淀粉酶產(chǎn)生菌的篩選及酶活力測(cè)定

1、西南昌大學(xué)實(shí)驗(yàn)報(bào)告淀粉酶產(chǎn)生菌的篩選及酶活力測(cè)定一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康模?、學(xué)習(xí)從土壤中分離微生物的方法；2、學(xué)習(xí)淀粉酶產(chǎn)生菌的篩選方法3、了解分光光度計(jì)法測(cè)定酶活力的原理及方法。二、實(shí)驗(yàn)原理：土壤中含有大量的微生物，將土壤稀釋液涂在不同類型 的培養(yǎng)基上，在適宜的環(huán)境中培養(yǎng)幾天，細(xì)菌或者是其他的 微生物便能在平板上生長(zhǎng)繁殖，形成菌落。將初次篩選得到 的微生物接到淀粉培養(yǎng)基上培養(yǎng)，因?yàn)橹挥心軌虍a(chǎn)生淀粉酶 的細(xì)菌才能夠利用培養(yǎng)集中的淀粉成分來(lái)完成自身的生命 活動(dòng)，才能夠生存。故在淀粉培養(yǎng)基上長(zhǎng)生的菌便是淀粉產(chǎn) 生菌。在培養(yǎng)基上滴碘液，淀粉被分解掉的部分不顯現(xiàn)藍(lán)色， 由現(xiàn)透明圈，可以通過(guò)透明圈的大小來(lái)初步判斷

2、菌種產(chǎn)淀粉 的能力。淀粉酶是指一類能催化分解淀粉分子中糖昔鍵的酶的 總稱，主要包括a 淀粉酶和B-淀粉酶等，a -淀粉酶可從淀粉分子內(nèi)部切斷淀粉的a -1,4糖昔鍵，形成麥芽糖、含有 6個(gè)葡萄糖單位的寡糖和帶有支鏈的寡糖，是淀粉的粘度下 降，因此又稱為液化型淀粉酶。淀粉遇碘呈藍(lán)色。這種淀粉-碘復(fù)合物在660nm 處有較大的吸收峰，可用分光光度計(jì)測(cè)定。隨著酶的不斷分作用，淀粉長(zhǎng)鏈被切斷，生成小分子的糊精，使其對(duì)碘的藍(lán)色反應(yīng)逐漸消失，因此可以根據(jù)一定時(shí)間內(nèi)藍(lán)色消失的程度為指標(biāo)來(lái)測(cè)定a-淀粉酶的活力。三、實(shí)驗(yàn)器材及試劑：1 、培養(yǎng)基：（ 1 ）分離培養(yǎng)基：牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基（牛肉膏3g、蛋白腺1

3、0g、NaCl 5g、溶于1000mL蒸播水中，再加入 15g 瓊脂粉， pH 調(diào)至 7.2， 121滅菌 15min ，待冷卻至 50 左右時(shí)，于超凈工作臺(tái)倒平板）（ 2）篩選培養(yǎng)基：淀粉培養(yǎng)基（可溶性淀粉20g, 硝酸鉀 1g, 磷酸氫二鉀 0.5g, 氯化鈉 0.5g, 硫酸鎂 0.5g, 硫酸 亞鐵0.01g,瓊脂20g,水1000毫升，調(diào)整 pH值到7.2 7.4。）（ 3）搖瓶培養(yǎng)：淀粉培養(yǎng)液。2、試劑：碘液、 2%可溶性淀粉、 pH6.0 磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液、標(biāo)準(zhǔn)糊精溶液、 0.5mol/L 乙酸、 0.85%生理鹽水。3、器材：培養(yǎng)皿、錐形瓶、高壓滅菌鍋、超凈工作臺(tái)、恒溫

4、水浴鍋、分光光度計(jì)。四、實(shí)驗(yàn)步驟：1、淀粉產(chǎn)生菌的篩選：（ 1）采集土樣，并用無(wú)菌水稀釋成菌懸液；（ 2）配置牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基及淀粉培養(yǎng)基，倒平板備用；（ 3）將制好的菌懸液與超凈工作臺(tái)上涂到牛肉膏蛋白胨平板上，于 37 攝氏度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)一天；（ 4）挑取整個(gè)菌落，將其移入淀粉培養(yǎng)基中，繼續(xù)放在 37 攝氏度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)兩天；（ 5）將碘液滴在平板上，觀察透明圈的大小。2、酶活力測(cè)定：（ 1）選產(chǎn)生透明圈最大的菌株進(jìn)行搖瓶培養(yǎng)，將菌溶于 5ml 無(wú)菌生理鹽水中，吸取此培養(yǎng)液加入淀粉培養(yǎng)液中，30 攝氏度搖瓶培養(yǎng)72h 。（ 2）酶液稀釋：取發(fā)酵液進(jìn)行4000r/min 離心 5min

5、，取上清液，用緩沖液適當(dāng)稀釋。（ 3）標(biāo)準(zhǔn)曲線制作：準(zhǔn)備七支試管，按照下表配置混合液。使用分光光度計(jì)策規(guī)定各管溶液在660nm 下的 OD 值。 然后以淀粉濃度為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)，做標(biāo)準(zhǔn)曲線。（ 4）酶活力測(cè)定取稀釋的粗酶液也按照下表中七號(hào)管的要求配置混合液，測(cè)得吸光度后，在標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出相應(yīng)的淀粉濃度，求出被酶消耗的淀粉量口 呂勺1234567淀粉稀釋液/ml2 (0%)2 (0.2%)2 (0.5%)2 (1.0%)2 (1.5%)2 (2.0%)2 (2.0%)緩沖液/ml111111140攝氏度水浴保溫 5min呂勺1234567蒸儲(chǔ)水/ml1111110粗酶液/ml000000

6、140攝氏度水浴保溫 30min ,然后放入沸水浴 5min,每管加入稀碘液1ml(5)酶活力測(cè)定：酶活力以每毫升粗酶液在 40攝氏度，pH6.0的條件下每小時(shí)所分解的淀粉毫克數(shù)來(lái)衡量。五、實(shí)驗(yàn)結(jié)果：1淀粉產(chǎn)生菌的篩選：淀粉產(chǎn)生菌透明圈的檢驗(yàn)圖2、酶活力測(cè)定：(1)實(shí)驗(yàn)預(yù)測(cè)數(shù)據(jù)：管號(hào)1234567分解淀粉數(shù)/mg00.2350.5841.1071.3751.7881.540(2)計(jì)算：樣品的OD660=1.540查標(biāo)準(zhǔn)曲線可得：淀粉含量=1.540/0.047=32.766mg初始淀粉含量=2g/100ml X 2ml=0.04g=40mg被消耗的淀粉含量=40mg 32.766mg=7.234mg酶活力=7.234mg/(1ml X 0.5h)=14.468 mg/(ml , h)六、實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析：平板菌落水解圈直徑大小受