生化方法學(xué)及儀器應(yīng)用

1、生化檢測(cè)方法及儀器應(yīng)用兩點(diǎn)法：測(cè)定酶反應(yīng)開(kāi)始后某一時(shí)間（tl到t2）產(chǎn)物或底物濃度的總變化量以求取酶反應(yīng)初速度的方法。終點(diǎn)法：通過(guò)測(cè)定酶反應(yīng)開(kāi)始到反應(yīng)達(dá)到平衡時(shí)產(chǎn)物或底物濃度總變化量，以求出酶活力的方法，亦稱(chēng)平衡法。 速率法：是指連續(xù)測(cè)定（每15秒、1分鐘監(jiān)測(cè)一次）酶反應(yīng)過(guò)程中某一反應(yīng)產(chǎn)物或底物的濃度隨時(shí)間的變化來(lái)求出 酶反應(yīng)的初速度的方法，即連續(xù)監(jiān)測(cè)法。一、常用生化檢測(cè)項(xiàng)目分析方法舉例1. 終點(diǎn)法檢測(cè)常用的有總膽紅素（氧化法或重氮法）、結(jié)合膽紅素（氧化法或重氮法）、血清總蛋白（雙縮腮 法）、血清白蛋白（漠甲酚氯法）、總膽汁酸（酶法）、葡萄糖（葡萄糖氧化酶法）、尿酸（尿酸酶法）、總膽固醇（膽固

2、醇負(fù)化酶法）、甘油三酯（磷酸甘油氧化酶酚法）、高密度脂蛋白膽固醇（直接測(cè)定法）、鈣（偶氮碑III法）、 磷（紫外法）、鎂（二甲苯胺藍(lán)法）等。以上項(xiàng)目中，除鈣、磷和鎂基本上還使用單試劑方式分析因而采用一點(diǎn) 終點(diǎn)法外，其它測(cè)定項(xiàng)目都可使用雙試劑故能選用兩點(diǎn)終點(diǎn)法，包括總蛋白、白蛋白測(cè)定均已有雙試劑可用。2. 固定時(shí)間法苦味酸法測(cè)定肌肝采用此法。（兩點(diǎn)法）3. 連續(xù)監(jiān)測(cè)法（速率法）對(duì)于酶活性測(cè)定一般應(yīng)選用連續(xù)監(jiān)測(cè)法，如丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶、天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶、 乳酸脫氫酶、堿性磷酸酹、Y谷氨氨?；D(zhuǎn)移酶、淀粉酶和肌酸激酶等。一些代物酶法測(cè)定的項(xiàng)目如己糖激酹法 測(cè)定葡萄糖、腿酶偶聯(lián)法測(cè)定尿素等，也可用連續(xù)

3、監(jiān)測(cè)法。4. 透射比濁法透射比濁法可用于測(cè)定產(chǎn)生濁度反應(yīng)的項(xiàng)目，多數(shù)屬免疫比濁法，載脂蛋白、免疫球蛋白、補(bǔ)體、 抗"0"、類(lèi)風(fēng)濕因子，以及血清中的其他蛋白質(zhì)如前白蛋白、結(jié)合珠蛋白、轉(zhuǎn)鐵蛋白等均可用此法。二、分析參數(shù)設(shè)置分析儀的一些通用操作步驟如取樣、沖洗、吸光度檢測(cè)、數(shù)據(jù)處理等，其程序均已經(jīng)固化在存儲(chǔ)器里，用戶 不能修改。各種測(cè)定項(xiàng)目的分析參數(shù)（analysis paramete）大部分也已設(shè)計(jì)好，存于磁盤(pán)中，供用戶使用；目 前大多數(shù)生化分析儀為開(kāi)放式，用戶可以更改這些參數(shù)。生化分析儀一般另外留一些檢測(cè)項(xiàng)目的空白通道，由用 戶自己設(shè)定分析參數(shù)。因此必須理解各參數(shù)的確切意義。

4、一、分析參數(shù)介紹（一）必選分析參數(shù)這類(lèi)參數(shù)是分析儀檢測(cè)的前提條件，沒(méi)有這些參數(shù)無(wú)法進(jìn)行檢測(cè)。1. 試驗(yàn)名稱(chēng) 試驗(yàn)名稱(chēng)（test code）是指測(cè)定項(xiàng)目的標(biāo)示符，常以項(xiàng)目的英文縮寫(xiě)來(lái)表示。2. 方法類(lèi)型（也稱(chēng)反應(yīng)模式）方法類(lèi)型（assay）有終點(diǎn)法、兩點(diǎn)法、連續(xù)監(jiān)測(cè)法等，根據(jù)被檢物質(zhì)的檢測(cè)方 法原理選擇其中一種反應(yīng)類(lèi)型。3. 反應(yīng)溫度一般有3（TC、37乜可供選擇，通常固定為37°Co4. 主波長(zhǎng)主波長(zhǎng)（primary wavelength）是指定一個(gè)與被測(cè)物質(zhì)反應(yīng)產(chǎn)物的光吸收有關(guān)的波長(zhǎng)。5. 次波長(zhǎng)次波長(zhǎng)（secondary wavelength）是在使用雙波長(zhǎng)時(shí)，要指定一個(gè)與主波長(zhǎng)

5、、干擾物質(zhì)光吸收有關(guān) 的波長(zhǎng)。6. 反應(yīng)方向反應(yīng)方向（response direction）有正向反應(yīng)和負(fù)向反應(yīng)兩種，吸光度增加為正向反應(yīng)，吸光 度下降為負(fù)向反應(yīng)。7. 樣品量 樣品量（sampling volum） 一般是2u 135u 1,以0. 1 u 1步進(jìn)，個(gè)別分析儀最少能達(dá)到1.6叮。 可設(shè)置常量、減量和增量。8. 第一試劑量 第一試劑量（first regengt volum）般是20300 »1,以1 u 1步進(jìn)。9. 第二試劑量 第二試劑量（second regengt volum） 一般也是20300 ul,以1 U 1步進(jìn)。10. 總反應(yīng)容量 總反應(yīng)容量（tot

6、al reacting volum）在不同的分析儀有一個(gè)不同的規(guī)定圍，一般是180 350 ul,個(gè)別儀器能減少至120 ul.總反應(yīng)容量太少無(wú)法進(jìn)行吸光度測(cè)定。11. 孵育時(shí)間孵育時(shí)間（incubate time）在終點(diǎn)法是樣品與試劑混勻開(kāi)始至反應(yīng)終點(diǎn)為止的時(shí)間，在兩點(diǎn)法 是第一個(gè)吸光度選擇點(diǎn)開(kāi)始至第二個(gè)吸光度選擇點(diǎn)為止的時(shí)間。12. 延遲時(shí)間 延遲時(shí)間（delay time）在連續(xù)監(jiān)測(cè)法中樣品與反應(yīng)試劑（第二試劑）混勻開(kāi)始至連續(xù)監(jiān)測(cè)期 第一個(gè)吸光度選擇點(diǎn)之間的時(shí)間。13. 連續(xù)監(jiān)測(cè)時(shí)間 連續(xù)監(jiān)測(cè)時(shí)間(continuous monitoring time)在延遲時(shí)間之后即開(kāi)始，一般為6012

7、0s, 不少于4個(gè)吸光度檢測(cè)點(diǎn)(3個(gè)吸光度變化值)。14. 校準(zhǔn)液個(gè)數(shù)及濃度校準(zhǔn)曲線線性好并通過(guò)坐標(biāo)零點(diǎn)的，可采用一個(gè)校準(zhǔn)液(calibrator)；線性好但不通 過(guò)坐標(biāo)零點(diǎn)，應(yīng)使用兩個(gè)校準(zhǔn)液；對(duì)于校準(zhǔn)曲線呈非線性者，必須使用兩個(gè)以上校準(zhǔn)液。每一個(gè)校準(zhǔn)液都要有一個(gè) 合適的濃度。15. 校準(zhǔn)K值或理論K值 通過(guò)校準(zhǔn)得到的K值為校準(zhǔn)K值(calibrate coefficient)或由計(jì)算得出的K值為 理論K值。16. 線性圍即方法的線性圍(linearity range),超過(guò)此圍應(yīng)增加樣品量或減少樣品量重測(cè)。與試劑/樣品比 值有關(guān)。17. 小數(shù)點(diǎn)位數(shù)檢測(cè)結(jié)果的小數(shù)點(diǎn)位數(shù)(decimal poi

8、nt digit)。(二) 備選分析參數(shù)這類(lèi)分析參數(shù)與檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性有關(guān)，一般來(lái)說(shuō)不設(shè)置這類(lèi)分析參數(shù)，分析儀也能檢測(cè)出結(jié)果，但若樣品中 待測(cè)物濃度太高等，檢測(cè)結(jié)果可能不準(zhǔn)確。1. 樣品預(yù)稀釋設(shè)置樣品量、稀釋劑量和稀釋后樣品量三個(gè)數(shù)值，便可在分析前自動(dòng)對(duì)樣品進(jìn)行高倍稀釋。2. 底物耗盡值底物耗盡值(substrate exhaust limit)在負(fù)反應(yīng)的酶活性測(cè)定中，可設(shè)置此參數(shù)，以規(guī) 定一個(gè)吸光度下降限。若低于此限時(shí)底物已太少，不足以維持零級(jí)反應(yīng)而導(dǎo)致檢測(cè)結(jié)果不準(zhǔn)確。3. 前區(qū)檢查免疫比濁法中應(yīng)用，以判斷是否有抗原過(guò)剩。將終點(diǎn)法最后兩個(gè)吸光度值的差別(AA)設(shè)置一 個(gè)限值，如果后一點(diǎn)的吸光

9、度比前一點(diǎn)低，表示已有抗原過(guò)剩，應(yīng)稀釋樣品后重測(cè)。4. 試劑空白吸光度圍 超過(guò)此設(shè)定圍表示試劑已變質(zhì)，應(yīng)更換合格試劑。5. 試劑空白速率連續(xù)監(jiān)測(cè)法中使用，是試劑本身在監(jiān)測(cè)過(guò)程中沒(méi)有化學(xué)反應(yīng)時(shí)的變化速率。6. 方法學(xué)補(bǔ)償系數(shù)用于校準(zhǔn)不同分析方法間測(cè)定結(jié)果的一致性，有斜率和截距兩個(gè)參數(shù)。7. 參考值圍對(duì)超過(guò)此圍的測(cè)定結(jié)果，儀器會(huì)打印出提示。(三) 某些參數(shù)的特殊意義1. 最小樣品量最小樣品量是指分析儀進(jìn)樣針能在規(guī)定的誤差圍吸取的最小樣品量。一般分析儀的最小樣品量 是2P1,目前也有小至1.6u 1的。在樣品含高濃度代產(chǎn)物或高活性酶濃度的情況下往往需采用分析儀的最小樣品 量作為減量參數(shù)，從而使分析儀

10、檢測(cè)圍(與線性圍不同)的上限得以擴(kuò)大。2. 最大試劑量 方法靈敏度很高而線性上限低的檢測(cè)項(xiàng)目，如血清白蛋白的漠甲酚氯法測(cè)定，以往手工法操作 時(shí)樣品 10ul,試劑量4ml,這樣試劑量/樣品量比例(R/S)為200,線性上限則為60g/L。此法移植到分析儀上 后，R/S卻很難達(dá)到200,致使線性上限變低。因此對(duì)這類(lèi)檢測(cè)項(xiàng)目最大試劑量非常重要。3. 彈性速率在酶活性測(cè)定中，當(dāng)酶活性太高，在連續(xù)監(jiān)測(cè)期中已不呈線性反應(yīng)時(shí)，有些儀器具有彈性速率 (flexrate)功能，能自動(dòng)選擇反應(yīng)曲線上連續(xù)監(jiān)測(cè)期中仍呈線性的吸光度數(shù)據(jù)計(jì)算結(jié)果，使酶活性測(cè)定的線性圍得以擴(kuò)大。如AST可從1000U/L擴(kuò)展至4000U

11、/L,從而減少稀釋及重測(cè)次數(shù)、降低成本。4. 試劑空白速率 當(dāng)樣品中存在膽紅素時(shí)，膽紅素對(duì)戚性苦味酸速率法或兩點(diǎn)法測(cè)定肌軒有負(fù)干擾。因?yàn)槟懠t 素在肌肝檢測(cè)的波長(zhǎng)505nm有較高光吸收，而且膽紅素在堿性環(huán)境中可被氧化轉(zhuǎn)變，因而在肌肝反應(yīng)過(guò)程中膽紅素 的光吸收呈下降趨勢(shì)。若在加入第一試劑后一段時(shí)間設(shè)置試劑空白速率，因?yàn)榇硕沃锌辔端嵘形磁c肌軒反應(yīng)，而膽 紅素在第一試劑的堿性環(huán)境中已同樣被氧化轉(zhuǎn)變，因而以第二試劑加入后的速率變化，減去試劑空白速率變化，便 可消除膽紅素的負(fù)干擾，見(jiàn)圖7-8。二、單波長(zhǎng)和雙波長(zhǎng)方式(一) 概念采用一個(gè)波長(zhǎng)檢測(cè)物質(zhì)的光吸收強(qiáng)度的方式稱(chēng)為單波長(zhǎng)(mono-wavelength

12、)方式。當(dāng)反應(yīng)液中含有一種組分， 或在混合反應(yīng)液中待測(cè)組分的吸收峰與其它共存物質(zhì)的吸收波長(zhǎng)無(wú)重疊時(shí)，可以選用。在吸光度檢測(cè)中，使用一個(gè) 主波長(zhǎng)和一個(gè)次波長(zhǎng)的稱(chēng)雙波長(zhǎng)方式。當(dāng)反應(yīng)液中存在干擾物的較大吸收、從而影響測(cè)定結(jié)果的準(zhǔn)確性時(shí)，采用雙 波長(zhǎng)方式更好。(二) 雙波長(zhǎng)的作用雙波長(zhǎng)（di-wavelength）測(cè)定優(yōu)點(diǎn)是消除噪音干擾;減少雜散光影響;減少樣品本身光吸收的干擾。從光 源，到比色杯、單色器、檢測(cè)器的整個(gè)光路系統(tǒng)中，均存在著隨時(shí)間發(fā)生變化的不穩(wěn)定的檢測(cè)信號(hào)，即噪音，而雙 波長(zhǎng)檢測(cè)是同時(shí)進(jìn)行的，兩種波長(zhǎng)檢測(cè)產(chǎn)生的噪音基本上相同，因而能消除變音干擾。當(dāng)樣品中存在非化學(xué)反應(yīng)的 干擾物如甘油三酯

13、、血紅蛋白、膽紅素等時(shí)，會(huì)產(chǎn)生非特異性的光吸收，而干擾測(cè)定結(jié)果的準(zhǔn)確性。采用雙波長(zhǎng)方 式測(cè)定可以部分消除這類(lèi)干擾，提高檢測(cè)的準(zhǔn)確性。（三）次波長(zhǎng)的確定方法當(dāng)被測(cè)物的主波長(zhǎng)確定之后，再選擇次波長(zhǎng)。如根據(jù)甘油三酯等干擾物吸收光譜特征，選擇次波長(zhǎng)，使干擾物 在主、次波長(zhǎng)處有盡可能相同的光吸收值，而被測(cè)物在主、次波長(zhǎng)處的光吸收值應(yīng)有較大的差異。一般來(lái)說(shuō)，次波 長(zhǎng)應(yīng)大于主波長(zhǎng)lOOnmo以主波長(zhǎng)與次波長(zhǎng)吸光度差來(lái)計(jì)算結(jié)果。（四）雙波長(zhǎng)的具體應(yīng)用對(duì)于某些反應(yīng)速度快且無(wú)法設(shè)置為兩點(diǎn)終點(diǎn)法的分析項(xiàng)目，尤其是單試劑分析中，可以利用雙波長(zhǎng)的方式來(lái)部 分消除樣品本身的光吸收干擾。目前用單試劑法測(cè)定的項(xiàng)目應(yīng)用雙波長(zhǎng)的

14、為血清總蛋白（雙縮腮法）主波長(zhǎng)500nm, 次波長(zhǎng)576nm；血清白蛋白（謨甲酚氯法）主、次波長(zhǎng)分別為600和700nm；鈣（偶氮神【I【法）主、次波長(zhǎng)分別為660、 770nm；磷（紫外比色法）主、次波長(zhǎng)為340、405nm,鎂（二甲苯胺藍(lán)法）主、次波長(zhǎng)為505和600nm。三、單試劑和雙試劑方式反應(yīng)過(guò)程中只加一次試劑稱(chēng)單試劑方式，加兩次試劑便為雙試劑方式。目前的生化分析儀大多可用雙試劑方式 分析，其優(yōu)點(diǎn)是：可提高試劑的穩(wěn)定性，多數(shù)雙試劑混合成單一工作試劑時(shí)，其穩(wěn)定時(shí)間縮短；能設(shè)置兩點(diǎn)終 點(diǎn)法，來(lái)消除來(lái)自樣品本身的光吸收干擾；在某些項(xiàng)目檢測(cè)時(shí)能消除非特異性化學(xué)反應(yīng)的干擾。如血清ALT測(cè)定,

15、血清中的源性丙酮酸及其它酮酸也可與試劑中的指示酶（乳酸脫氫酶）起反應(yīng)，使結(jié)果偏高。若先加入缺乏a-爾 戊二酸的第一試劑，使其它酮酸與指示酶反應(yīng)之后再加入含有a-酮戊二酸的第二試劑，啟動(dòng)真正的ALT酶促反應(yīng) 生成丙酮酸，而丙酮酸與乳酸脫氫酶的反應(yīng)消耗的NAD+能真正反映ALT的活性，從而消除以上副反應(yīng)的影響。四、測(cè)定過(guò)程的自動(dòng)監(jiān)測(cè)各種自動(dòng)生化分析儀或多或少都具有對(duì)測(cè)定過(guò)程進(jìn)行各種監(jiān)測(cè)的功能，以便在沒(méi)有人"監(jiān)督"化學(xué)反應(yīng)的情況下 提高檢測(cè)的準(zhǔn)確性。高檔分析儀的監(jiān)測(cè)功能更強(qiáng)。1. 試劑空白監(jiān)測(cè)每種試劑都有一定的空白吸光度圍，試劑空白吸光度的改變往往提示著該試劑的變質(zhì)：如利用 Tr

16、inder反應(yīng)為原理的檢測(cè)試劑會(huì)因酚被氧化為醒而變?yōu)榧t色；堿性磷酸酶、丫一谷氨酰轉(zhuǎn)移酶、淀粉酶等檢測(cè)試 劑會(huì)因基質(zhì)分解出硝基酚或硝基苯胺而變黃；有些試劑久置后變渾濁。這些情況均可使空白吸光度升高。丙氨酸氨 基轉(zhuǎn)移酶、天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶等負(fù)反應(yīng)檢測(cè)項(xiàng)目，其試劑在放置過(guò)程中空白吸光度會(huì)因NADH自行氧化為NAD+而 下降等。 試劑空白的測(cè)定方法有兩種：每瓶試劑在使用前通過(guò)對(duì)試劑空白校準(zhǔn)來(lái)確定試劑空白吸光度，這種方 式適用于先取樣品后加試劑的分析儀。每個(gè)樣品測(cè)定前均檢測(cè)試劑空白吸光度，適用于先加試劑后取樣品的分析 儀。2. 試劑空白變化速率監(jiān)測(cè)一些酶試劑在反應(yīng)溫度下不穩(wěn)定，其空白吸光度可隨著時(shí)間逐漸

17、發(fā)生變化，這種變化 的主要原因與工具酶或輔酶的純度有關(guān)，且因試劑的組成和生產(chǎn)廠家的不同而不同。這種變化會(huì)影響測(cè)定結(jié)果的準(zhǔn) 確性，一般使結(jié)果偏高。如果設(shè)置此項(xiàng)監(jiān)測(cè)，分析儀在結(jié)果計(jì)算時(shí)會(huì)自動(dòng)減去試劑空白變化速率。在以監(jiān)測(cè)NAD（P） H減少為指示反應(yīng)的酶活性測(cè)定中，空白速率可監(jiān)測(cè)并消除由NADH自身氧化所造成的吸光度下降；在色素原為底 物的酶活性測(cè)定中，空白速率可監(jiān)測(cè)并消除底物自身分解造成的吸光度升高。有關(guān)空白速率監(jiān)測(cè)在膽紅素對(duì)堿性苦 味酸速率法測(cè)定肌軒負(fù)干擾消除中的作用，已如前述。3. 樣品信息監(jiān)測(cè) 由于樣品的溶血、脂濁、黃疸會(huì)對(duì)測(cè)定結(jié)果產(chǎn)生非化學(xué)反應(yīng)的干擾。根據(jù)溶血、脂濁、黃疸的 光譜吸收特性

18、，用雙波長(zhǎng)或多波長(zhǎng)檢測(cè)其性質(zhì)和程度，一般是測(cè)定樣品在eOOnm / 570n叭700nm/660nni和 505nm/480nm吸光度比值的大小來(lái)分別判斷樣品溶血、脂濁和黃疸程度。然后在結(jié)果計(jì)算時(shí)自動(dòng)減去這部分干擾， 這將有利于提高分析結(jié)果的可靠性。4. 結(jié)果可靠性監(jiān)測(cè)（1）終點(diǎn)監(jiān)測(cè)：終點(diǎn)法測(cè)定要判斷所選的測(cè)光點(diǎn)是否到達(dá)終點(diǎn)或平衡點(diǎn)。一些分析儀在所選終點(diǎn)后再選一個(gè)測(cè)光 點(diǎn)，比較這兩點(diǎn)吸光度的差異來(lái)判斷反應(yīng)是否到達(dá)終點(diǎn)。（2）線性期監(jiān)測(cè)：連續(xù)監(jiān)測(cè)法選擇時(shí)間一吸光度反應(yīng)曲線上的線性期來(lái)計(jì)算酶活性或被測(cè)物濃度，因此儀器要確 定此連續(xù)監(jiān)測(cè)期是否呈線性。其監(jiān)測(cè)方法為將連續(xù)監(jiān)測(cè)到的各吸光度值進(jìn)行線性回歸，

19、計(jì)算出各點(diǎn)的方差，根據(jù) 方差值的大小來(lái)判斷是否呈線性；取連續(xù)監(jiān)測(cè)期開(kāi)始若干點(diǎn)的變化速率與連續(xù)監(jiān)測(cè)期最后若干點(diǎn)的變化速率進(jìn)行 比較，來(lái)判斷是否為線性期。5. 底物消耗的監(jiān)測(cè)在連續(xù)監(jiān)測(cè)法測(cè)定酶活性時(shí)，如果在監(jiān)測(cè)期吸光度上升或下降超過(guò)其底物耗盡值，則說(shuō)明該 樣品酶活性非常高，底物將被耗盡，監(jiān)測(cè)期的吸光度將偏離線性，使測(cè)定結(jié)果不可靠。此時(shí)不打印結(jié)果或打印結(jié)果 同時(shí)也打印出底物耗盡提示，該樣品應(yīng)稀釋一定的倍數(shù)重新測(cè)定。此監(jiān)測(cè)對(duì)于采用負(fù)反應(yīng)分析酶活性的方法甚為重 要。見(jiàn)圖7-96. 方法線性圍監(jiān)測(cè)每種待測(cè)物分析都有一個(gè)可測(cè)定的濃度或活性圍，樣品結(jié)果若超過(guò)此圍，分析儀將顯示測(cè)定 結(jié)果超過(guò)線性圍的提示，多數(shù)分

20、析儀會(huì)自動(dòng)將樣品減量或增量重新測(cè)定。、分析方法分類(lèi)（一）終點(diǎn)法被測(cè)物質(zhì)在反應(yīng)過(guò)程中完全被轉(zhuǎn)變?yōu)楫a(chǎn)物，即達(dá)到反應(yīng)終點(diǎn)，根據(jù)終點(diǎn)吸光度的大小求出被測(cè)物濃度，稱(chēng)為終 點(diǎn)法（end essay）。實(shí)際上被測(cè)物并沒(méi)有完全被轉(zhuǎn)變，而只是與產(chǎn)物達(dá)到一個(gè)動(dòng)態(tài)的化學(xué)平衡，因此該法稱(chēng)為平 衡法更為恰當(dāng)。從時(shí)間-吸光度曲線來(lái)看，到達(dá)反應(yīng)終點(diǎn)或平衡點(diǎn)時(shí)，吸光度將不再變化。分析儀通常在反應(yīng)終點(diǎn) 附近連續(xù)選擇兩個(gè)吸光度值，求出其平均值計(jì)算結(jié)果，并可根據(jù)兩點(diǎn)的吸光度差來(lái)判斷反應(yīng)是否到達(dá)反應(yīng)終點(diǎn)。終 點(diǎn)法參數(shù)設(shè)置簡(jiǎn)單，反應(yīng)時(shí)間一般較長(zhǎng)，精密度較好。終點(diǎn)時(shí)間的確定：根據(jù)時(shí)間-吸光度曲線來(lái)確定，如Trinder反應(yīng)測(cè)定尿酸，反應(yīng)

21、曲線上35min時(shí)其吸光 度已趨向穩(wěn)定，因而可將5min作為反應(yīng)終點(diǎn)。根據(jù)被測(cè)物反應(yīng)終點(diǎn)，結(jié)合干擾物的反應(yīng)情況來(lái)確定，如在血清 白蛋白的澳甲酚綠法測(cè)定中，白蛋白與漠甲酚綠在10s很快完成反應(yīng)，之后a球蛋白和B球蛋白與漠甲酚綠發(fā)生" 慢反應(yīng)"，使反應(yīng)曲線上吸光度在10s后仍繼續(xù)緩慢上升，持續(xù)約達(dá)lOmin,因此終點(diǎn)時(shí)間應(yīng)采用1030s,而不應(yīng) 選擇lOmin。1. 一點(diǎn)終點(diǎn)法：在反應(yīng)到達(dá)終點(diǎn)，即在時(shí)間-吸光度曲線上吸光度不再改變時(shí)選擇一個(gè)終點(diǎn)吸光度值，這種方法 稱(chēng)為一點(diǎn)終點(diǎn)法（one point end essay）,其反應(yīng)曲線見(jiàn)圖7-3。其檢測(cè)結(jié)果的計(jì)算公式是：待測(cè)物濃度C

22、U=（待測(cè)吸光度AU試劑空白吸光度AB） XK。 K為校準(zhǔn)系數(shù)，詳見(jiàn)第五節(jié)二操作方法。2. 兩點(diǎn)終點(diǎn)法：在被測(cè)物反應(yīng)或指示反應(yīng)尚未開(kāi)始時(shí)，選擇第一個(gè)吸光度，在反應(yīng)到達(dá)終點(diǎn)或平衡時(shí)選擇第二 個(gè)吸光度，此兩點(diǎn)吸光度之差用于計(jì)算結(jié)果，稱(chēng)為兩點(diǎn)終點(diǎn)法（two point end essay）,其反應(yīng)曲線見(jiàn)圖7-4。 計(jì)算公式為CU=（待測(cè)吸光度A2待測(cè)吸光度Al） XK。該法能有效地消除溶血（hemolysis）、黃疸（icterus） 和脂濁（lipo-turbid）等樣品本身光吸收（見(jiàn)圖7-5）造成的干擾。在單試劑分析加入試劑的初期、或雙試劑分 析中第二試劑加入之初，若指示反應(yīng)吸光度尚未明顯變化，

23、則可在此時(shí)選擇第一個(gè)吸光度，在指示反應(yīng)終點(diǎn)時(shí)選擇 第二個(gè)吸光度，從而設(shè)置成兩點(diǎn)終點(diǎn)法。但指示反應(yīng)初期吸光度無(wú)明顯變化的化學(xué)反應(yīng)較少，如單試劑方式測(cè)定總 蛋白、白蛋白、鈣、磷、鎂等的終點(diǎn)法分析項(xiàng)目，及雙試劑方式測(cè)定葡萄糖、總膽固醇、甘油三酯等的終點(diǎn)法分析 項(xiàng)目，因反應(yīng)初期吸光度已有明顯變化，因而均難以用上述方式設(shè)置兩點(diǎn)終點(diǎn)法。但在雙試劑分析中，如果將第一 吸光度選擇在第二試劑加入前，此時(shí)指示反應(yīng)一般尚未開(kāi)始，則能容易設(shè)置兩點(diǎn)終點(diǎn)法。在此要注意必須將兩次讀 吸光度時(shí)不同比色液體積進(jìn)行校正。目前全自動(dòng)分析儀均具有此自動(dòng)校正功能，不必手工進(jìn)行校正。（二）固定時(shí)間法指在時(shí)間-吸光度曲線上選擇兩個(gè)測(cè)光點(diǎn)，

24、此兩點(diǎn)既非反應(yīng)初始吸光度亦非終點(diǎn)吸光度，這兩點(diǎn)的吸光度差值 用于結(jié)果計(jì)算，稱(chēng)為固定時(shí)間法（fixed-time essay）,反應(yīng)曲線見(jiàn)圖7-6o其計(jì)算公式與兩點(diǎn)終點(diǎn)法相同，為 CU=（A2-Al）XKo有時(shí)也稱(chēng)此法為兩點(diǎn)法。該分析方法有助于解決某些反應(yīng)的非特異性問(wèn)題。例如：苦味酸法測(cè)定肌軒，反應(yīng)的最初30s,血清中快.反應(yīng)干擾 物（如微生物、丙酮酸、乙酰乙酸等）能與堿性苦味酸反應(yīng)；在第二個(gè)30s時(shí)戚性苦味酸主要與肌肝反應(yīng)，且此段 時(shí)間一吸光度曲線的線性較好（故也可用連續(xù)監(jiān)測(cè)法測(cè)定肌肝）；在80120s及其以后，戚性苦味可與蛋白質(zhì)以及 其它慢反應(yīng)干擾物反應(yīng)。這樣選用反應(yīng)的第二個(gè)30s為測(cè)定時(shí)間

25、，既避免了快反應(yīng)物質(zhì)的干擾，也避免了慢反應(yīng)物 質(zhì)的影響，使肌肝濃度與吸光度變化呈良好的線性關(guān)系，有利于提高分析的特異性和準(zhǔn)確度。（三）連續(xù)監(jiān)測(cè)法連續(xù)監(jiān)測(cè)法（continuous monitoring essay）又稱(chēng)速率法（rate essay）,是在測(cè)定酶活性或用酶法測(cè)定 代產(chǎn)物時(shí)，連續(xù)選取時(shí)間-吸光度曲線中線性期的吸光度值，并以此線性期的單位吸光度變化值（AA/min）計(jì)算結(jié) 果，見(jiàn)圖7-7A和B。所謂線性期就是各點(diǎn)吸光度差值相等，如圖7-7C所示，圖中§1及65值偏小，而82=63 = 64,故A1點(diǎn)至A4點(diǎn)屬線性段。此線性期對(duì)底物來(lái)說(shuō)屬零級(jí)反應(yīng)，期間的AA/min即為酶促反應(yīng)

26、的初速度，其 大小與被測(cè)酶活性成正比。連續(xù)監(jiān)測(cè)法的優(yōu)點(diǎn)即是可以確定線性期并計(jì)算AA/min,根據(jù)此值再準(zhǔn)確地計(jì)算酶活性, 因而使自動(dòng)生化分析儀在酶活性測(cè)定方面顯著地優(yōu)于手工法。連續(xù)監(jiān)測(cè)法也可用于測(cè)定呈線性反應(yīng)的代物濃度，一 般是某些基于酶法測(cè)定的代物。酶活性(U/L) =AA/minX理論(或校準(zhǔn))K值，代物濃度CU=AA/minX校準(zhǔn)K值。 關(guān)于理論K值和校準(zhǔn)K值敘述如下：1. 理論K值：多用于酶活性測(cè)定中，因酶活性尚無(wú)公認(rèn)的校準(zhǔn)品可用，因而根據(jù)酶活性的國(guó)際單位定義得 出酶活性的計(jì)算公式為：酶活性(U/L) = AA/minX ,將此式中 以K來(lái)表示，此K值可通過(guò)對(duì)已知值即指示物 質(zhì)的毫摩爾

27、消光系數(shù)(e )、反應(yīng)液總?cè)萘?TV)、樣品容量(SV)和比色杯光徑(d)計(jì)算后得出，即為理論K值, 可作為分析參數(shù)輸入到分析儀中。采用理論K值的前提應(yīng)當(dāng)是樣品和試劑的加量準(zhǔn)確、比色杯光徑準(zhǔn)確、溫度控制 精確以及波長(zhǎng)準(zhǔn)確等。但事實(shí)上由于各型分析儀在注射器容積步進(jìn)電機(jī)精度、濾光片帶寬等方面的差異，可造成樣 品和試劑加量以及吸光度檢測(cè)的偏差。溫度的影響有時(shí)也非常大，由于反應(yīng)盤(pán)是半暴錄的，因此隨著較冷試劑的加 入，反應(yīng)盤(pán)中的溫度會(huì)逐漸降低，盡管開(kāi)始測(cè)定時(shí)反應(yīng)盤(pán)溫度已升到37° C,但在某一項(xiàng)目測(cè)定過(guò)程的開(kāi)始階段， 溫度可能達(dá)不到37。C ,甚至僅35° C左右，且反應(yīng)過(guò)程中仍有可

28、能上下波動(dòng)，這對(duì)于酶學(xué)反應(yīng)來(lái)說(shuō)影響是很大 的。如采用37。C時(shí)的理論K值，將會(huì)使測(cè)定結(jié)果降低，溫度的波動(dòng)還會(huì)使得結(jié)果的重復(fù)性降低。當(dāng)然，若試劑在 加入反應(yīng)杯前經(jīng)試劑臂加熱裝置預(yù)溫，則基本不彩響反應(yīng)盤(pán)溫度。由于摩爾吸光系數(shù)受比色杯光徑、波長(zhǎng)、帶寬以及加樣系統(tǒng)的準(zhǔn)確性等的影響，書(shū)本上或試劑廠家提供的理論摩爾吸光系數(shù)可能與實(shí)際所用分析儀所測(cè)的不同， 因而有必要獲得實(shí)際的摩爾吸光系數(shù)，然后用來(lái)計(jì)算的K值稱(chēng)為實(shí)測(cè)K值。(1) NADH (NADPH)摩爾吸光系數(shù)的測(cè)定:NADH (NADPH)沒(méi)有標(biāo)準(zhǔn)純制品，而且配成溶液后穩(wěn)定性又較差，不能直接用NADH或NADPH標(biāo)準(zhǔn)液來(lái)校正儀器，須通過(guò)有NAD+ (

29、NADP+)參與的反應(yīng)途徑。用已糖激酶(HK)或葡萄糖脫 氫W(GD)方法測(cè)定葡萄.糖時(shí)，葡萄糖的消耗與NADH的生成呈等.摩爾關(guān)系。葡萄糖有標(biāo)準(zhǔn)純制品，又有國(guó)家批準(zhǔn)文 號(hào)的葡葡糖標(biāo)準(zhǔn)液。因此，根據(jù)公式A= e bC,已知比色杯光徑b和葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液濃度，測(cè)得葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)管的吸光 度A后便可計(jì)算出NADH (NADPH)的摩爾吸光系數(shù)£為A/bC。假設(shè),葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液濃度為10mmol/L(0. Olmol/L), 標(biāo)準(zhǔn)液加入量為3.5uL,酶試劑加入量為335 nL,比色杯光徑為0.7cm,在340nm測(cè)得吸光度為0.465,則實(shí)測(cè) NADH.摩爾吸光系數(shù)二=6424,即在此臺(tái)分析儀上3

30、40nm波長(zhǎng)處測(cè)得NADH (NADPH)的摩爾吸光系數(shù)為6424,而理論上 NADH (NADPH)的 e 為 6220。(2) "色素原"酶促產(chǎn)物在405nm波長(zhǎng)摩爾吸光系數(shù)的測(cè)定：有許多酶底物為人工合成的色素原"底物，其本身無(wú) 色，經(jīng)酶作用后釋放出有色的反應(yīng)產(chǎn)物，在405nm波長(zhǎng)具有吸收峰。最常用色素原底物及其產(chǎn)物為：ALP測(cè)定以 磷酸對(duì)硝基苯酚(4 - Nitrophenyl phosphate , 4-NPP)為底物，經(jīng)酶作用后釋放出黃色的對(duì)硝基苯酚 (4-Nitrophenol, 4-NP), GGT 測(cè)定以 Y -L-谷氨酰.對(duì)硝基苯胺(Y -L-G

31、1 utamy 1 -p-nitroani 1 ide)或 Y -L-谷氨酰-3- 輕基-對(duì)硝基苯胺(Y -L-Glutamyl-3-carboxyl-p-nitroan)為底物，經(jīng)酶作用后釋放出黃色的對(duì)硝基苯胺 (p-NitroanMine, 4-NA)或?qū)ο趸?5-氨基苯甲酸(2-amino-nitrobenzoicacid, ANBA) 0對(duì)硝基苯酚的摩爾吸光 系數(shù)為18700 (405nm),對(duì)硝基苯胺的摩爾吸光系數(shù)為9870 (405nm),對(duì)硝基-5-氨基苯甲酸的摩爾吸光系數(shù)為 9490(405nm)o下面是對(duì)硝基苯酚的摩爾吸光系數(shù)測(cè)定方法。試劑：4-NP標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)存液(10mmol/L)o4-NP標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)用液(2. 5nunol/L,以0. 84mol/L AMP緩沖液稀釋而成)。 底物緩沖液(15nunol/L 4-NPP 配于 0. 84mol/L AMP-HCL 緩沖液中，37°C,pH 10.09 土 0.02)。測(cè)定方法：4-NP標(biāo)準(zhǔn)液加入量為5uL,底物緩沖液加入量為350 nL,波長(zhǎng)405nm,光徑0.7cm,溫度37°C,測(cè)定 得吸光度為A1；另用蒸鐳水代替4-NP標(biāo)準(zhǔn)液，按上述方法測(cè)定其吸光度為A2, 4-NP標(biāo)準(zhǔn)液吸光度Al- A2, 若測(cè)得AA為0.460,則 實(shí)測(cè)4-NP