生化實驗技術(shù)資料-Western Blot

1、張紹進張紹進 Western Blot Western BlotWestern Blot 簡介：p印跡法（blotting）是指將樣品轉(zhuǎn)移到固相載體上，而后利用相應(yīng)的探測反應(yīng)來檢測樣品的一種方法。p1975年，Southern建立了將DNA轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜（NC膜）上，并利用DNARNA雜交檢測特定的DNA片段的方法，稱為Southern印跡法。p而后人們用類似的方法，對RNA和蛋白質(zhì)進行印跡分析，對RNA的印跡分析稱為Northern印跡法，對單向電泳后的蛋白質(zhì)分子的印跡分析稱為Western印跡法，對雙向電泳后蛋白質(zhì)分子的印跡分析稱為Eastern印跡法。 Western Blot We

2、stern Blotp 高分辨率的電泳技術(shù)高分辨率的電泳技術(shù)p 特異敏感的抗原特異敏感的抗原- -抗體反應(yīng)抗體反應(yīng)p 1-5ng1-5ng中等大小的靶蛋白中等大小的靶蛋白 Western Blotq目的蛋白的表達特性分析q目的蛋白與其它蛋白的互作q目的蛋白的組織定位q目的蛋白的表達量分析 Western Blotl蛋白樣品的制備蛋白樣品的制備SDS-PAGESDS-PAGE轉(zhuǎn)膜轉(zhuǎn)膜封閉封閉一抗雜交一抗雜交二抗雜交二抗雜交底物顯色底物顯色 Western Blot Western Blot Western Blotp2SDS-PAGE上樣緩沖液：上樣緩沖液：pDTT可臨用前以可臨用前以1：4比例

3、混合加入，亦可全部配好分裝，比例混合加入，亦可全部配好分裝，-20凍存。凍存。p按按1:1比例與蛋白質(zhì)樣品混合，比例與蛋白質(zhì)樣品混合，95100加熱加熱515min，冰上冷卻后再上樣，上樣量一般為冰上冷卻后再上樣，上樣量一般為20-25l，總蛋白量，總蛋白量2050g。1M Tris-HCl(pH6.8)10 ml1M DTT20 mlSDS4 g甘油甘油20 ml溴酚藍溴酚藍0.2 g總體積總體積100ml100mM Tris-HCl(pH6.8)200mM DTT4%SDS0.2%溴酚蘭溴酚蘭20%甘油甘油ddH2O Western BlotSDS：p陰離子去污劑陰離子去污劑 變性劑變性劑

4、p氨基酸側(cè)鏈與氨基酸側(cè)鏈與SDS充分結(jié)合形成帶負電荷的蛋白質(zhì)充分結(jié)合形成帶負電荷的蛋白質(zhì)-SDS膠束。膠束。p蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)-SDS膠束所帶的負電荷大大超過了蛋白質(zhì)分子原有的電荷膠束所帶的負電荷大大超過了蛋白質(zhì)分子原有的電荷量，消除了不量，消除了不 同分子之間原有的電荷差異。同分子之間原有的電荷差異。p與強還原劑一起使蛋白分子氫鍵、疏水鍵打開，使蛋白質(zhì)分子線與強還原劑一起使蛋白分子氫鍵、疏水鍵打開，使蛋白質(zhì)分子線性化。性化。 Western Blot蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)-SDS-SDS膠束的特點：膠束的特點：（1 1）具有相同的形狀，形狀）具有相同的形狀，形狀像一個長橢圓棒像一個長橢圓棒（2 2）平均）

5、平均1g 1g 蛋白質(zhì)結(jié)合蛋白質(zhì)結(jié)合1.4g SDS1.4g SDS（3 3）短軸對不同的蛋白質(zhì)亞）短軸對不同的蛋白質(zhì)亞基基-SDS-SDS膠束基本上是相同的膠束基本上是相同的（4 4）長軸的長度則與亞基分）長軸的長度則與亞基分子量的大小成正比子量的大小成正比 Western Blotq不連續(xù)的電泳緩沖體系。qSDS蛋白質(zhì)復(fù)合物在凝膠電泳時，不再受蛋白質(zhì)電荷與形狀的影響，而只取決于蛋白質(zhì)分子量的大小。 SDSSDS聚丙烯酰胺凝膠電泳聚丙烯酰胺凝膠電泳 Western BlotpSDS-PAGESDS-PAGE 是在蛋白質(zhì)樣品中加入是在蛋白質(zhì)樣品中加入SDSSDS和含有巰基乙醇的和含有巰基乙醇的

6、樣品處理液，樣品處理液，是一種很強的是一種很強的，它可，它可以以，破壞蛋白質(zhì)分子的二級，破壞蛋白質(zhì)分子的二級和三級結(jié)構(gòu)。和三級結(jié)構(gòu)。p強還原劑巰基乙醇（或二硫蘇糖醇，強還原劑巰基乙醇（或二硫蘇糖醇，DTTDTT）可以可以斷開二硫斷開二硫鍵破壞蛋白質(zhì)的四級結(jié)構(gòu)鍵破壞蛋白質(zhì)的四級結(jié)構(gòu)。使蛋白質(zhì)分子被解聚成肽鏈。使蛋白質(zhì)分子被解聚成肽鏈形成單鏈分子。解聚后的側(cè)鏈與形成單鏈分子。解聚后的側(cè)鏈與SDSSDS充分結(jié)合形成帶負電充分結(jié)合形成帶負電荷的蛋白質(zhì)荷的蛋白質(zhì)-SDS-SDS復(fù)合物。復(fù)合物。p蛋白質(zhì)分子結(jié)合蛋白質(zhì)分子結(jié)合SDSSDS陰離子后，所帶負電荷的量遠遠超陰離子后，所帶負電荷的量遠遠超 過了它原

7、有的凈電荷，從而消除了不同種蛋白質(zhì)之間所過了它原有的凈電荷，從而消除了不同種蛋白質(zhì)之間所 帶凈電荷的差異。蛋白質(zhì)的電泳遷移率主要決定于亞基帶凈電荷的差異。蛋白質(zhì)的電泳遷移率主要決定于亞基 的相對分子質(zhì)量，而與其所帶電荷的性質(zhì)無關(guān)。的相對分子質(zhì)量，而與其所帶電荷的性質(zhì)無關(guān)。 Western Blot凝膠成分凝膠成分M丙烯酰胺和N,N-亞甲雙丙烯酰胺 MSDSM配膠的Tris緩沖液MTEMEDM過硫酸銨MTris-甘氨酸電泳緩沖液 Western BlotPAGEPAGE：聚丙烯酰胺凝膠：聚丙烯酰胺凝膠 聚丙烯酰胺凝膠聚丙烯酰胺凝膠(polyacrylamide gel)(polyacrylami

8、de gel)是由單體丙烯酰是由單體丙烯酰胺胺(acrylamide(acrylamide，簡稱，簡稱Acr)Acr)和交聯(lián)劑和交聯(lián)劑(crosslinker)(crosslinker)N,NN,N- -亞甲基雙丙烯酰胺亞甲基雙丙烯酰胺(N,N(N,N-methylenebisacylamide-methylenebisacylamide，簡稱簡稱Bis)Bis)在催化劑和加速劑作用下聚合交聯(lián)而成的三維網(wǎng)在催化劑和加速劑作用下聚合交聯(lián)而成的三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的凝膠。化學(xué)惰性強，具有一定的機械強度和透明狀結(jié)構(gòu)的凝膠?；瘜W(xué)惰性強，具有一定的機械強度和透明度。是良好的電泳介質(zhì)。度。是良好的電泳介質(zhì)。 We

9、stern Blot聚丙烯酰胺凝膠的聚合方式：聚丙烯酰胺凝膠的聚合方式： 單體：丙烯酰胺（單體：丙烯酰胺（AcrAcr）；）； 交聯(lián)劑：甲叉雙丙烯酰胺（交聯(lián)劑：甲叉雙丙烯酰胺（BisBis）；）； 催化劑：過硫酸胺或核黃素（催化劑：過硫酸胺或核黃素（APAP）；）； 加速劑：四甲基乙二胺（加速劑：四甲基乙二胺（TEMEDTEMED）；）； 產(chǎn)物：三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)凝膠產(chǎn)物：三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)凝膠聚丙烯酰胺凝膠聚合機理是通過提供氧游離基聚丙烯酰胺凝膠聚合機理是通過提供氧游離基(free radicals)(free radicals)的催化，使體系發(fā)生氧化還原作用的催化，使體系發(fā)生氧化還原作用(cataly

10、st-redox systems)(catalyst-redox systems)來來完成的。催化體系主要有化學(xué)催化（完成的。催化體系主要有化學(xué)催化（APAPTEMEDTEMED）和光化學(xué)催化）和光化學(xué)催化（核黃素（核黃素TMTEDTMTED）體系。）體系。 Western Blot凝膠濃度（）線性分離范圍（KD)1512-431016-687.536-945.057-212SDS-PAGE濃縮膠濃縮膠(5% Acrylamide)及分離膠配方及分離膠配方表：表：http:/ Western Blot不連續(xù)電泳：不連續(xù)電泳： 作用作用緩沖液緩沖液PHPH凝膠濃度凝膠濃度濃縮膠濃縮膠使蛋白樣品濃

11、縮pH6.8Tris-Cl低，2-5%分離膠分離膠使蛋白樣品分離pH8.8Tris-Cl高，根據(jù)蛋白大小電泳緩沖液：電泳緩沖液：pH8.3 Tris-pH8.3 Tris-甘氨酸系統(tǒng)甘氨酸系統(tǒng)。 Western Blot灌制分離膠灌制分離膠 隔絕空氣隔絕空氣ddH2O0.1%SDS:8% Western Blot灌制積層膠灌制積層膠 插入梳子插入梳子 Western BlotStaking gelSeparating gel Western Blot轉(zhuǎn)膜p要將電泳后分離的蛋白質(zhì)從凝膠中轉(zhuǎn)移到固相載體（例如NC膜）上，通常有兩種方法：毛細管印跡法和電泳印跡法毛細管印跡法和電泳印跡法。p常用的電泳

12、轉(zhuǎn)移方法有濕轉(zhuǎn)和半干轉(zhuǎn)濕轉(zhuǎn)和半干轉(zhuǎn)。兩者的原理完全相同，只是用于固定膠/膜疊層和施加電場的機械裝置不同。 Western Blotp最常用于最常用于Western Blot的轉(zhuǎn)移膜主要是硝酸的轉(zhuǎn)移膜主要是硝酸纖維素（纖維素（Nitrocellulose，NC）膜和聚偏二氟）膜和聚偏二氟乙烯乙烯 （Polyvinylidene Fluoride, PVDF）膜，）膜，此外也有用尼龍膜、此外也有用尼龍膜、DEAE纖維素膜做蛋白纖維素膜做蛋白印跡。尼龍膜和印跡。尼龍膜和NC膜的特點相似膜的特點相似,主要用于主要用于核酸雜交。核酸雜交。p各種膜的詳細特點介紹：各種膜的詳細特點介紹：phttp:/ We

13、stern Blot濕轉(zhuǎn)系統(tǒng) Western Blot半干轉(zhuǎn)移系統(tǒng) Western Blot 蛋白帶出現(xiàn)后，于室溫用去離子水漂洗硝酸纖 維素濾膜，換水幾次。只用于放射性標(biāo)記抗體或放射性標(biāo)記A蛋白探 針的Western印跡過程。 Western Blot Western Blot一抗、二抗孵育p把NC膜放在密閉塑料袋或者培養(yǎng)皿中，根據(jù)膜面積以0.1mL/cm2的量加入一抗溶液，搖床上平緩搖動，于室溫孵育1-2小時或4過夜。p回收一抗溶液，用TBST漂洗膜3次，每次10min。p加入用封閉液配制的二抗，搖床上緩慢搖動，于室溫孵育1-2小時或4過夜。 p回收一抗溶液，用TBST漂洗膜3次，每次10m

14、in。p最后用TBS漂洗膜2次，每次10min。 Western Blot辣根過氧化物酶法（HRP）堿性磷酸酶法（AP）化學(xué)發(fā)光顯色法(HRP) Western Blot膜解吸方法（膜的重復(fù)利用）膜解吸方法（膜的重復(fù)利用） p通過加熱和去污劑進行解吸通過加熱和去污劑進行解吸 原理：原理：組合使用去污劑和加熱使抗體解離，適用于任何化學(xué)發(fā)光底物系統(tǒng)。p酸解吸酸解吸 原理：原理：使用低pH改變抗體結(jié)構(gòu)從而使結(jié)合位點失活，從而將抗體與抗原分離，適用于任何化學(xué)發(fā)光底物系統(tǒng)。 Western BlotWestern Blot結(jié)果分析p目的蛋白的灰度值除以內(nèi)參的灰度值以校正誤差，所得結(jié)果代表某樣品的目的蛋白

15、相對含量。pWestern Blot結(jié)果分析軟件結(jié)果分析軟件Gel-Pro Analyzer 4 綠色版（附動畫演示教程）綠色版（附動畫演示教程）http:/ Western Blot Western Blot Western Blot Western Blot？ Western Blot轉(zhuǎn)移到膜上的蛋白很少蛋白分子量蛋白分子量 10KD10KD蛋白的等電點蛋白的等電點 9SDSSDS濃度不合適濃度不合適凝膠太厚凝膠太厚 原原因因?qū)Σ卟叩鞍追肿恿康鞍追肿恿?0KD10KD時，減時，減少轉(zhuǎn)膜時間；使用小孔徑少轉(zhuǎn)膜時間；使用小孔徑的膜的膜更換高更換高pHpH值值BufferBuffer在陰極在陰

16、極bufferbuffer中加入中加入0.005 - 0.01% SDS 0.005 - 0.01% SDS 可提可提高轉(zhuǎn)膜效率高轉(zhuǎn)膜效率延長轉(zhuǎn)膜時間延長轉(zhuǎn)膜時間 Western Blot膜沒有均勻浸濕膜沒有均勻浸濕膜或者緩沖液污染膜或者緩沖液污染封閉不充分封閉不充分抗體與封閉劑出現(xiàn)交抗體與封閉劑出現(xiàn)交叉反應(yīng)叉反應(yīng)抗體濃度過高抗體濃度過高 原原因因?qū)Σ卟咿D(zhuǎn)膜前用轉(zhuǎn)膜前用100%100%甲醇將膜完甲醇將膜完全浸濕全浸濕拿取膜與吸水紙時要戴手拿取膜與吸水紙時要戴手套，更換新鮮轉(zhuǎn)膜緩沖液套，更換新鮮轉(zhuǎn)膜緩沖液檢測一抗、二抗與封閉劑檢測一抗、二抗與封閉劑是否有交叉反應(yīng)是否有交叉反應(yīng)雜交前檢測一抗、二抗的雜交前檢測一抗、二抗的工作濃度工作濃度背景太高 Western Blot雜交信號很弱抗體保存不當(dāng)抗體保存不當(dāng)抗原不充足抗原不充足膜的漂洗過度膜的漂洗過度 原原因因?qū)Σ卟呖贵w長期保存應(yīng)在抗體長期保存應(yīng)在7070，使用前做效價檢測，使用前做效價檢測增加蛋白上樣量，做已知增加蛋白上樣量，做已知標(biāo)準(zhǔn)量蛋白的對照標(biāo)準(zhǔn)量蛋白的對照減少漂洗的時間和次數(shù)減少漂洗的時間和次數(shù) Western Blot一抗不是唯一特一抗不是唯一特異的異的二抗出現(xiàn)非特異二抗出現(xiàn)非特異結(jié)合結(jié)合 原因原因?qū)Σ卟咧苽鋯慰寺】贵w或者重新選制