仍留在溶液中，溶解于三氯醋酸溶液中的肽的數量正比于酶的數量和反 應時間。在280nm波長下測定溶液吸

2、光度的增加，就可計算酶的活力。 三、 實驗試劑 微生物蛋白酶萃取液 0.01g/ml：稱取1.0g酶制劑，加100ml蒸僻水攪拌 30min,在4C下離心別離后，將上層活夜置于冰箱中保存，使用前稀釋一定倍 數； 0.02mol/L磷酸鹽緩沖液pH7.5; 1%酪蛋白溶液：取1.0g酪蛋白，加100ml 0.2mol/L磷酸鹽緩沖液PH7.5, 加熱并攪拌使它完全分散，然后置于冰箱中保存； 5%三氯醋酸TCA溶液。 四、 實驗步驟 1、 將5%TCA溶液和1%酪蛋白溶液在37CT保溫。 2、 取四支15ml具塞試管，分別標上記號 A1、A0、B1和B0。在A1和A0試管 中各吸入0.20ml酶液

3、，在B1和B0試管中各吸入0.40ml酶液，分別用0.2mol/L 磷酸鹽緩沖液定容至2.00ml。在A0和B0試管中各吸入6.00ml5%三氯醋酸溶液， 上述四支試管都置丁 37 C水浴中保溫。 3、 在各試管中吸入2.00ml 1%酪蛋白溶液，在37C下保溫10min 準確計時 后，再向A1和B1試管中吸入6.00ml5%三氯醋酸溶液。 4、 將試管從水浴中取出，在室溫下放置 1h,用少量上活液潤濕濾紙后過濾，保 留濾出液。 5、在280nm波長下，分別以A0和B0濾液為空白，測定 A1和B1濾液的吸光 度。 五、計算 1、 在規(guī)定的實驗條件下，以每分鐘增加 0.001吸光度定義為一個酶單

4、位。 2、 每克酶制劑中酶活力的計算： ?A X 1000 / t X w 酶活力單位/克酶制劑 式中，？A樣品與空白吸光度差值即 A1和B1的吸光值；t 酶作用 時間本實驗為10min； w - 反響中酶的用量，g 六、 說明 1、 微生物蛋白酶粗提取液在較寬廣的 PH范圍表現出活力，但是在接近中性條 件下最有最周活力。 2、 微生物蛋白酶在45 C以下可保持較長時間的穩(wěn)定性。 七、 思考題 1、 蛋白酶有哪幾類？ 2、 影響酶活力的因素有哪些？ 3、 使用紫外分光光度計時應注意哪些問題？ 六、數據記錄與處理 A1 = 0.279 B1 = 0.573 酶含量為 0.001g/ml 酶活力

5、1 = ?A X 1000 / t X w =0.279 X 1000/10/0.001/0.20=1.395 酶活力 2= ?A x 1000 / t X w =0.573 x 1000/10/0.001/0.40=1.4325 5酶活匆m /克酶制 劑 平均值=1.395 X 51+ 1.4325 X 510=141375酶活力單位/克酶制劑 平均相對相差=143250 - 139500 /141375 X 100%=2.65% 七、思考題 1、 蛋白酶有哪幾類? 答：按蛋白酶水解蛋白質的方式：A內肽酶：切開蛋白質分子內部肽鍵， 生成相對分子質量較小的多肽類；B外肽酶：切開蛋白質或多肽分子

6、氨基或?；?末端的肽鍵，而游離出氨基酸的酶類；C水解蛋白質或多肽的酯鍵；D水解蛋白 質或多肽的酰胺鍵。按酶的來源可分為：動物蛋白酶、植物蛋白酶、微生物蛋 白酶 微生物蛋白酶乂可分為：細菌蛋白酶、霉菌蛋白酶、酵母蛋白酶和放線菌蛋白 防 按蛋白酶作用的最適PH可以分為A PH2.55.0的酸性蛋白酶，B PH9.510.5的堿性蛋白酶，C PH78的中性蛋白酶 2、 影響酶活力的因素有哪些？ 答：酶活力是酶催化某一化學反響的速率來表示的。防活力的大小即酶含量 的多少，可以用每克酶制劑或每毫升酶制劑含有多少酶單位來表示， 防活力的測 定也就是測定酶促反響的速率。 酶濃度對酶活力的影響：防促反響速率與

7、酶分子的濃度呈正比， 在一定范 圍內，當底物分子濃度足夠時，酶分子越多，底物轉化的速度越快。 底物濃度對酶活力的影響：假設酶的濃度為定值，底物的起始濃度越低時， 酶促反響速度與底物濃度呈正比，即隨底物濃度的增加而增加。當所有的酶與底 物結合生成中間產物后，即使再增加底物濃度，中間產物濃度也不會增加，防促 反響速度也不會增加。 溫度對酶活力的影響：在適宜的溫度范圍內，防促反響速度隨溫度升高而 增加，超過最適反響溫度，酶活力將會下降。 PH對酶活力的影響：酶在最適 PH范圍內表現出活性，大丁或小丁最適 PH,都會降低酶活性。 激活劑對酶活力的影響：某些無機陽離子、陰離子、有機化合物可作為激 活劑，能夠激活酶，使其表現出催化活性或強化其催化活性。 抑制劑對酶活力的影響：酶的抑制劑能夠減弱、抑制甚至破壞酶的活力， 它可降低酶促反響速度。 3、使用紫外分光光度計時應注意哪些問題？ 答：使用的比色皿必須潔凈，并注意配對使用。手指應拿毛玻璃面的兩側， 裝盛樣品量