-目的基因的表達(dá)第五章-黑板ppt課件

1、第五章第五章 外源基因的表達(dá)外源基因的表達(dá)the expression of foreign gene)第一節(jié)第一節(jié) 外源基因的表達(dá)體系外源基因的表達(dá)體系原核生物轉(zhuǎn)錄過程RNA聚合酶亞基發(fā)現(xiàn)啟動子序列與-35區(qū)結(jié)合 進一步與-10區(qū)結(jié)合 解鏈17bp)使模板暴露 因子識別并起始啟動位點 pppA/pppG 因子解離，NusA與RNA聚合酶結(jié)合放松 RNA聚合酶向前滑動，繼續(xù)解12bp鏈 終止依賴因子、不依賴 因子一、基因表達(dá)的機制外源基因的起始轉(zhuǎn)錄：可調(diào)控的啟動子外源基因的起始轉(zhuǎn)錄：可調(diào)控的啟動子mRNA的延伸與穩(wěn)定性的延伸與穩(wěn)定性外源基因外源基因mRNA的有效翻譯的有效翻譯起始密碼子、起始密

2、碼子、SD序列、序列、 SD序列與起序列與起始密碼子之間的間隔為始密碼子之間的間隔為39個堿基個堿基表達(dá)蛋白在細(xì)胞中的穩(wěn)定表達(dá)蛋白在細(xì)胞中的穩(wěn)定目的基因沉默目的基因沉默(位置效應(yīng)的基因沉默、轉(zhuǎn)錄程度的基因位置效應(yīng)的基因沉默、轉(zhuǎn)錄程度的基因沉默、轉(zhuǎn)錄后程度的基因沉默沉默、轉(zhuǎn)錄后程度的基因沉默 二、外源基因表達(dá)系統(tǒng)概念：概念： 目的基因與表達(dá)載體重組后，導(dǎo)入適宜的受體目的基因與表達(dá)載體重組后，導(dǎo)入適宜的受體細(xì)胞，并在其中有效表達(dá)，產(chǎn)生目的基因產(chǎn)物。細(xì)胞，并在其中有效表達(dá)，產(chǎn)生目的基因產(chǎn)物。原核生物基因表達(dá)系統(tǒng)原核生物基因表達(dá)系統(tǒng)(大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)、芽孢桿菌表達(dá)系統(tǒng)、鏈霉大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)、芽孢桿菌表

3、達(dá)系統(tǒng)、鏈霉菌表達(dá)系統(tǒng)和藍(lán)藻表達(dá)系統(tǒng)菌表達(dá)系統(tǒng)和藍(lán)藻表達(dá)系統(tǒng)真核生物基因表達(dá)系統(tǒng)真核生物基因表達(dá)系統(tǒng)原核基因表達(dá)系統(tǒng)原核基因表達(dá)系統(tǒng)生長快，可經(jīng)過發(fā)酵獲得大量基因表達(dá)產(chǎn)物生長快，可經(jīng)過發(fā)酵獲得大量基因表達(dá)產(chǎn)物基因組構(gòu)造簡單，便于基因操作與分析基因組構(gòu)造簡單，便于基因操作與分析多數(shù)原核生物細(xì)胞內(nèi)含有質(zhì)?；蚴删w，便于構(gòu)建多數(shù)原核生物細(xì)胞內(nèi)含有質(zhì)?；蚴删w，便于構(gòu)建相應(yīng)的表達(dá)載體相應(yīng)的表達(dá)載體生理代謝途徑及基因表達(dá)調(diào)控機制比較清楚生理代謝途徑及基因表達(dá)調(diào)控機制比較清楚不具備真核生物的蛋白質(zhì)加工系統(tǒng)，表達(dá)產(chǎn)物無特不具備真核生物的蛋白質(zhì)加工系統(tǒng)，表達(dá)產(chǎn)物無特定的空間構(gòu)象定的空間構(gòu)象內(nèi)源蛋白酶會降解表達(dá)

4、的外源蛋白，呵斥表達(dá)產(chǎn)物內(nèi)源蛋白酶會降解表達(dá)的外源蛋白，呵斥表達(dá)產(chǎn)物的不穩(wěn)定性的不穩(wěn)定性大腸桿菌基因表達(dá)載體復(fù)制子復(fù)制子啟動子和終止子啟動子和終止子核糖體結(jié)合位點核糖體結(jié)合位點密碼子簡并密碼子的選擇密碼子簡并密碼子的選擇選擇標(biāo)志抗生素抗性基因選擇標(biāo)志抗生素抗性基因三、制約目的基因表達(dá)的要素1、外源基因能否插入在正確的閱讀框架、外源基因能否插入在正確的閱讀框架2、目的基因的有效轉(zhuǎn)錄如啟動子的作用、目的基因的有效轉(zhuǎn)錄如啟動子的作用3、mRNA的有效翻譯如的有效翻譯如SD序列等作用序列等作用4、轉(zhuǎn)錄后，翻譯后的適當(dāng)?shù)男揎椇图庸み^程、轉(zhuǎn)錄后，翻譯后的適當(dāng)?shù)男揎椇图庸み^程 四、閱讀框架四、閱讀框架 在在

5、DNA鏈上鏈上,由蛋白質(zhì)合成的起始密碼開場由蛋白質(zhì)合成的起始密碼開場,到終止密碼子為止的一個延續(xù)編碼序列到終止密碼子為止的一個延續(xù)編碼序列,叫做叫做一個開放閱讀框架一個開放閱讀框架open reading frame, ORF五、啟動子與轉(zhuǎn)錄的影響五、啟動子與轉(zhuǎn)錄的影響 1、在原核細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄過程中，決議外源基、在原核細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄過程中，決議外源基因表達(dá)的關(guān)鍵要素是外源基因必需在載體因表達(dá)的關(guān)鍵要素是外源基因必需在載體DNA的啟動子控制之下，而且啟動子又能被的啟動子控制之下，而且啟動子又能被宿主細(xì)胞中的宿主細(xì)胞中的RNA聚合酶有效識別。聚合酶有效識別。 選擇填空2、啟動子、啟動子DNA序列中兩個高

6、度保守區(qū)域是必序列中兩個高度保守區(qū)域是必需的需的-10區(qū)與區(qū)與-35區(qū)，沒有這兩個高度保守區(qū)，沒有這兩個高度保守區(qū)域，就沒有啟動作用。但是啟動子區(qū)域，就沒有啟動作用。但是啟動子DNA序序列中保守性較差部分和兩個保守區(qū)之間的核列中保守性較差部分和兩個保守區(qū)之間的核苷酸數(shù)量也影響啟動子的功能苷酸數(shù)量也影響啟動子的功能 。LacUv5 trp啟動子啟動子 trp-lacUv5啟動子啟動子 1原核生物：大約在原核生物：大約在RNA合成起點之前的合成起點之前的10bp和和35bp處，由兩個由處，由兩個由6個核苷酸組成的共個核苷酸組成的共有序列有序列 -10區(qū)區(qū) ：TATAATthe pribnow bo

7、x -35區(qū)區(qū) ：TTGACA2 真核生物真核生物 -30區(qū)：區(qū)：TATA盒：盒：TATAAAA -80區(qū)：區(qū)：CAAT盒：盒：GGTCAATCT 六、翻譯過程對表達(dá)的影響 1、SD序列與序列與rRNA的的16s亞基亞基3末端序列之末端序列之間的互補程度，是影響翻譯效率的主要要素。間的互補程度，是影響翻譯效率的主要要素。2、起始密碼、起始密碼AUG與與SD序列之間的間隔以及序列之間的間隔以及SD序列的核苷酸組成也影響翻譯才干。序列的核苷酸組成也影響翻譯才干。3、起始密碼之后的一個核苷酸對、起始密碼之后的一個核苷酸對mRNA與核與核糖體的結(jié)合也有影響。糖體的結(jié)合也有影響。4、基因末端的轉(zhuǎn)錄終止區(qū)

8、的影響、基因末端的轉(zhuǎn)錄終止區(qū)的影響 第二節(jié)第二節(jié) 外源基因在原核細(xì)胞外源基因在原核細(xì)胞 中的表達(dá)中的表達(dá) 一、基因工程的表達(dá)系統(tǒng)一、基因工程的表達(dá)系統(tǒng) 1、克隆原核基因在原核細(xì)胞中表達(dá)、克隆原核基因在原核細(xì)胞中表達(dá)2、克隆真核基因在原核細(xì)胞中表達(dá)、克隆真核基因在原核細(xì)胞中表達(dá)3、克隆原核基因在真核細(xì)胞中表達(dá)、克隆原核基因在真核細(xì)胞中表達(dá)4、克隆真核基因在真核細(xì)胞中表達(dá)、克隆真核基因在真核細(xì)胞中表達(dá)原核表達(dá)系統(tǒng)：原核表達(dá)系統(tǒng)：大腸桿菌系統(tǒng)大腸桿菌系統(tǒng)枯草桿菌系統(tǒng)枯草桿菌系統(tǒng) 真核表達(dá)系統(tǒng)：真核表達(dá)系統(tǒng)：低等真核細(xì)胞酵母系統(tǒng)低等真核細(xì)胞酵母系統(tǒng)哺乳動物細(xì)胞系統(tǒng)哺乳動物細(xì)胞系統(tǒng)昆蟲細(xì)胞系統(tǒng)昆蟲細(xì)胞系

9、統(tǒng) 真核基因在原核細(xì)胞中表達(dá)的困難1、細(xì)菌、細(xì)菌RNA聚合酶不能辨仔細(xì)核基因的啟動子。聚合酶不能辨仔細(xì)核基因的啟動子。2、從真核基因轉(zhuǎn)錄的、從真核基因轉(zhuǎn)錄的mRNA缺乏缺乏SD序列，不能結(jié)合序列，不能結(jié)合到核糖體蛋白上。到核糖體蛋白上。3、真核基因普通含有內(nèi)含子，而原核細(xì)胞缺乏真核、真核基因普通含有內(nèi)含子，而原核細(xì)胞缺乏真核細(xì)胞轉(zhuǎn)錄后加工系統(tǒng)，細(xì)胞轉(zhuǎn)錄后加工系統(tǒng)，mRNA中的內(nèi)含子不能切除，中的內(nèi)含子不能切除，成熟的成熟的mRNA不能構(gòu)成，不能表達(dá)真核蛋白質(zhì)。不能構(gòu)成，不能表達(dá)真核蛋白質(zhì)。4、表達(dá)的真核蛋白質(zhì)在原核細(xì)胞中不穩(wěn)定，容易被、表達(dá)的真核蛋白質(zhì)在原核細(xì)胞中不穩(wěn)定，容易被細(xì)菌蛋白酶破壞細(xì)

10、菌蛋白酶破壞 2 起始密碼子的正確選讀起始密碼子的正確選讀 噬菌體蛋白噬菌體蛋白A： 5mRNA GUGAGUAUAAGAGGACAUAUGCCU 3 rRNA 5 ACCUCCUA 3 Q噬菌體復(fù)制酶：噬菌體復(fù)制酶： 5 mRNA UUACUAAGGAUGAAAUGCAUGUCU3 rRNA 5 ACCUCCUA 3二、原核系統(tǒng)高效表達(dá)外源真核基因 的措施 1、將真核基因克隆到一個強大的原核啟動子和、將真核基因克隆到一個強大的原核啟動子和SD 序列的下序列的下游游2、從真核細(xì)胞中分別、從真核細(xì)胞中分別mRNA并反轉(zhuǎn)錄成并反轉(zhuǎn)錄成cDNA3、將真核基因插在幾個原核密碼之后，經(jīng)過翻譯，經(jīng)過翻譯、

11、將真核基因插在幾個原核密碼之后，經(jīng)過翻譯，經(jīng)過翻譯得到原核多肽和真核基因產(chǎn)物連在一同的交融蛋白。得到原核多肽和真核基因產(chǎn)物連在一同的交融蛋白。 牛的凝血因子牛的凝血因子Xa能識別特異的能識別特異的4肽順序：肽順序：Ile異亮異亮-Glu谷谷-Gly甘甘-Ary精精 原核多肽原核多肽-Ile-Glu-Gly-Arg-真核蛋白。用真核蛋白。用Xa水解，分別出真水解，分別出真核蛋白核蛋白 4、減輕宿主細(xì)胞的代謝負(fù)荷，提高外源基因的表達(dá)程度 將細(xì)胞的生長和外源基因的表達(dá)分開成為將細(xì)胞的生長和外源基因的表達(dá)分開成為兩個階段，以便減低宿主細(xì)胞的代謝負(fù)荷兩個階段，以便減低宿主細(xì)胞的代謝負(fù)荷 三、基因表達(dá)產(chǎn)物

12、的檢測與分別純化三、基因表達(dá)產(chǎn)物的檢測與分別純化1、基因表達(dá)產(chǎn)物的檢測1.1 外源基因轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的檢測 Northern印跡雜交、RT PCR1.2 報告基因的酶法檢測 氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶基因(CAT) 葡萄糖苷酸酶基因等(GUS)1.3 表達(dá)產(chǎn)物生物學(xué)活性檢測2、基因表達(dá)產(chǎn)物的分別純化細(xì)胞破碎細(xì)胞破碎 離心離心 沉淀法、超濾濃沉淀法、超濾濃縮法分別特異表達(dá)蛋白縮法分別特異表達(dá)蛋白 進一步分別柱進一步分別柱層析層析 聚丙烯凝膠電泳聚丙烯凝膠電泳mRNA差別顯示技術(shù)及其運用差別顯示技術(shù)及其運用一、一、mRNA差別顯示技術(shù)概述差別顯示技術(shù)概述n高等生物大約有高等生物大約有3 3萬萬55萬個基因萬個基因

13、n在任一細(xì)胞表達(dá)的基因約占總數(shù)的在任一細(xì)胞表達(dá)的基因約占總數(shù)的15%15%n哪些基因在何生長發(fā)育階段以及在何種生理形哪些基因在何生長發(fā)育階段以及在何種生理形狀下表達(dá)，決議了整個生命過程。狀下表達(dá)，決議了整個生命過程。n比較同一類細(xì)胞在不同生長發(fā)育階段的基因表比較同一類細(xì)胞在不同生長發(fā)育階段的基因表達(dá)的差別，是克隆特異表達(dá)基因的方法。達(dá)的差別，是克隆特異表達(dá)基因的方法。一、一、mRNA差別顯示技術(shù)概述差別顯示技術(shù)概述n1992年年nLiang 、PardeenmRNA差別顯示技術(shù)差別顯示技術(shù)ndifferential display reverse transcripion PCR，DDRTPC

14、Rn動物、人類的癌癥、心臟病、糖尿病動物、人類的癌癥、心臟病、糖尿病n植物胚胎發(fā)育、無交融生殖、植物抗逆與抗病性植物胚胎發(fā)育、無交融生殖、植物抗逆與抗病性二、二、DDRT技術(shù)的原理技術(shù)的原理一錨定一錨定PCR錨定錨定PCRanchored PCR是是PCR技術(shù)的一種改良，普通的技術(shù)的一種改良，普通的PCR實驗實驗中需求知道目的基因兩端的序列，中需求知道目的基因兩端的序列，而錨定而錨定PCR技術(shù)不需求。技術(shù)不需求。所謂的所謂的“錨定就是指一端曾經(jīng)定死錨定就是指一端曾經(jīng)定死了，另一端經(jīng)過人工合成引物來定，了，另一端經(jīng)過人工合成引物來定，這就為許多我們對不清楚其這就為許多我們對不清楚其5端區(qū)端區(qū)域或

15、是域或是3端區(qū)域的端區(qū)域的RNA的分析找到的分析找到了一條良好的途徑。了一條良好的途徑。二二DDRT技術(shù)道路技術(shù)道路 提取提取B組織組織RNA提取提取A組織組織RNA錨定引物錨定引物GT15A,GT15G,GT15CGT15A,GT15G,GT15C反轉(zhuǎn)錄反轉(zhuǎn)錄錨定引物錨定引物GT15A,GT15G,GT15CGT15A,GT15G,GT15C反轉(zhuǎn)錄反轉(zhuǎn)錄總總RNA完好性鑒定完好性鑒定總總RNA完好性鑒定完好性鑒定獲得獲得cDNA第一鏈第一鏈獲得獲得cDNA第一鏈第一鏈隨機引物擴增獲得隨機引物擴增獲得cDNAcDNA第二鏈第二鏈隨機引物擴增獲得隨機引物擴增獲得cDNAcDNA第二鏈第二鏈采用隨

16、即引物和錨定引物采用隨即引物和錨定引物進展進展PCR擴增擴增采用隨即引物和錨定引物采用隨即引物和錨定引物進展進展PCR擴增擴增擴增產(chǎn)物進展凝膠電泳分析擴增產(chǎn)物進展凝膠電泳分析處置 對照將差別條帶切出并進展回收將差別條帶切出并進展回收重新用一樣的錨定引物和隨即引物進展重新用一樣的錨定引物和隨即引物進展PCR擴增擴增Northern雜交，雜交，Southern雜交確定差別條帶的真實性雜交確定差別條帶的真實性克隆進入質(zhì)粒載體克隆進入質(zhì)粒載體測序、進入測序、進入GeneBank序列分析序列分析三、三、mRNA差別顯示技術(shù)的優(yōu)缺陷差別顯示技術(shù)的優(yōu)缺陷n1、優(yōu)點、優(yōu)點n 具有簡便、靈敏、具有簡便、靈敏、R

17、NA用量少、效率高用量少、效率高n 可同時比較多種給定生理形狀或不同發(fā)育階段可同時比較多種給定生理形狀或不同發(fā)育階段的的n 細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞內(nèi)mRNAn2、缺陷、缺陷n 1所得特異性所得特異性cDNA片段假陽性的比例高，片段假陽性的比例高，75%n 緣由：總緣由：總RNA有有DNA污染污染n 凝膠中有重疊帶凝膠中有重疊帶n 特異特異cDNA片段太短，得不到雜交信片段太短，得不到雜交信號號三、三、mRNA差別顯示技術(shù)的優(yōu)缺陷差別顯示技術(shù)的優(yōu)缺陷n2、缺陷、缺陷n 2cDNA產(chǎn)物的質(zhì)量往往較低，在凝膠產(chǎn)物的質(zhì)量往往較低，在凝膠上上 呈現(xiàn)呈現(xiàn)smear形狀形狀n 3得到的特異性的得到的特異性的cDNA 片

18、段非翻譯序片段非翻譯序列列n 利用利用GeneBank進展數(shù)據(jù)分析不利進展數(shù)據(jù)分析不利四、四、mRNA差別顯示技術(shù)的運用差別顯示技術(shù)的運用n1、研討植物不同分化發(fā)育階段的基因表達(dá)差別、研討植物不同分化發(fā)育階段的基因表達(dá)差別n2、基因的鑒定與克隆、基因的鑒定與克隆n3、研討激素對植物發(fā)育的影響、研討激素對植物發(fā)育的影響n4、植物抗逆性機理的研討、植物抗逆性機理的研討n5、在營養(yǎng)學(xué)中的運用、在營養(yǎng)學(xué)中的運用n6、在腫瘤研討中的運用、在腫瘤研討中的運用n 四、四、mRNA差別顯示技術(shù)的運用差別顯示技術(shù)的運用n研討植物不同分化發(fā)育階段的基因表達(dá)差別研討植物不同分化發(fā)育階段的基因表達(dá)差別nVille C

19、alzada和和Nuccio 狼尾草的基因表達(dá)狼尾草的基因表達(dá)n有性生殖和無交融生殖的子房有性生殖和無交融生殖的子房n2個錨定引物和個錨定引物和20個個10堿基隨即引物共顯示堿基隨即引物共顯示出出2268個個cDNA片段，其中有片段，其中有3個基因片段能個基因片段能在有性生殖的子房中特異表達(dá)。在有性生殖的子房中特異表達(dá)。四、四、mRNA差別顯示技術(shù)的運用差別顯示技術(shù)的運用n在營養(yǎng)學(xué)中的運用在營養(yǎng)學(xué)中的運用n 營養(yǎng)物質(zhì)的作用與基因調(diào)空有關(guān)，當(dāng)某營養(yǎng)物質(zhì)的作用與基因調(diào)空有關(guān)，當(dāng)某種營養(yǎng)缺乏或過多時，在分子程度上就種營養(yǎng)缺乏或過多時，在分子程度上就表現(xiàn)為某個或某些基因的開啟、封鎖或表現(xiàn)為某個或某些基

20、因的開啟、封鎖或表達(dá)量的變化表達(dá)量的變化銅在營養(yǎng)學(xué)中的作用銅在營養(yǎng)學(xué)中的作用缺銅缺銅6周的大鼠肝臟周的大鼠肝臟mRNA正常大鼠肝臟正常大鼠肝臟mRNA10個個cDNA片段的差別片段的差別表達(dá)量是對照的表達(dá)量是對照的1.2倍倍新的未知基因新的未知基因五、五、mRNA差別顯示在甜菜無交融生差別顯示在甜菜無交融生殖基因克隆研討中的運用殖基因克隆研討中的運用n被子植物無交融生殖使其子代承繼了母本一切被子植物無交融生殖使其子代承繼了母本一切的遺傳特性，并構(gòu)成遺傳上穩(wěn)定的，可由種子的遺傳特性，并構(gòu)成遺傳上穩(wěn)定的，可由種子繁衍的無性系。由此可以保管優(yōu)良的基因型，繁衍的無性系。由此可以保管優(yōu)良的基因型，固定雜

21、種優(yōu)勢，并能夠使一些重要的作物實現(xiàn)固定雜種優(yōu)勢，并能夠使一些重要的作物實現(xiàn)“一系法育種；假設(shè)無交融生殖被很好地利一系法育種；假設(shè)無交融生殖被很好地利用，它將是二十世紀(jì)六十年代用，它將是二十世紀(jì)六十年代“綠色革命之綠色革命之后的又一次農(nóng)業(yè)革命后的又一次農(nóng)業(yè)革命無性生殖革命。無性生殖革命。 五、五、mRNA差別顯示在甜菜無交融生差別顯示在甜菜無交融生殖基因克隆研討中的運用殖基因克隆研討中的運用 植物界中，無交融生殖廣泛存在。我們經(jīng)過栽培甜菜Beta vulgaris L.與白花甜菜B.corollifora Zoss遠(yuǎn)緣雜交獲得了真實雜種，經(jīng)遺傳回交獲得了帶有白花甜菜染色體的完好單體附加系系列，并

22、且經(jīng)過單體附加系傳送研討，挑選出近100%高頻率傳送的單體附加系M14品系。經(jīng)過標(biāo)志基因雜交、傳送遺傳形狀察看、胚胎學(xué)及分子生物學(xué)鑒定它們是兼性無交融生殖的,2019年3月經(jīng)專家鑒定為無交融生殖品系；同時無交融生殖基因曾經(jīng)定位在這條附加的白花甜菜染色體上，因此M14品系是克隆無交融生殖基因的極為難得的資料。 甜菜單體附加系甜菜單體附加系M14M14品系品系 ( VV+1C, 2n = 19 = 18+1, ( VV+1C, 2n = 19 = 18+1, 箭頭所指為附加的白花甜菜箭頭所指為附加的白花甜菜染色體染色體 ) )五、五、mRNA差別顯示在甜菜無交融生差別顯示在甜菜無交融生殖基因克隆研

23、討中的運用殖基因克隆研討中的運用n采用采用mRNA差別顯示技術(shù)比較甜菜無交融生殖差別顯示技術(shù)比較甜菜無交融生殖系及正常進展有性生殖的二倍體栽培植株在無系及正常進展有性生殖的二倍體栽培植株在無交融生殖基因表達(dá)的三個關(guān)鍵時期，即大孢子交融生殖基因表達(dá)的三個關(guān)鍵時期，即大孢子母細(xì)胞減數(shù)分裂期、助細(xì)胞提早退化期、次生母細(xì)胞減數(shù)分裂期、助細(xì)胞提早退化期、次生核自行分裂期核自行分裂期mRNA的差別，是進展克隆無交的差別，是進展克隆無交融生殖相關(guān)基因的比較有效的方法融生殖相關(guān)基因的比較有效的方法 五、五、mRNA差別顯示在甜菜無交融生差別顯示在甜菜無交融生殖基因克隆研討中的運用殖基因克隆研討中的運用n對總對總RNA進展逆轉(zhuǎn)錄反響，合成進展逆轉(zhuǎn)錄反響，合成cDNA第一鏈。第一鏈。nPCR反響擴增：反響擴增：n cDNA第一鏈第一鏈 1uln 2.5mM dNTP 1.2ln 25