PCR3未知DNA擴(kuò)增ppt課件

1、8.3 PCR8.3 PCR擴(kuò)增未知擴(kuò)增未知DNADNA片段片段 當(dāng)獲得一段DNA后，若要得到與其相鄰的未知DNA片段，可通過(guò)染色體步查來(lái)完成。 染色體步查是指從生物基因組或基因組文庫(kù)中的已知 序列出發(fā)，逐步獲得或探知其相鄰的未知序列或與 已知序列呈共線性關(guān)系的目的序列的核苷酸組成的 方法和過(guò)程。1ppt課件.8.3.1 8.3.1 反向反向PCRPCR 反向反向PCRPCR（inverse PCRinverse PCR）是一種簡(jiǎn)單的擴(kuò)增已知 序列周邊未知序列的方法，其擴(kuò)增原理見圖8-8。 首先用已知片段內(nèi)部沒有的限制性內(nèi)切酶切割模板DNA，再將酶切后的DNA片段連接成環(huán)狀分子，其中 至少有一

2、個(gè)環(huán)狀分子含有完整的已知片段。 根據(jù)已知片段兩端的序列設(shè)計(jì)引物，可將鄰近的DNA片段擴(kuò)增出來(lái)。2ppt課件.3ppt課件.圖圖8-8 8-8 反向反向PCRPCR原原理示理示意圖意圖4ppt課件.8.3.2 8.3.2 利用接頭的利用接頭的PCRPCR 這類方法的第一步通常都是將基因組DNA用限制性內(nèi)切酶切割，然后將序列已知的接頭片段連接到酶切片段兩端，以提供PCR需要的另一端引物。 根據(jù)已知序列設(shè)計(jì)的引物和根據(jù)接頭序列設(shè)計(jì)的引物，可將已知序列側(cè)翼的未知序列擴(kuò)增出來(lái)。5ppt課件.巢式巢式PCRPCR反應(yīng)模式圖反應(yīng)模式圖 6ppt課件.圖圖8-9 8-9 利用利用3 3末端修飾的接頭擴(kuò)增未知末

3、端修飾的接頭擴(kuò)增未知DNADNA片段片段接頭一端為平末端，另一端為長(zhǎng)長(zhǎng)的5 5突出末端，而且在3 3凹端帶有一個(gè)修飾氨基(-NH(-NH2 2)，修飾的末端在PCR擴(kuò)增時(shí)不能作為引物啟動(dòng)DNA的合成。首先選擇合適的酶切位點(diǎn)酶切總基因組，將人工合成的接頭連接在酶切片段兩端，然后再做PCR擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增的引物是根據(jù)接頭的突出末端序列而設(shè)計(jì)的引物L(fēng)P1LP1和LP2LP2，以及根據(jù)已知序列設(shè)計(jì)的引物SP1SP1和SP2SP2。7ppt課件.8.3.3 8.3.3 熱不對(duì)稱交錯(cuò)熱不對(duì)稱交錯(cuò)PCRPCR TAIL-PCRTAIL-PCR: thermal asymmetric interlaced P

4、CR 利用不同的退火溫度選擇性地?cái)U(kuò)增目標(biāo)片段 利用特異引物和隨機(jī)引物進(jìn)行PCR一般有3種產(chǎn)物生成：由特異性引物和簡(jiǎn)并引物擴(kuò)增出的產(chǎn)物(I I型產(chǎn)物型產(chǎn)物）；由同一特異性引物擴(kuò)增出的產(chǎn)物（IIII型產(chǎn)物型產(chǎn)物）；由同一簡(jiǎn)并引物擴(kuò)增出的產(chǎn)物（IIIIII型產(chǎn)物型產(chǎn)物）。 8ppt課件. TAIL-PCR的基本原理是利用目標(biāo)序列旁的已知序列 設(shè)計(jì)3個(gè)嵌套的特異性引物（special primer，簡(jiǎn)稱sp1sp1，sp2sp2，sp3sp3，約20bp），用它們分別和1個(gè)具有 低Tm值的短的隨機(jī)簡(jiǎn)并引物（arbitrary degenerate prime，ADAD，約14bp）相組合，以基因組為模

5、板， 根據(jù)引物的長(zhǎng)短和特異性的差異設(shè)計(jì)不對(duì)稱的溫度 循環(huán)，通過(guò)分級(jí)反應(yīng)來(lái)擴(kuò)增特異引物。 TAIL-PCR共分3次反應(yīng)。 9ppt課件. TAIL-PCR用特殊的熱循環(huán)程序使PCR反應(yīng)有利于型產(chǎn)物的擴(kuò)增，而抑制型非特異性產(chǎn)物。 其中使用較長(zhǎng)的高退火溫度的嵌套特異引物和較短的低退火溫度的隨機(jī)簡(jiǎn)并引物，它們的退火溫度明顯 不同。 通過(guò)控制退火溫度可控制何種引物占優(yōu)勢(shì)，從而控制產(chǎn)物的擴(kuò)增。10ppt課件. 首先首先進(jìn)行5輪高嚴(yán)謹(jǐn)度的擴(kuò)增，此時(shí)主要是特異性的引物起作用，單向擴(kuò)增目的單鏈DNA。 然后然后進(jìn)行一個(gè)低嚴(yán)謹(jǐn)度的PCR循環(huán)，隨機(jī)簡(jiǎn)并引物起作用，此前線性擴(kuò)增的目的DNA產(chǎn)物可變成雙鏈。 在隨后的擴(kuò)增中高嚴(yán)謹(jǐn)度和中嚴(yán)謹(jǐn)度循環(huán)交錯(cuò)進(jìn)行，使目的序列擴(kuò)增大大超過(guò)非特異產(chǎn)物，從而控制特異產(chǎn)物和非特異產(chǎn)物的生成比例（圖圖8-108-10）。 最后最后再使用一個(gè)嵌套特異性引物進(jìn)行第二次TAIL-PCR，可以得到大量的特異性產(chǎn)物。11ppt課件.圖圖