課題計(jì)劃項(xiàng)目以與可行性實(shí)施計(jì)劃書

1、課題題目為：瓊脂糖自組裝膜基底型免疫芯片載體制備及抗體固定研究 項(xiàng)目?jī)?nèi)容摘要：研究意義：為了提升免疫芯片對(duì)抗體的固定效率，建立多糖納米膜基底型芯片載體制備的新方法，為后續(xù)免疫芯片的制備提供實(shí)驗(yàn)參考和理論支持。研究?jī)?nèi)容：本文選擇多糖中水溶性的瓊脂糖為基質(zhì)，利用分子自組裝技術(shù)，以玻片為載體，讓瓊脂糖、 高碘酸鈉對(duì)玻片表面進(jìn)行修飾，制備瓊脂糖自組裝膜載體。利用SEM AFM和FTIR對(duì)載體進(jìn)行表征，獲得最佳制備條件；利用熒光顯微成像及ImageJ軟件，研究該載體對(duì)2種不同種屬來(lái)源抗體的固定效率，對(duì)瓊脂糖自組裝膜載體和普通醛基修飾載體對(duì)抗體的固定效果進(jìn)行對(duì)比分析。關(guān)鍵字 瓊脂糖；免疫芯片；抗體固定項(xiàng)目

2、概況1主要研究開發(fā)內(nèi)容選擇多糖中水溶性的瓊脂糖為基質(zhì)，利用分子自組裝技術(shù)，以玻片為載體, 讓瓊脂糖、高碘酸鈉對(duì)玻片表面進(jìn)行修飾，制備瓊脂糖自組裝膜載體。利用SEM AFM和FTIR對(duì)載體進(jìn)行表征，獲得最佳制備條件；利用熒光顯微成像及ImageJ軟件，研究該載體對(duì)2種不同種屬來(lái)源抗體的固定效率，對(duì)瓊脂糖自組裝膜載體 和普通醛基修飾載體對(duì)抗體的固定效果進(jìn)行對(duì)比分析。材料：瓊脂糖、3-氨基丙基三甲氧基硅烷（APTES） （ Sigma公司，美國(guó)）， 高碘酸鈉、戊二醛、36%冰乙酸、無(wú)水乙醇等均為分析純（國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有 限公司）;FITC標(biāo)記的驢抗兔抗體（上海生工），F(xiàn)ITC標(biāo)記的兔抗人AFP抗體

3、（上 海生工）。器械：超純水機(jī)、電子天平、磁力攪拌器、烘干箱， JSM-6360LV型高低真 空掃描電鏡，F(xiàn)TS3000FX型的傅立葉變換紅外光譜儀， OLYMPUS BX5型倒置熒 光顯微鏡，Nan oscope IIIa 型原子力顯微鏡?；念A(yù)處理：25 mmx 75 mm光學(xué)載玻片用氨水洗液（體積比為氨水：過(guò)氧 化氫：水=1 ： 1 ： 5）置搖床上振搖2 h,取出后用超純水清洗干凈，放入1mol /L HCl中浸泡過(guò)夜，再用超純水超聲10 min,無(wú)水乙醇超聲清洗2次，每次5 min， 置電熱恒溫箱（120 C ）烘烤2 h。實(shí)驗(yàn)組瓊脂糖自組裝膜載體制備，對(duì)照組進(jìn)行普通醛基載體制備。

4、 基片表面抗體探針的固定，測(cè)定觀察載體表面熒光探針的固定效率。2、主要技術(shù)和經(jīng)濟(jì)指標(biāo)（限 1000字）主要技術(shù):瓊脂糖自組裝膜載體制備分別配制 0. 6%、0. 8%、1.0%、1.2%、1.4% 的瓊脂糖溶液，微波爐煮沸 3 min完全溶解；將2 ml瓊脂糖溶液覆蓋在 60C預(yù)熱的清潔玻片上；瓊脂糖室溫凝固后，置 37C烤箱烘干2 h;置室溫保 存?zhèn)溆?；將上述制備好的瓊脂糖玻片置?50 mmol /L NaIO4溶液中室溫下活 化60 min。接著用0. 1 mol /L pH7. 4 PBS 洗滌5 min X3次，氮?dú)饬鞔蹈?。普通醛基載體制備：按照文獻(xiàn)中的方法制備普通醛基載體。 清洗好

5、的玻片浸 入APTES舌化試劑（丙酮稀釋）中20 min后取出，玻片用丙酮、去離子水沖洗， 120C下烘干，然后放入含5%X二醛溶液中室溫下浸泡2 h，取出用去離子水沖 洗5 min X3次，烘干后，至干燥處保存?；砻婵贵w探針的固定：探針為 FITC標(biāo)記的驢抗兔IgG和兔抗人AFP抗體， 將探針固定至修飾后的載體表面，研究載體對(duì)不同蛋白探針的固定效率。 取原始 濃度為1mg/ml的探針溶于含20%甘油的PBS溶液中稀釋，使探針終濃度分別為0. 1、0. 2、0. 3、0. 4、0. 5、0. 6 mg /ml ，將探針?lè)肿臃謩e鏈接到修飾后 基片上，避光，置于濕盒中，37C固定3 h，然后P

6、BS清洗3次，洗掉未結(jié)合 的熒光探針，晾干后熒光顯微鏡檢測(cè)，獲取熒光圖像。經(jīng)濟(jì)指標(biāo)：載體對(duì)抗體的固定效率多糖納米膜基底型芯片載體成品的銷售3、技術(shù)創(chuàng)新點(diǎn)1. 本研究經(jīng)過(guò)前期資料查詢，數(shù)據(jù)庫(kù)內(nèi)相關(guān)資料充足，課題研究設(shè)計(jì)經(jīng)過(guò)推敲方 案在課題組通過(guò)，已經(jīng)組織選拔了課題組相關(guān)工作人員。2. 課題組成員，高級(jí)、中級(jí)職稱配備合理，有學(xué)科帶頭人，部分工作者有相關(guān)經(jīng) 驗(yàn)。3. 瓊脂糖、3-氨基丙基三甲氧基硅烷（APTES）（ Sigma公司，美國(guó)），高碘酸鈉、 戊二醛、36%冰乙酸、無(wú)水乙醇等均為分析純（國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）； FITC標(biāo)記的驢抗兔抗體（上海生工），F(xiàn)ITC標(biāo)記的兔抗人AFP抗體（上海生

7、 工）。3.特色和創(chuàng)新：在免疫芯片的制備和應(yīng)用過(guò)程中，大膽采用瓊脂糖建立一種新 的免疫芯片載體制備方法，既可以改善實(shí)驗(yàn)方法，又可以提高臨床提高診斷效率。4、獲得成果和知識(shí)產(chǎn)權(quán)（此處需要作者自己填寫）以下為項(xiàng)目可行性研究報(bào)告（一）目的意義（限1000字）免疫芯片，又稱為抗體微陣列，是實(shí)際應(yīng)用中最重要、研究最多的一種蛋白 質(zhì)芯片。免疫芯片技術(shù)結(jié)合了抗原抗體反應(yīng)的特異性和芯片高密度集成優(yōu)勢(shì)，只需少量生物樣品，一次檢測(cè)便可獲得幾種甚至幾萬(wàn)種有關(guān)的生物信息或疾病的檢 測(cè)結(jié)果。與傳統(tǒng)的免疫分析方法相比，免疫芯片最大的優(yōu)點(diǎn)是能夠?qū)崿F(xiàn)并行、快 速、高通量的檢測(cè)；同時(shí)極大節(jié)省時(shí)間、試劑，被廣泛應(yīng)用于蛋白質(zhì)組學(xué)研

8、究， 其在疾病診斷、藥物篩選、食品安全和環(huán)境監(jiān)測(cè)等領(lǐng)域已顯示出廣闊的應(yīng)用前景。 免疫芯片制備中，載體的表面修飾及抗體固定是影響芯片檢測(cè)靈敏度的關(guān)鍵因 素。目前，免疫芯片載體表面修飾可大致分為兩類：二維表面修飾和三維表面修 飾。二維表面修飾包括聚賴氨酸修飾、氨基修飾、醛基修飾、巰基修飾、鏈霉親 合素修飾等，它們是通過(guò)共價(jià)鍵或特殊分子間的高親合力把蛋白質(zhì)固定在載體表 面，所以對(duì)蛋白質(zhì)的固定比較牢固，蛋白質(zhì)的構(gòu)象變化較少，有利于保持蛋白質(zhì) 的天然活性。但是二維表面修飾技術(shù)制備的載體在發(fā)展過(guò)程中仍存在不少問(wèn)題， 如:引起抗體蛋白質(zhì)性質(zhì)不穩(wěn)定的問(wèn)題，動(dòng)力學(xué)檢測(cè)范圍窄等問(wèn)題。 三維表面修 飾是在玻片表面包

9、被一層凝膠或樹突狀多聚物，這些凝膠或多聚物又可以通過(guò)化 學(xué)反應(yīng)引入活性基團(tuán)，以共價(jià)結(jié)合和物理吸附的方式把蛋白固定在載體表面。瓊 脂糖一種擁有多種生物活性的高聚物， 生物相容性良好，有研究推斷瓊脂糖自組 裝膜基底可能會(huì)提升免疫芯片對(duì)抗體的固定效率， 建立多糖納米膜基底型芯片載 體制備的新方法，為后續(xù)免疫芯片的制備提供實(shí)驗(yàn)參考和理論支持 。（二）233-240.3 Klimushina MV , Gumanova NG Metelskaya VA. Direct labeling ofserum protei ns by fluoresce nt dye for an tibody microar

10、ray J . Bio-chem Biophy R es Commun 2017, 486(3): 824-826.4 Chang SY , Bong JH, Yoo G, et al . Activity control of autodisplayedproteins on the same outer membrane layer of E. coli by using Z-domain streptavid inand lipase foldase systems J . En zymeMi-crobial Tech no logy ,2017, 96:85-95.（三）市場(chǎng)預(yù)測(cè)和發(fā)展

11、趨勢(shì)（限 500 字）未來(lái)，在免疫芯片的制備和應(yīng)用過(guò)程中，載體的選擇以及載體表面修飾是制 備質(zhì)量好、結(jié)合力高的芯片將是重要環(huán)節(jié)，最后建立了一種新的免疫芯片載體制 備方法，為后續(xù)免疫芯片的制備和應(yīng)用不斷提供實(shí)驗(yàn)參考和理論支持。二、研究開發(fā)內(nèi)容、方法、技術(shù)路線（一）具體研究開發(fā)內(nèi)容和要重點(diǎn)解決的技術(shù)關(guān)鍵問(wèn)題（限 1000字）60C預(yù)熱的清潔玻片上；瓊脂糖室溫凝固后，置 37C烤箱烘干2 h;置室溫保 存?zhèn)溆?；將上述制備好的瓊脂糖玻片置?50 mmol /L NalO4溶液中室溫下活 化60 min。接著用0. 1 mol /L pH7. 4 PBS 洗滌5 min X3次，氮?dú)饬鞔蹈伞Ｆ胀ㄈ┗d

12、體制備：按照文獻(xiàn)中的方法制備普通醛基載體。 清洗好的玻片浸 入APTES舌化試劑（丙酮稀釋）中20 min后取出，玻片用丙酮、去離子水沖洗， 120C下烘干，然后放入含5%X二醛溶液中室溫下浸泡2 h，取出用去離子水沖 洗5 min X3次，烘干后，至干燥處保存?；砻婵贵w探針的固定：探針為FITC標(biāo)記的驢抗兔IgG和兔抗人AFP抗 體，將探針固定至修飾后的載體表面， 研究載體對(duì)不同蛋白探針的固定效率。取原始濃度為1mg/ml的探針溶于含20%甘油的PBS溶液中稀釋，使探針終濃度分 別為0. 1、0. 2、0. 3、0. 4、0. 5、0. 6 mg /ml ，將探針?lè)肿臃謩e鏈接到修 飾后基

13、片上，避光，置于濕盒中，37E固定3 h，然后PBS清洗3次，洗掉未 結(jié)合的熒光探針，晾干后熒光顯微鏡檢測(cè)，獲取熒光圖像。不同基片對(duì)抗體分子固定效率的比較：利用最佳條件分別制備普通醛基化載 體，瓊脂糖自組裝膜載體，分別固定最佳濃度的抗體探針?lè)肿?，根?jù)平均熒光強(qiáng)度比較兩種載體對(duì)抗體的固定效果。載體表面的形貌用JSM-6360LV型高低真空 掃描電鏡（SEM）與原子力顯微鏡（AFM）觀察；在IRPrestige-21 型傅里葉變換 紅外光譜儀上測(cè)定紅外光譜（FTI R），用來(lái)分析載體表面存在的化學(xué)鍵；用 OLYMPUS BX5型倒置熒光顯微鏡觀察載體表面熒光探針的固定效率。重點(diǎn)解決的技術(shù)關(guān)鍵：瓊脂

14、糖自組裝膜載體的制備。（二）項(xiàng)目的特色和創(chuàng)新之處（限1000 字）在免疫芯片的制備和應(yīng)用過(guò)程中，載體的選擇以及載體表面修飾是制備質(zhì)量 好、結(jié)合力高的芯片將是重要環(huán)節(jié)，采用瓊脂糖建立一種新的免疫芯片載體制備 方法。（三）要達(dá)到的技術(shù)、經(jīng)濟(jì)指標(biāo)及社會(huì)、經(jīng)濟(jì)效益（限 1000 字）三、項(xiàng)目總體目標(biāo)及考核指標(biāo)、實(shí)施年限、年度計(jì)劃安排與階段目標(biāo)（時(shí)間進(jìn)度作者可以自行調(diào)整，半年為一個(gè)進(jìn)度，一般是研究周期是2年）（一）總體目標(biāo)及考核指標(biāo)1、申報(bào)項(xiàng)目與所屬指南方向的關(guān)聯(lián)關(guān)系（包括項(xiàng)目與所屬指南方向的匹配性, 對(duì)指南方向目標(biāo)的支撐作用）。（限1000字）起止時(shí)間（半年為時(shí) 間段）主要工作內(nèi)容及階段目標(biāo)（每階段限

15、200字）2019年6月1日數(shù)據(jù)庫(kù)查詢資料，資料的篩選2019年12月1日2020年1月1日臨床試驗(yàn)的準(zhǔn)備階段2020年6月1日2020年7月1日臨床試驗(yàn)階段2020年12月1日2021年1月1日數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)階段2021年6月1日2021年7月2日結(jié)題階段，論文書寫、發(fā)表階段2021 年 12 月 1日2、項(xiàng)目目標(biāo)及考核指標(biāo)、評(píng)測(cè)方式/方法。（限1000 字）項(xiàng)目目的：建立多糖納米膜基底型芯片載體制備的新方法， 為后續(xù)免疫芯片的制 備提供實(shí)驗(yàn)參考和理論支持。考核指標(biāo)：1.結(jié)題報(bào)告；2.發(fā)表專業(yè)論文2篇。 測(cè)評(píng)方法：測(cè)定載體對(duì)抗體的固定效率。七、預(yù)期經(jīng)濟(jì)社會(huì)效益項(xiàng)目的科學(xué)、技術(shù)、產(chǎn)業(yè)預(yù)期指標(biāo)及科學(xué)價(jià)

16、值、社會(huì)、經(jīng)濟(jì)、生態(tài)效益。（限1000字）1 重視科技成果轉(zhuǎn)化是世界競(jìng)爭(zhēng)發(fā)展的需要。在當(dāng)今世界范圍內(nèi)，經(jīng)濟(jì)的競(jìng)爭(zhēng) 愈來(lái)愈表現(xiàn)為科學(xué)技術(shù)的競(jìng)爭(zhēng)，表現(xiàn)科技成果（特別是高技術(shù)成果）轉(zhuǎn)化數(shù)量、 質(zhì)量和轉(zhuǎn)化速度的競(jìng)爭(zhēng)，制備多糖納米膜基底型芯片載體是科技成果商品化的重 要體現(xiàn)。2 科技成果轉(zhuǎn)化是落實(shí)“科學(xué)技術(shù)是第一生產(chǎn)力”的關(guān)鍵。發(fā)展經(jīng)濟(jì)要依靠科 技進(jìn)步，發(fā)揮第一生產(chǎn)力的作用，多糖納米膜基底型芯片載體銷售可以獲得經(jīng)濟(jì) 利益，有效地提高產(chǎn)業(yè)的經(jīng)濟(jì)增長(zhǎng)質(zhì)量，本科技成果轉(zhuǎn)化是科技與經(jīng)濟(jì)結(jié)合的最 好形式。已有大量研究證明 ，三維結(jié)構(gòu)的載體對(duì)蛋白質(zhì)的固定量比二維平面載體大 得多，而且凝膠的固-液環(huán)境使固定在上面的蛋

17、白質(zhì)不易失去活性。所以三維修 飾表面是近年來(lái)較受關(guān)注的修飾方法。研究表明* 1 2 3，多糖膜具有三維多孔結(jié)構(gòu)， 經(jīng)水化后可在內(nèi)部形成固-液狀態(tài)的水凝膠結(jié)構(gòu)，這種三維、多孔結(jié)構(gòu)以及濕潤(rùn) 的微環(huán)境不但能固定足夠的蛋白質(zhì)，同時(shí)還可以防止蛋白質(zhì)變性失活。瓊脂糖是一種擁有多種生物活性的高聚物，有著很好的生物相容性，其在載玻片表面形成的自組裝結(jié)構(gòu)具有類似于聚丙烯酰胺的水凝膠特征，這三維自組裝結(jié)構(gòu)又可以通過(guò)化學(xué)反應(yīng)引入醛基基團(tuán)，即可與抗體分子的氨基發(fā)生共價(jià)偶聯(lián)。 具有這種三維結(jié)構(gòu)的載體對(duì)蛋白質(zhì)的固定量比二維平面載體大得多，而且凝膠的固-液濕潤(rùn)環(huán)境使固定在上面的蛋白質(zhì)不易失去活性，因此更有利于固定抗體探 針

18、分子。有研究表明：殼聚糖氧化自組裝膜修飾玻片與抗體結(jié)合效率高，熒光 信號(hào)強(qiáng)，點(diǎn)的密度及數(shù)量等都要優(yōu)于普通醛基化玻片。瓊脂糖是一種多糖，加熱后易溶于水，不同濃度的瓊脂糖在玻片上形成的膜的厚度和孔徑大小也有差異， 膜的厚度和孔徑的大小會(huì)直接影響蛋白質(zhì)的固定。參考文獻(xiàn)1SjbergR， Mattsson C，Andersson E， et al . Exploration of high-densityproteinmicroarrays for antibody validation and autoimmunityprofili ng J. New Biotech nol ，2016，33（5）: 582-592.2Thk SM Bonabi A, Nordberg ME et al . Thiol-ene microfluidic devices for microchip electrophoresis: Effects of curi ng con diti ons and mono mercomposition on surface properties J . J Chromatog-raphy A, 2015， 1426:本文選擇多糖中水溶性的瓊脂糖為基質(zhì),利用分子自組裝技術(shù)，以玻片為載 體，讓瓊脂糖、高碘酸鈉對(duì)玻片表面進(jìn)行修飾，制備瓊脂糖自組裝膜載體。利用 SEM