SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳測(cè)定蛋白質(zhì)的分子量ppt課件

1、實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn) SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳測(cè)聚丙烯酰胺凝膠電泳測(cè)定蛋白質(zhì)的分子量定蛋白質(zhì)的分子量實(shí)驗(yàn)原理實(shí)驗(yàn)原理l電泳：是帶電顆粒在電場(chǎng)作用下，作定向運(yùn)動(dòng)即向著與其電荷相反的電極移動(dòng)的現(xiàn)象。l電泳法分離、檢測(cè)蛋白質(zhì)混合樣品，主要是根據(jù)各蛋白質(zhì)組分的分子大小和形狀以及所帶凈電荷多少等因素所造成的電泳遷移率的差別。 l區(qū)帶電泳是樣品物質(zhì)在一惰性支持物上上進(jìn)行電泳的過程。因電泳后，樣品不同組分形成帶狀區(qū)間，故稱區(qū)帶電泳。實(shí)驗(yàn)原理實(shí)驗(yàn)原理l聚丙烯酰胺凝膠是由丙烯酰胺和交聯(lián)試劑N,N-甲叉雙丙烯酰胺在有引發(fā)劑如過硫酸銨和增速劑如N,N,N,N-四甲基乙二胺，TEMED的情況下聚合而成的。丙稀酰胺的聚合通常是由化

2、學(xué)催化或光化學(xué)過程完成的,常用過硫酸銨、過硫酸鉀或核黃素來引發(fā)這個(gè)過程，用TEMED、3-二甲胺丙腈等作為聚合過程中的增速劑。l 丙烯酰胺N,N-甲叉雙丙烯酰胺實(shí)驗(yàn)原理實(shí)驗(yàn)原理 聚丙烯酰胺凝膠三維結(jié)構(gòu)聚丙烯酰胺凝膠三維結(jié)構(gòu)實(shí)驗(yàn)原理實(shí)驗(yàn)原理l不連續(xù)聚丙烯酰胺凝膠電泳是指使用不同孔徑和不同緩沖系統(tǒng)的電泳，它由濃縮膠和分離膠兩部分所組成。由于濃縮膠的堆積濃縮作用，可使樣品即使是稀釋樣品在濃縮膠和分離膠的界面上先濃縮成一窄帶，然后在一定濃度或一定濃度梯度的凝膠上進(jìn)行分離。l不連續(xù)聚丙烯酰胺凝膠電泳的分離原理：l濃縮效應(yīng) l電荷效應(yīng) l分子篩效應(yīng) 實(shí)驗(yàn)原理實(shí)驗(yàn)原理l十二烷基硫酸鈉sodium dodec

3、yl sulfate，簡(jiǎn)稱SDS是一種陰離子去污劑，它能破壞蛋白質(zhì)分子之間以及與其他物質(zhì)分子之間的非共價(jià)鍵，使蛋白質(zhì)變性而改變?cè)械目臻g構(gòu)象。特別是在強(qiáng)還原劑，如巰基乙醇存在下，由于蛋白質(zhì)分子內(nèi)的二硫鍵被還原劑打開，不易再氧化，這就保證了蛋白質(zhì)分子與SDS充分結(jié)合.l蛋白質(zhì)-SDS復(fù)合物在水溶液中的形狀，近似于雪茄煙形的長(zhǎng)橢圓棒。不同蛋白質(zhì)的SDS復(fù)合物的短軸長(zhǎng)度都一樣，約為1.8nm，而長(zhǎng)軸則隨蛋白質(zhì)的分子量成正比變化。這樣的蛋白質(zhì)-SDS復(fù)合物在凝膠中的遷移率，不再受蛋白質(zhì)原有電荷和形狀的影響，而只是橢圓棒的長(zhǎng)度，也就是蛋白質(zhì)分子量的函數(shù)。l帶負(fù)電荷的蛋白質(zhì)-SDS復(fù)合物由于結(jié)合了大量的S

4、DS，使蛋白質(zhì)喪失了原有的電荷狀態(tài)，形成了僅保持原有分子大小為特征的負(fù)離子團(tuán)塊，從而降低或消除了各種蛋白質(zhì)分子之間天然的電荷差異。實(shí)驗(yàn)原理實(shí)驗(yàn)原理l在聚丙烯酰胺凝膠系統(tǒng)中，加入一定量的SDS時(shí)，蛋白質(zhì)分子的電泳遷移率主要取決于它的分子量大小，而其他因素對(duì)電泳遷移率的影響幾乎可以忽略不計(jì)。當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)的分子量在15,000200,000之間時(shí)，電泳遷移率與分子量的對(duì)數(shù)呈直線關(guān)系，符合下列方程式：llg MW=-bmR+Kl MW為蛋白質(zhì)分子量，mR為相對(duì)遷移率，b為斜率，k為截距。在條件一定時(shí)，b和K均為常數(shù)。l若將已知分子量的標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)的遷移率對(duì)分子量的對(duì)數(shù)作圖，可獲得一條標(biāo)準(zhǔn)曲線。未知蛋白質(zhì)的相

5、同條件下進(jìn)行電泳，根據(jù)它的電泳遷移率即可在標(biāo)準(zhǔn)曲線上求得分子量。 實(shí)驗(yàn)步驟實(shí)驗(yàn)步驟l凝膠的制備l蛋白質(zhì)樣品的處理 l加樣：用微量注射器依次在各個(gè)樣品槽內(nèi)加樣，各加1015l含蛋白質(zhì)1015g），稀溶液可加2030l 實(shí)驗(yàn)步驟實(shí)驗(yàn)步驟l電泳：上槽接負(fù)極，下槽接正極，打開直流電源。對(duì)于垂直板型電泳，一般樣品進(jìn)膠前電流控制在1520mA，大約1520分鐘；樣品進(jìn)膠后，將電流調(diào)到4050mA,保持電流強(qiáng)度不變。待指示染料遷移至下沿約11.5cm處停止電泳。 l剝膠和固定：電泳結(jié)束后，取下凝膠膜，卸下凝膠膜上的橡膠框，用鑷子將短板玻璃撬開后取出凝膠板。在溴酚藍(lán)區(qū)帶的中心作好標(biāo)志插入細(xì)金屬絲），用水慢慢沖洗一下膠面。將膠置于培養(yǎng)皿內(nèi)，放入固定液或10%W/V三氯乙酸），沒過凝膠板。固定2小時(shí)以上或過夜。實(shí)驗(yàn)步驟實(shí)驗(yàn)步驟l 染色：棄去固定液，加入染色液。染色4小時(shí)以上或過夜。有兩種染色液可供選擇。l脫色：染色完畢，傾出染色液，加入脫色液。一天換23次脫色液，直至凝膠的藍(lán)色背景褪清